Akt、p-Akt 及Slug 在三陰性乳腺癌中的表達及意義

王士娜，唐瑋，金丹，張君杰，孫潔，程新宇，王翠芳*

（1 沈陽醫(yī)學院附屬中心醫(yī)院病理科，沈陽 110024；2 沈陽醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學院研究生院，沈陽110034）

目前，乳腺癌屬高發(fā)的女性惡性腫瘤之一，其死亡率僅次于肺癌，并且，乳腺癌也屬于高度異質(zhì)性腫瘤，這種異質(zhì)性可以體現(xiàn)在乳腺癌的組織病理分型上，2013 年，St Gallen 國際乳腺癌會議再次確認乳腺癌的IHC 分類法，將乳腺癌分為：Luminal A型、Luminal B 型、HER2 過表達型、基底樣型，其中基底樣型即為通常我們所說的三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）[1]。三陰性乳腺癌因其特殊的分子特征、且對內(nèi)分泌治療不敏感，屬侵襲性最強、預(yù)后最差的乳腺癌亞型之一，因此，探尋三陰性乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移過程中的調(diào)控靶點，明確其發(fā)生發(fā)展的分子機制具有深遠而重要的意義。

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是惡性腫瘤形成過程中的一個關(guān)鍵事件，Shymala 等[2]通過分析乳腺癌患者的體內(nèi)循環(huán)腫瘤細胞，描述了EMT 形成的特點，因而證實了EMT 在乳腺癌血液播散中發(fā)揮了作用的事實。EMT 的發(fā)生由轉(zhuǎn)錄抑制因子Snail 家族介導，已有研究表明，Snail 家族成員Slug 在惡性腫瘤EMT 的過程中發(fā)揮重要作用[3]。此外，研究表明，多條信號通路與EMT 的形成相關(guān)，PI3K/Akt 信號通路是關(guān)鍵參與通路之一。

目前關(guān)于Akt、p-Akt 及Slug 在三陰性乳腺癌中共同作用而參與EMT 的報道較少，因此，本研究通過免疫組織化學方法從組織水平檢測 PI3K/Akt 通路中有關(guān)蛋白Akt、p-Akt 及參與EMT 的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Slug 在三陰性乳腺癌中的表達情況及其與三陰性乳腺癌臨床病理特征間的關(guān)系，進一步探討PI3K/Akt 信號通路與EMT 在三陰性乳腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機制中的相關(guān)性。

材料與方法

1 標本來源

選取沈陽醫(yī)學院附屬中心醫(yī)院病理科2012 年1月至2018 年12 月期間經(jīng)手術(shù)切除證實為三陰性乳腺癌的蠟塊標本60 例，取證實為正常乳腺組織的癌旁標本60 例作為對照組，所有病例均經(jīng)病理科醫(yī)師確診?；颊吣挲g27～79 歲，中位年齡53 歲；腫瘤最大徑＜2cm 者10 例，2cm～5cm 者45 例，＞5cm 者5例；淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移者26 例，無轉(zhuǎn)移者34 例；組織學分級Ⅰ級9 例、Ⅱ級38 例，Ⅲ級13 例。所選病例術(shù)前均未接受過放化療。

2 試劑

兔抗Akt(pan)(C67E7)抗體、兔抗p-Akt(Ser473)抗體購自Cell Signaling Technology、小鼠抗Slug（sc166476）抗體購自Santa Cruz Biotechnology，相應(yīng)過氧化物酶標羊抗兔或小鼠IgG、粉劑型磷酸鹽緩沖液（PBS）、內(nèi)源性過氧化物酶、DAB 染色液（聚合物法）均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

3 免疫組織化學染色

所用標本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定、石蠟包埋，制成4μm 厚切片，EnVision 兩步法免疫組織化學染色：二甲苯脫蠟40min，梯度降乙醇水化，檸檬酸鹽抗原修復液（pH6.0）中高溫高壓抗原修復2min，0.01mol/L PBS 沖 洗3min×3 次； 3% H2O2室溫孵育20min 阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，PBS 沖洗3min×3 次；分別加入抗Akt 、p-Akt 及Slug 一抗（稀釋濃度均為1:200 )，4℃冰箱內(nèi)過夜，PBS 清洗次×3min；加入二抗，室溫孵15min，PBS 沖洗3 次×3min；鏡下DAB 顯色后自來水沖洗，蘇木精復染，自來水沖洗反藍，之后放入梯度乙醇內(nèi)脫水、二甲苯透明、中性樹脂封固。

4 結(jié)果判定

Akt、p-Akt 均定位于細胞質(zhì)，結(jié)果判斷采用陽性細胞半定量法[4]，以陽性細胞比例和染色強度評定陽性表達。首先按陽性細胞占整個瘤細胞的百分比評分，＜5%為0 分，5%～25%為1 分，26%～50%為2 分，51%～75%為3 分，＞75%為4 分；再根據(jù)染色強度評分，不著色為0 分，淡棕黃色為1 分，棕黃色為2 分，深棕紅色為3 分。兩項得分相加，≤2 分為陰性，＞2 分為陽性。由于 Slug 為核轉(zhuǎn)錄因子，本實驗以胞核伴或不伴胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色染色即判定為陽性[5]。

5 統(tǒng)計學分析

采用統(tǒng)計學軟件SPSS 22.0 針對研究對象的資料建立數(shù)據(jù)庫，計數(shù)資料通過卡方檢驗比較分析，P＜0.05，差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 Akt、p-Akt、Slug 在三陰性乳腺癌中的表達特征

Akt 蛋白的陽性染色呈黃色至棕黃色，主要定位于癌細胞胞質(zhì)，呈彌漫性分布（圖1）。p-Akt 的陽性染色大部分僅定位于癌細胞胞質(zhì)，少部分定位于胞核，未見單獨胞核著色，為淡黃至棕褐色染色（圖2）。Slug 為核轉(zhuǎn)錄因子，本實驗以胞核伴或不伴胞質(zhì)染色判定為陽性（圖3）。三陰性乳腺癌中Akt、p-Akt、Slug 蛋白表達陽性率顯著高于癌旁組織（表1）。

圖 1 Akt、p-Akt、Slug 在三陰性乳腺癌中表達的免疫組織化學（EnVision 兩步法）檢測。A，Akt；B，p-Akt；C，Slug；比例尺，20μmFig. 1 Immunohistochemical examination (EnVision two step method) for expression of Akt, phospho-Akt and Slug in triple-negative breast cancer tissues. A, Akt； B, p-Akt； C, Slug； scale bar, 20μm

2 Akt、p-Akt、Slug 在三陰性乳腺癌中的表達和臨床病理指標間的關(guān)系

Akt、p-Akt 及Slug 在三陰性乳腺癌中的陽性表達率分別為76.67%、41.67%和56.67%，顯著高于癌旁組織中Akt（6.67%）、p-Akt（0%）和Slug（0%）的表達率；三陰性乳腺癌中Akt、p-Akt 與Slug 的表達與患者年齡有關(guān)，在年齡≤50 歲患者中，Akt 的陽性表達率為93.94%，p-Akt 的陽性表達率為60.61%，Slug 的陽性表達率為69.70%，而年齡＞50 歲組中Akt 的陽性表達率為55.56%，p-Akt 的陽性表達率為18.52%，Slug 的陽性表達率為40.74%，年齡≤50 歲患者中，Akt、p-Akt 和Slug 的表達均顯著高于年齡＞50 歲患者；同時，Akt、p-Akt 與Slug的表達與腫瘤組織學分級有關(guān)，Akt、p-Akt 與Slug在組織學分級為Ⅲ級的三陰性乳腺癌中的表達率分別為69.23%、38.46%及100%，而在組織學分級Ⅱ級的三陰性乳腺癌中的陽性表達率分別為89.47%、52.63%及42.11%，在組織學分級Ⅰ級的癌中陽性表達率分別為33.33%、0 及55.56%，即隨著乳腺癌分級的增加，Akt、p-Akt 和Slug 的表達呈明顯增高趨勢；此外，根據(jù)腫瘤大小進行分組，在腫瘤大?。?cm 組，Akt、Slug 的表達率均為30%，在腫瘤大小2～5cm 組中，Akt、Slug 的表達率分別為86.67%及57.78%，在＞5cm 組中，Akt、Slug 的表達率分別為80%及100%，即Akt、Slug 的表達隨著腫瘤大小的增加而表達顯著增高；在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的三陰性乳腺癌中，p-Akt 的表達率為69.23%，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中其表達率為20.59%，p-Akt 的表達隨著三乳腺癌有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移而增高（表2）。

表1 Akt、p-Akt、Slug 在三陰性乳腺癌與癌旁組織中的表達Tab.1 Expression of Akt, p-Akt and Slug in triple-negative breast cancer and adjacent normal tissue

表2 Akt、p-Akt、Slug 在三陰性乳腺癌中的表達和臨床病理指標間的關(guān)系Tab.2 Association of Akt-, p-Akt-, Slug- expression with clinicopathological features of triple-negative breast cancer

3 三陰性乳腺癌中Slug 與Akt 和p-Akt 表達呈正相關(guān)

統(tǒng)計顯示，Akt陽性表達組中Slug的陽性表達為65.22%（30/46），Akt 陰性表達組中Slug 的陽性表達為28.57%（4/14）；p-Akt 陽性表達組中Slug 的陽性表達為84%（21/25），p-Akt 陰性表達組中Slug的陽性表達為37.14%（13/35）。經(jīng)直線相關(guān)分析，Slug 與Akt 在三陰性乳腺癌中呈正相關(guān)（r=0.313，P=0.015）；Slug 與p-Akt 在三陰性乳腺癌中也呈正相關(guān)（r=0.466，P=0.000）(表3)。

表3 在三陰性乳腺癌中Slug 與Akt 和p-Akt 表達的相關(guān)性分析Tab. 3 Correlation between expression of Slug with expression of Akt and p-Akt in triple-negative breast cancer

討 論

三陰性乳腺癌是指雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）和人類表皮生長因子受體（HER2）表達均缺失的乳腺癌。目前研究認為，三陰性乳腺癌表達EMT 相關(guān)分子高于其它類型乳腺癌[6]。許多信號通路已經(jīng)被證實與EMT 過程的發(fā)生相關(guān)，PI3KAkt 即是重要的激活通路之一。在該通路中，Akt 是一種原癌基因，為含有 480 個氨基酸的蛋白激酶，位于其 C 末端和 N 末端的催化位點可被PI3K 和PDK 磷酸化，而產(chǎn)生活化產(chǎn)物——磷酸化的Akt（p-Akt），p-Akt 再參與到各種細胞內(nèi)信號途徑中[7]，如在非小細胞肺癌中[8]，Akt 與p-Akt 表達的陽性率均顯著高于非腫瘤性肺組織，且二者的表達呈明顯正相關(guān)，提示非小細胞肺癌的發(fā)生與Akt、p-Akt 有關(guān) 。在食管鱗狀細胞癌[9]及結(jié)直腸癌[10]中同樣檢測出Akt、p-Akt 表達的正相關(guān)性。研究者證實，在乳腺癌中Akt 普遍存在高表達，且其信號通路高度活化[11]。我們的研究顯示，在三陰性乳腺癌中，Akt的表達率顯著高于癌旁乳腺組織。Shinobu 等［12］發(fā)現(xiàn)在三陰性乳腺癌細胞系中，p-Akt 水平較其他亞型的乳腺癌顯著升高， 提示三陰性乳腺癌中 Akt 被明顯激活為p-Akt，并啟動下游相關(guān)促進腫瘤發(fā)生發(fā)展的信號通路；Benesch 等[13]檢測出p-Akt 的陽性率為58%，且認為p-Akt 的高表達與患者生存期縮短相關(guān)；崔素萍[14]等在浸潤性乳腺癌組織檢測 p-Akt表達水平為38.6%，而在導管原位癌中的陽性表達率為0，浸潤性導管癌的表達率明顯高于導管原位癌。我們的研究顯示，p-Akt 在60 例三陰性乳腺癌中的陽性表達率顯著高于正常乳腺組織。同時，在年齡≤50 歲患者中，Akt 的陽性表達率顯著高于年齡＞50 歲組，這與三陰性乳腺癌好發(fā)于年輕患者有關(guān)；Akt、p-Akt 的表達隨著三陰性乳腺癌組織學分級增加而顯著提高，這提示了Akt 及p-Akt 可能與三陰性乳腺癌具有較高的侵襲性相關(guān)，此外，我們的數(shù)據(jù)顯示，p-Akt 的表達在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的三陰性乳腺癌中顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的三陰性乳腺癌，這提示Akt 及p-Akt 信號通路可能還參與了三陰性乳腺癌的轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后。

近年來，Slug 促進惡性腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移的作用受到廣泛關(guān)注。因其含有鋅指結(jié)構(gòu)，可直接抑制CDH1啟動子上的E-boxs 序列轉(zhuǎn)錄而參與和促進EMT 過程，從而促進癌細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移等過程[15]。在前列腺癌[16]中的研究發(fā)現(xiàn)，ERK 信號通路的激活而使Slug 表達升高，進而促進前列腺癌的浸潤轉(zhuǎn)移；在肝癌中[17]，Slug 的過表達與肝細胞癌的高度侵襲性相關(guān)；在乳腺癌中，Storci 等［18］發(fā)現(xiàn)，Slug 在乳腺癌中過表達，且以基底細胞樣表型高表達最為明顯 。馮迪等[19]的研究顯示，Slug 蛋白在基底細胞樣乳腺癌中的表達水平明顯高于正常乳腺組織，提示Slug 高表達與基底細胞樣乳腺癌相關(guān)。我們的檢測結(jié)果顯示，Slug 在三陰性乳腺癌中的陽性表達率明顯高于正常乳腺組織，且Slug 在年齡≤50 歲患者中的表達明顯高于年齡＞50 歲組，同時，Slug 的表達隨腫瘤組織學分級增加而顯著提高；此外，Slug 的表達與隨著三陰性乳腺癌腫物大小的增加，其表達率也明顯增加，以上均說明，Slug 的表達與三陰性乳腺癌好發(fā)于年輕患者，組織學分級高提示腫瘤具有較高的侵襲性且生長較快有關(guān)，這些均與三陰性乳腺癌的臨床特點相一致，因此，我們認為，Slug 在三陰性乳腺癌的高侵襲性的發(fā)生機制中發(fā)揮了重要作用。

Carpenter 等[20]的研究發(fā)現(xiàn)了一個新的Akt-HSF1 信號軸的存在，可以調(diào)節(jié)Slug 的表達及EMT，HSF1 直接結(jié)合Slug 啟動子以誘導轉(zhuǎn)錄；此外，通過抑制PI3K/Akt 信號通路上游活化因子的表達而下調(diào)下游Akt、p-Akt 的表達，轉(zhuǎn)錄因子Slug 的表達明顯降低且癌細胞的EMT 受到抑制，因此認為HSF1可能通過調(diào)控Akt、p-Akt 所在信號通路激活轉(zhuǎn)錄抑制因子Slug，參與EMT 的發(fā)生，進而發(fā)揮其調(diào)控癌細胞的增殖分化、凋亡、轉(zhuǎn)移乃至化療耐藥等功能。我們的研究結(jié)果顯示，Akt、p-Akt 及Slug 在三陰性乳腺癌組織中均存在過表達，且經(jīng)直線相關(guān)分析，Slug 與Akt、p-Akt 在三陰性乳腺癌中的表達均呈正相關(guān)，根據(jù)Carpenter 等的報道，我們猜測：三陰性乳腺癌的高度侵襲性、易轉(zhuǎn)移性的發(fā)生，可能與Akt、p-Akt 所屬PI3K/Akt 信號通路上游某一調(diào)節(jié)因子相關(guān)，該調(diào)節(jié)因子通過激活PI3K/Akt 信號通路而活化了EMT 的重要調(diào)節(jié)因子Slug 而使癌組織的浸潤能力增強，進而賦予了三陰性乳腺癌特殊的生物學特征。

因此，Akt、p-Akt、Slug 通過促進EMT 的發(fā)生而在三陰性乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤轉(zhuǎn)移甚至化療耐藥過程中發(fā)揮作用，且協(xié)同促進三陰性乳腺癌的不良預(yù)后及化療抵抗，因而對這一通路的深入研究，將對三陰性乳腺癌的發(fā)生機制提供幫助，并對新的靶向治療提供更為有力的依據(jù)。