滑鼠蛇消化道5- 羥色胺細(xì)胞形態(tài)和分布密度的 增齡變化

劉溯源，伍亮，姚利，汪寅，楊會會，張志強(qiáng)

（1 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院動物醫(yī)學(xué)系，2 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院生態(tài)學(xué)系，3 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院水產(chǎn)養(yǎng)殖學(xué)系，合肥 230036）

爬行動物消化道含有多種內(nèi)分泌細(xì)胞，形態(tài)上區(qū)分為閉合型和開放型兩種細(xì)胞類型，可執(zhí)行內(nèi)分泌、外分泌和旁分泌等多種功能[1-3]。其中，5-羥色胺（5-hydroxytryptamine, 5-HT）細(xì)胞是研究較多的一種內(nèi)分泌細(xì)胞類型[2]，廣泛分布于爬行動物的消化道中[4-7]，但缺乏生后不同發(fā)育階段間的比較研究[2]?；笊撸≒tyas mucosus）是人工養(yǎng)殖的主要無毒蛇蛇種之一，出殼后1～2 個月是制約其存活的關(guān)鍵生活史階段[8]。本研究以室內(nèi)孵化的滑鼠蛇幼蛇為研究對象，對出殼后3d、首次完成蛻皮，以及第一次蛻皮后10d、20d、30d 和40d 的幼蛇，分別測定了消化道5-HT 細(xì)胞的形態(tài)和分布密度，旨在為生后滑鼠蛇消化功能建立提供形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)，為其規(guī)?；】叼B(yǎng)殖和改進(jìn)投喂方式提供理論基礎(chǔ)。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用不同窩滑鼠蛇幼蛇于2018 年8 月取自安徽省池州市龍井山蛇類馴養(yǎng)專業(yè)合作社，電熱油汀控溫（30±1）℃，保持相對濕度為（70%～75%）。隨機(jī)選取生后3d，7～10d（首次蛻皮），20d，30d，40d 和50d 的幼蛇，每窩每個日齡組各取1 條幼蛇，直至每個日齡組取到8 條幼蛇為止，體重分別為（17.338 ± 0.864）g、（19.611 ± 0.990）g、（22.201 ± 0.677）g、（27.822 ± 0.652）g、（45.061 ± 0.971）g 和（56.417 ± 2.866）g，開口后飼喂活體小蛙。解剖后取消化道各段，剔除腸系膜，去除消化道內(nèi)容物后，截取食道、賁門、胃底、幽門、十二指腸、空腸、回腸和直腸各段，每段長約1cm，改良后的Bouin’s 液固定，常規(guī)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片（4～5μm），用涂有甲醛明膠的載玻片貼片，40℃烘干后備用。

2 免疫組織化學(xué)染色

參照張志強(qiáng)等[5]對竹葉青蛇（Trimeresurus stejnegeri）的研究方法，用卵白素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物（avidin-biotin-peroxidase complex, ABC）免疫組織化學(xué)法鑒別和定位滑鼠蛇不同發(fā)育階段消化道各部位的5-HT 細(xì)胞。兔抗人5-HT 抗血清為即用型，編號：ZA-0231；生物素化標(biāo)記的二抗為羊抗兔 IgG 抗血清工作液，三抗為辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，DAB 顯色，用稀釋20 倍的蘇木精染液復(fù)染。陰性對照，分別以正常的山羊血清和PBS 代替一抗，其余步驟同上。

3 5-HT 細(xì)胞計數(shù)與拍照

用光鏡（Motic-BA 210 Digital）觀察5-HT 細(xì)胞的形態(tài)；每條幼蛇消化道的每個部位計數(shù)完整切片1 張，每張切片共計數(shù)3 個400 倍視野中的5-HT 細(xì)胞數(shù)量，以其平均值代表該只幼蛇該部位5-HT 細(xì)胞的分布密度，以同一發(fā)育階段全部8 條幼蛇的平均值表示該日齡組該部位5-HT 細(xì)胞的分布密度。

4 統(tǒng)計與分析

用SPSS 19.0 for windows 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析。以日齡和消化道部位作為組間因子，用雙因素方差分析（Two-wayANOVA）統(tǒng)計滑鼠蛇消化道5-HT 細(xì)胞分布密度的日齡和部位差異。用單因素方差分析（One-wayANOVA）及多重比較（multiple comparisons）post hoctest 統(tǒng)計出殼后3、7～10（首次蛻皮組）、20、30、40 和50 日齡組消化道5-HT細(xì)胞分布密度的部位差異，以及消化道同一部位5-HT 細(xì)胞分布密度的日齡差異。文中數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean ± SE）表示，P＜ 0.05 為差異顯著，P＜ 0.01 為差異極顯著。

結(jié) 果

1 滑鼠蛇消化道5-HT 細(xì)胞形態(tài)的增齡變化

50 日齡內(nèi)，5-HT 細(xì)胞見于滑鼠蛇消化道各段，多位于絨毛上皮細(xì)胞之間，少數(shù)分布于腺上皮細(xì)胞之間，分為閉合型細(xì)胞和開放型細(xì)胞。閉合型細(xì)胞呈圓形或橢圓形，多見于食道（圖1A，圖1B）、十二指腸（圖1C，圖1D）和賁門（圖1E，圖1F）。開放型細(xì)胞呈蝌蚪狀、毛筆頭狀、短棒狀或三角形，主要分布于食道（圖1G，圖1H）、胃底（圖1I，圖1J）和直腸（圖1K，圖1L），十二指腸（圖1M，圖1N）和空腸（圖1O，圖1P）偶見。

2 滑鼠蛇消化道同一部位5-HT 細(xì)胞分布密度的日齡差異

5-HT 細(xì)胞分布密度的日齡（F5,336= 4.494,P＜ 0.01）和消化道部位（F7,336= 37.564,P＜ 0.01）差異都極為顯著，兩者之間也有極明顯的交互作用（F35,336= 2.677,P＜ 0.01）。

食道5-HT 細(xì)胞的分布密度40 日齡組顯著高于3、7～10、20 和30 日齡組（F5,42= 7.433,P＜ 0.05），50 日齡組與其他日齡組無顯著差異；賁門30 日齡組顯著高于50 日齡組（F5,42= 3.210,P＜ 0.05），十二指腸20、30、40 和50 日齡組顯著高于3 和7～10 日齡組（F5,42= 12.074,P＜ 0.05），空腸（F5,42= 4.512,P＜ 0.05）和直腸（F5,42= 4.002,P＜ 0.05）20 和50 日齡組均顯著高于3 日齡組；胃底（F5,42= 1.937,P＞ 0.05）、幽門（F5,42= 0.709,P＞ 0.05）和回腸（F5,42= 0.759,P＞ 0.05）無日齡差異（表1）。

圖1 滑鼠蛇消化道5-羥色胺細(xì)胞形態(tài)的增齡變化。A，3 日齡食道圓形的5-HT 細(xì)胞；B，3 日齡食道橢圓形的5-HT 細(xì)胞；C，20 日齡十二指腸圓形的5-HT 細(xì)胞；D，20 日齡十二指腸橢圓形的5-HT 細(xì)胞；E，3 日齡賁門圓形的5-HT 細(xì)胞；F，50 日齡賁門橢圓形的5-HT 細(xì)胞；G，40 日齡食道蝌蚪形的5-HT 細(xì)胞；H，3 日齡食道蝌蚪形的5-HT 細(xì)胞；I，3 日齡胃體毛筆頭狀的5-HT 細(xì)胞；J，3 日齡胃底短棒狀的5-HT 細(xì)胞；K，10 日齡直腸蝌蚪形的5-HT 細(xì)胞；L，30 日齡直腸毛筆頭狀的5-HT 細(xì)胞；M，3 日齡十二指腸毛筆頭狀的5-HT 細(xì)胞；N，10 日齡十二指腸短棒狀的5-HT 細(xì)胞；O，20 日齡空腸三角形的5-HT 細(xì)胞；P，50 日齡空腸三角形的5-HT 細(xì)胞。EP，上皮；SG，胃腺；箭頭，5-HT 陽性細(xì)胞；比例尺，15μmFig. 1 Age-related changes of morphology of 5-hydroxytryptamine cells along the digestive tract of Ptyas mucosus. A, round shaped 5-HT cells in the esophagus of 3d old Ptyas mucosus； B, ellipse shaped 5-HT cells in the esophagus of 3d old Ptyas mucosus； C, round shaped 5-HT cells in the duodenum of 20d old Ptyas mucosus； D, ellipse shaped 5-HT cells in the duodenum of 20d old Ptyas mucosus； E, round shaped 5-HT cells in the cardia of 3d old Ptyas mucosus； F, ellipse shaped 5-HT cells in the cardia of 50d old Ptyas mucosus； G, tadpole shaped 5-HT cells in the esophagus of 40d old Ptyas mucosus； H, tadpole shaped 5-HT cells in the esophagus of 3d old Ptyas mucosus； I, brush-head shaped 5-HT cells in the fundus of 3d old Ptyas mucosus； J, short-bar shaped 5-HTcells in the fundus of 3d old Ptyas mucosus； K, tadpole shaped 5-HT cells in the rectum of 10d old Ptyas mucosus； L, brush-head shaped 5-HT cells in the rectum of 30d old Ptyas mucosus； M, brush-head shaped 5-HT cells in the duodenum of 3d old Ptyas mucosus； N, short-bar shaped 5-HT cells in the duodenum of 10d old Ptyas mucosus； O, triangle shaped 5-HT cells in the jejunum of 20 day old Ptyas mucosus； P, triangle shaped 5-HT cells in the jejunum of 50d old Ptyas mucosus. EP, epithelium； SG, stomach gland； arrows, 5-HT positive cells； scale bar, 15μm

表1 滑鼠蛇消化道5-羥色胺細(xì)胞分布密度的增齡變化和部位差異（單位：細(xì)胞個數(shù)/400×視野）Tab. 1 Age-related and segmental differences of distribution densities on 5-hydroxytryptamine immunoreactive positive cells in the digestive tract of Ptyas mucosus (unit: cells/400× fields)

3 同一日齡組滑鼠蛇消化道5-HT 細(xì)胞分布密度的部位差異

3 日齡組5-HT 細(xì)胞的分布密度（F7,56= 6.816,P＜ 0.01）賁門最高，胃底和幽門與之接近，食道、回腸和直腸居中，十二指腸和空腸最低；7～10 日齡組（F7,56= 8.367,P＜ 0.01）胃底最高，賁門和幽門與之接近，直腸居中，食道和空腸較低，十二指腸和回腸最低；20 日齡組（F7,56= 10.205,P＜ 0.01）直腸、胃底和幽門最高，賁門和空腸其次，食道、十二指腸和回腸最低；30 日齡組（F7,56= 8.912,P＜ 0.01）直腸和賁門最高，胃底和幽門其次，十二指腸和空腸較低，食道和回腸最低；40 日齡組（F7,56= 5.586,P＜ 0.01）直腸最高，食道和幽門其次，賁門和胃底居中，十二指腸和空腸較低，回腸最低；50 日齡組（F7,56= 10.525,P＜ 0.01）直腸最高，幽門和胃底與直腸接近，空腸、食道和賁門較低，十二指腸和回腸最低。

討 論

50 日齡內(nèi)滑鼠蛇消化道5-HT 細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征較為穩(wěn)定，5-HT 細(xì)胞分布密度在開口前后的部位和日齡差異較大，提示滑鼠蛇消化功能建立可能始于生后30～50d，該時期是投喂配合飼料的最佳時期。

1 滑鼠蛇消化道5-HT 細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征的增齡變化

滑鼠蛇出殼后3d 消化道各段都有5-HT 細(xì)胞分布，既有呈圓形或橢圓形的閉合型細(xì)胞，也有形態(tài)多樣的開放型細(xì)胞，后者有細(xì)胞質(zhì)突起伸向腸腔，或有突起與鄰近細(xì)胞相接觸，可能執(zhí)行腔分泌和旁分泌的功能，這與生后1～45d 的大鼠[9]、生后5 ～60d 的小鼠[10]和其他兩棲爬行動物相似[2,11]。50d 齡內(nèi)滑鼠蛇消化道5-HT 細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征未見明顯改變，幼體、成體和老年長爪沙鼠（Meriones Unguiculatus）腸道5-HT 細(xì)胞[12]，以及幼體、亞成體和成體中華蟾蜍（Bufo gargarizans）消化道嗜銀細(xì)胞[13]和生長抑素細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征也都無明顯的年齡變化[14]，但在禁食條件下，東方蠑螈（Cynops orientalis）禁食組開放型和閉合型5-HT 細(xì)胞的比值胃體和空腸高于喂食組，回腸低于喂食組[15]。

2 同一發(fā)育階段滑鼠蛇消化道5-HT 細(xì)胞分布密度的部位差異

3 日齡和首次蛻皮的滑鼠蛇消化道5-HT 細(xì)胞都在賁門、胃底和幽門數(shù)量較多，十二指腸和空腸、十二指腸和回腸較少；20、30、40 和50 日齡組直腸和/或胃部最多，食道、十二指腸和回腸、食道和回腸、回腸及十二指腸和回腸最少。大鼠生后1～45d及小鼠生后5～60d，胃腸道各段均可見到 5-HT 細(xì)胞，兩者均以十二指腸分布最為密集，大鼠從空腸到回腸數(shù)量漸少[9]，小鼠十二指腸明顯多于小腸其他段和結(jié)腸，腺胃數(shù)量最少[10]；隨生后發(fā)育過程進(jìn)行，5-HT 細(xì)胞數(shù)量持續(xù)增加[9,10]?；笊叱鰵ず蠛褪状瓮懫ず?，胃部5-HT 細(xì)胞密度較高，有助于促進(jìn)消化道的機(jī)械運(yùn)動，盡快排空消化道內(nèi)來源于胚胎時期的營養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)滑鼠蛇盡快開口攝食；開口后，滑鼠蛇除繼續(xù)通過較高密度的5-HT 細(xì)胞來維持胃部的機(jī)械運(yùn)動外，直腸部位的5-HT 細(xì)胞密度明顯升高，這可能有助于食物殘渣的排出。

3 滑鼠蛇消化道同一部位5-HT 細(xì)胞分布密度的日齡差異

滑鼠蛇食道、賁門、十二指腸、空腸和直腸5-HT 細(xì)胞的分布密度都在20～50d 齡最高，3d 齡最低，但賁門30d 齡組高于50d 齡組，說明隨著發(fā)育歷程的推進(jìn)，賁門的機(jī)械消化作用在開口后顯著增強(qiáng)，但隨著發(fā)育進(jìn)程的推進(jìn)而減弱，這可能是滑鼠蛇幼蛇開口難的原因之一。大鼠生后45d 內(nèi)，18d 時胃腸道各段5-HT 細(xì)胞的數(shù)量最多[9]，小鼠生后5～60d 5-HT細(xì)胞的數(shù)量隨生后發(fā)育成熟而持續(xù)性增加[10]。出殼、蛻皮和開口時間早晚是制約滑鼠蛇養(yǎng)殖效益的關(guān)鍵生活史階段[8,16]。生產(chǎn)上，通常以活體幼蛙誘導(dǎo)滑鼠蛇開口攝食，之后再投喂褪毛后的雞雛或鴨雛[8]。首次蛻皮后，滑鼠蛇開始主動攝食，根據(jù)其消化道5-HT 細(xì)胞的發(fā)育特點(diǎn)和年齡變化，結(jié)合5-HT 調(diào)控攝食、促進(jìn)消化道蠕動和調(diào)節(jié)腸道菌群組成的生理功能[2,3]，建議可在滑鼠蛇開口后盡量投喂活體小動物，以便于食物順利進(jìn)入消化道，滿足其快速生長發(fā)育的能量需求。

滑鼠蛇出殼后3d 消化道各段均有5-HT 細(xì)胞分布，開口前胃部密度較高，開口后直腸部位密度增加，說明隨發(fā)育進(jìn)程滑鼠蛇幼蛇對食物的機(jī)械消化作用、對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收能力和排出食物殘渣的能力均明顯增強(qiáng)，可考慮在開口后逐漸增加投喂量和飼料塊的大小。