miR-143 在人頸動脈粥樣硬化患者斑塊組織中表達 變化及作用機制

宋堅，王先法，朱越鋒

（1 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院普外科，杭州310016； 2 寧波市第四醫(yī)院普外科，寧波315700）

頸動脈狹窄是頸動脈出現(xiàn)的單節(jié)段或多部位的管腔狹窄甚至閉塞的疾病，它與腦血管事件存在明顯的相關(guān)性，是缺血性腦卒中的重要原因，而動脈粥樣硬化是頸動脈狹窄最主要的原因[1]。隨著人們生活水平的不斷提高以及高脂飲食等生活習慣的改變，頸動脈粥樣硬化愈加常見。血管平滑肌細胞作為血管壁最豐富的固有細胞，是進展期斑塊纖維帽的主要成分，在動脈粥樣硬化的病理過程中發(fā)揮著主要作用[2]。血管平滑肌細胞通過增殖、遷移及分泌細胞外基質(zhì)，在動脈粥樣硬化斑塊形成和斑塊破裂、出血的發(fā)生中發(fā)揮著重要作用[3]。

微小RNA（microRNA, miRNA）是一類內(nèi)源性非編碼小分子RNA, 在調(diào)控機體和細胞的生物學(xué)活動中發(fā)揮重要作用。miRNA 異常表達與血管平滑肌細胞生物學(xué)活動的異常改變及動脈粥樣硬化斑塊形成和不穩(wěn)定性均密切相關(guān)[4]。MiR-143 是miRNA 家族的重要成員之一，位于人第5 號染色體5q33，在細胞增殖、分化及腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用[5]。研究發(fā)現(xiàn)miR-143 在頸動脈粥樣硬化[6]和冠脈粥樣硬化[7]患者血漿中表達降低，但作用機制尚不明確。本研究觀察miR-143 在頸動脈粥樣硬化患者斑塊組織中的表達變化，并觀察其對人主動脈平滑肌細胞（human aortic vascular smooth muscle cells, HAVSMCs）增殖及遷移能力的影響，探討其可能的調(diào)控機制。

材料與方法

1 研究對象

收集2016 年3 月至2018 年3 月在浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院收治的因頸動脈狹窄行頸動脈內(nèi)膜剝脫術(shù)（CEA）切除的頸動脈斑塊組織及斑塊旁內(nèi)膜組織56 例，其中男35 例，女21 例，年齡（65.7±7.9）歲，根據(jù)術(shù)前頸動脈超聲檢查及術(shù)后斑塊病理學(xué)檢查將所取得的斑塊組織又分為穩(wěn)定斑塊組26 例和不穩(wěn)定斑塊組30 組。另外選擇同期年齡、性別相匹配的在我院因外傷、門脈高壓、原發(fā)性血小板增多癥而行脾切除術(shù)患者的正常脾動脈內(nèi)膜組織20 例作為正常對照組，其中男11 例，女9 例，年齡（62.3±9.2）歲。術(shù)中所取得的組織均迅速置于液氮保存，轉(zhuǎn)運至-80℃低溫冰箱保存。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會備案批準，所有患者均為本研究知情同意。

2 主要試劑

miRNA 提取試劑盒購自美國羅氏公司；miR-143 模擬物（miR-143 mimics）、模擬物陰性對照（mimics-NC）、miR-143 抑制物（miR-143 inhibitor）、抑制物陰性對照（inhibitor-NC）、及全部引物均購自廣州銳博生物公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen 公司；逆轉(zhuǎn)錄miScript II RT 試劑盒、miScript PCR Starter 熒光定量PCR 試劑盒購自德國Qiagen 公司；CCK-8 試劑盒購自上海威奧生物公司；Transwell 小室購自美國Corning公司；0.1%結(jié)晶紫購自南京森貝伽生物公司；雙熒光素酶活性檢測試劑盒購自美國Promega 公司；突變型和野生型熒光素酶報告基因質(zhì)粒ADAMTS4-MUT、ADAMTS1-WT 均購自上海吉瑪公司；兔抗人ADAMTS4、β-actin 抗體均購自美國Santa Cruz 公司；HRP 標記的山羊抗兔IgG 均購自武漢博士德生物工程公司。

3 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

HAVSMCs 購自美國ATCC，細胞孵育在含5%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中，置入37℃，5% CO2的恒溫箱細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞接種到細胞板中，隨機分為四組，然后按照LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑盒說明書操作，分別將miR-143 mimics、mimics-NC、miR-143 inhibitor、inhibitor-NC轉(zhuǎn)染至HAVSMCs。

4 qRT-PCR

棄去細胞培養(yǎng)的上清液，加入miRNA 提取試劑，按照說明書操作提取組織或細胞總RNA。取總RNA 應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄miScript II RT 試劑盒合成cDNA。 以cDNA 為 模 板， 進 行qRT-PCR。miR-143 上游引物序列：5’-ACACTCCAGCTGGGTGAGATGAAGCACT-3’，下游引物序列： 5’-TGGTGTCGTGGAGTCG-3’。內(nèi)參U6 上游引物序列：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物序列： 5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。PCR 反 應(yīng) 條件：95℃ 10 min，95℃ 10s，60℃ 20s，72℃ 10s，共40 個循環(huán)。miR-143 表達水平采用2-△△Ct法計算。

5 CCK-8 實驗

HAVSMC 細胞以5×103個/孔的細胞密度接種于96 孔細胞板，在轉(zhuǎn)染后24、48、72h 分別向各孔加入10μl CCK-8 溶液，37℃繼續(xù)孵育4h 后用，酶標儀上測量450nm 波長處各孔的光密度（D）值。

6 Transwell 遷移實驗

使用孔徑為8μm 的Transwell 小室進行實驗，在下室加入600μl 含10% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，將轉(zhuǎn)染后48h 的HAVSMCs 以無血清DMEM 培養(yǎng)基重懸制備單細胞懸液，在上室加入100μl 細胞懸液（含2×104個HAVSMCs），37℃、5% CO2繼續(xù)孵育24h 后取出小室，棉簽輕輕蘸去上室表面未遷移細胞，遷移細胞以95% 乙醇固定，0.1 %結(jié)晶紫染色后顯微鏡下觀察穿膜細胞數(shù)。

7 雙熒光素酶報告基因

收集HAVSMCs 以3×104個/孔的細胞密度接種于24孔板，過夜培養(yǎng)，次日分別將ADAMTS4-MUT、ADAMTS4-WT 和miR-143 mimics 或mimics-NC 共轉(zhuǎn)染HAVSMCs，轉(zhuǎn)染24h 后裂解細胞，雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測細胞的相對熒光素酶活性。

8 Western blot

收集轉(zhuǎn)染后24h 的HAVSMCs，RIPA 裂解液冰上提取細胞蛋白，BCA 試劑盒測定蛋白濃度。以40μg 的總蛋白量上樣進行10% SDS-PAGE，PVDF膜半干轉(zhuǎn)印，封閉液室溫封閉1h，分別加入兔抗人ADAMTS4（工作濃度1:1000）、β-actin 抗體（工作濃度1:5000），搖床孵育2h 后4℃過夜，次日回收一抗，TBS 洗膜后再加入二抗IgG（工作濃度1:10000），室溫孵育1h，TBS 洗膜、發(fā)光劑曝光、顯影。

9 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 21.0 進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以（±s）表示，比較采用單因素方差分析或t檢驗，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 miR-143 在頸動脈粥樣硬化斑塊組織中表達降低

qRT-PCR 結(jié)果顯示, 頸動脈粥樣硬化斑塊組織中miR-143 表達水平明顯低于斑塊旁內(nèi)膜組織和正常動脈血管內(nèi)膜組織，miR-143 在斑塊旁內(nèi)膜組織和正常動脈血管內(nèi)膜組織中表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖1A）；并且不穩(wěn)定斑塊組患者斑塊組織中miR-143 的表達水平明顯低于穩(wěn)定斑塊組斑塊組織（圖1B）。

2 miR-143 抑制HAVSMCs 增殖和遷移

CCK-8 實驗顯示，HAVSMCs 轉(zhuǎn)染miR-143 模擬物后，其增殖能力明顯降低，而轉(zhuǎn)染miR-143 抑制物后，其增殖力明顯減弱；這些變化在24h 即已明顯，48h 和72h 更加顯著（圖2）。

Transwell 分析顯示，轉(zhuǎn)染miR-143 模擬物顯著抑制HAVSMCs 的遷移力，而轉(zhuǎn)染miR-143 抑制物能增強HAVSMCs 的遷移力（圖3）。

3 ADAMTS4 是miR-143 的靶基因

通過生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫TargetScan（http://www.targetscan.org）發(fā)現(xiàn)，ADAMTS4 可能是miR-143的 靶基因，ADAMTS4 的3’UTR 區(qū) 存 在miR-143的潛在結(jié)合位點（圖4A）。雙熒光素酶報告基因檢測分析顯示，miR-143 能夠結(jié)合ADAMTS4 基因的3’UTR 區(qū)，從而明顯抑制野生型ADAMTS4-WT 的熒光素酶活性（圖4B）。Western blot 檢測顯示，轉(zhuǎn)染miR-143 模擬物能顯著抑制HAVSMCs 中ADAMTS4 水平，而轉(zhuǎn)染miR-143 抑制物則顯著上調(diào)HAVSMCs 中ADAMTS4 水平（圖4C、4D）。由此表明，ADAMTS4 是miR-143 的靶基因。

圖1 qRT-PCR 檢測miR-143 的表達。（A）：**，與正常血管內(nèi)膜比較，P＜0.01；##，與斑塊旁內(nèi)膜比較，P＜0.01。（B）：**，與穩(wěn)定斑塊比較，P＜0.01Fig. 1 qRT-PCR detection for the expression of miR-143. (A): **, P＜0.01, compared with the normal intima； ##, P＜0.01 compared with the periplaque intima,. (B): **, P＜0.01 compared with stable plaque

圖2 miR-143 對HAVSMCs 增殖影響的CCK-8 實驗檢測。*，與mimics-NC 比較，P＜0.05；**，與mimics-NC 比較，P＜0.01；#，與inhibitor-NC 比較，P＜0.05；##，與inhibitor-NC 比較，P＜0.01Fig. 2 CCK-8 assay to detect the effect of miR-143 on the proliferation of HAVSMCs. *, 0.01＜P＜0.05 compared with mimics-NC； **, P＜0.01 compared with mimics-NC； #, 0.01＜P＜0.05 compared with inhibitor-NC； ##, P＜0.05 compared with inhibitor-NC

討 論

缺血性腦卒中是目前世界范圍內(nèi)發(fā)病率、致殘率及死亡率均較高的疾病，嚴重影響生活質(zhì)量及健康。動脈粥樣硬化尤其是頸動脈粥樣硬化是缺血性腦卒最重要的病理基礎(chǔ)。隨著頸動脈粥樣硬化的發(fā)展，頸動脈嚴重狹窄或者不穩(wěn)定斑塊破裂形成血栓脫落，是引發(fā)缺血性腦卒中最重要的發(fā)病機制。

研究顯示miRNA 與頸動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，起著重要調(diào)控作用[8]。許宏俊等[9]在研究中發(fā)現(xiàn)血清miR-370 水平與頸動脈粥樣硬化患者微栓子形成有關(guān)。Wei 等[10]報道m(xù)iR-330-5p 在不穩(wěn)定性頸動脈斑塊組織中表達升高。miR-200c 在不穩(wěn)定性頸動脈粥樣硬化斑塊中表達也增高，并且行頸動脈內(nèi)膜剝脫術(shù)后1 天，患者血漿中miR-200c 表達水平明顯下降[11]。頸動脈粥樣硬化和冠脈粥樣硬化患者血漿中miR-143 均表達降低[6,7]，可能參與了動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。本研究中我們發(fā)現(xiàn)miR-143在頸動脈粥樣硬化斑塊組織中表達明顯低于斑塊旁內(nèi)膜組織和正常動脈血管內(nèi)膜組織，并且不穩(wěn)定斑塊組患者斑塊組織中miR-143 的表達水平明顯低于穩(wěn)定斑塊組斑塊組織，提示miR-143 異常表達可能與頸動脈粥樣斑塊發(fā)生及不穩(wěn)定性有關(guān)。

血管平滑肌細胞增殖及遷移的異常能夠造成動脈粥樣斑塊的過度增長及斑塊不穩(wěn)定，在促進頸動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮極其重要作用[12]。研究顯示, miRNAs 通過影響血管平滑肌細胞增殖及遷移，廣泛參與動脈粥樣硬化相關(guān)疾病的進程[13]。李曉麗等[14]發(fā)現(xiàn)miR-181b 在動脈粥樣硬化性患者血清中表達下降，通過抑制血管平滑肌細胞增殖和遷移起著抗動脈粥樣硬化的作用。Xie 等[15]報道m(xù)iR-599通過抑制血管平滑肌細胞增殖和遷移能力阻止動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。miR-143 是否能夠通過對血管平滑肌細胞的調(diào)控在頸動脈粥樣硬化發(fā)生進展中起作用尚不清楚。本研究通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染而上調(diào)或下調(diào)HAVSMCs 表達miR-143，隨HAVSMCs 中miR-143表達水平的升高，細胞增殖活性和遷移能力明顯降低； 隨HAVSMCs 中miR-143 表達的降低，細胞增殖活性和遷移能力明顯升高。表明miR-143 能夠通過調(diào)控主動脈平滑肌細胞的增殖和遷移能力，從而影響動脈粥樣硬化發(fā)展及斑塊穩(wěn)定性的作用。

圖3 Transwell 實驗檢測miR-143 對HAVSMCs 遷移的影響。A，transwell 實驗代表性結(jié)果。B，miR-143 對HAVSMCs 遷移影響的統(tǒng)計學(xué)分析；**， P＜0.01Fig. 3 Transwell assay to detect the effect of miR-143 on the migration of HAVSMCs. A, representative results of Transwell assay. B, statistical analysis for the effect of miR-143 on the migration of HAVSMCs； **, P＜0.01

圖4 miR-143 的靶基因預(yù)測及驗證。A，生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫TargetScan 預(yù)測ADAMTS4 是miR-143 的靶基因。B，miR-143 對靶基因ADAMTS4表達影響的雙熒光素酶報告基因檢測及其統(tǒng)計學(xué)分析；**，與mimics-NC 比較，P＜0.01。C, miR-143 對靶基因ADAMTS4 表達影響的Western blot 檢測。D, miR-143 對靶基因ADAMTS4 蛋白表達影響的統(tǒng)計學(xué)分析；**，與mimics-NC 比較，P＜0.01； ##，與inhibitor-NC 比較，P＜0.01Fig. 4 Prediction and validation of target genes of miR-143. A, Targetscan predicted that ADAMTS4 was the target gene of miR-143. B, double luciferase reporter gene detection and statistical analysis of the effect of miR-143 on the expression of ADAMTS4； **, P＜0.01 compared with mimics-NC. C, Western blot analysis of the effect of miR-143 on the expression of ADAMTS4. D, statistical analysis of the effect of miR-143 on the expression of ADAMTS4. **, P＜0.01 compared with mimics-NC； ##, P＜0.01 compared with inhibitor-NC, P＜0.01

為了探索miR-143 的可能作用機制，我們通過生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫TargetScan 發(fā)現(xiàn)，ADAMTS4 可能是miR-143 的靶基因，ADAMTS4 的3’UTR 區(qū)存在miR-143 的潛在結(jié)合位點。ADAMTS4 是含Ⅰ型血小板結(jié)合蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶家族（ADAMTSs）家族成員重要成員之一，ADAMTSs家族是一類游離于血漿或者整合于細胞外基質(zhì)的基質(zhì)金屬蛋白酶亞家族，屬于Zn2+依賴的分泌型金屬蛋白酶，參與細胞外基質(zhì)的蛋白水解作用。研究顯示ADAMTSs 家族成員與動脈粥樣硬化性疾病密切相關(guān)[16]。ADAMTS4 在頸動脈粥樣硬化患者血漿[17]和斑塊[18]中表達增高，與斑塊的不穩(wěn)定性密切相關(guān)。敲除ADAMTS4 的ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化斑塊易損指數(shù)降低，斑塊縮小[19]。我們通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲沂緈iR-143 能夠結(jié)合ADAMTS4 基因的3’UTR 區(qū)，并且Western blot 結(jié)果顯示miR-143 能夠在轉(zhuǎn)錄后水平負向調(diào)控HAVSMCs 的ADAMTS4蛋白表達，表明ADAMTS4 可能是miR-143 的直接作用靶基因，miR-143對人動脈斑塊的調(diào)控可能是通過靶向ADAMTS4 基因?qū)崿F(xiàn)的。

綜述所述，miR-143在頸動脈粥樣硬化斑塊組織中表達降低，其可能通過靶向調(diào)控ADAMTS4 從而影響血管平滑肌細胞的增殖和遷移能力，與頸動脈斑塊的形成和不穩(wěn)定性密切相關(guān),為頸動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的研究提供了新的線索。