姜黃素對(duì)A549 肺癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的抑制 作用及與Keap1/Nrf2 信號(hào)通路的關(guān)系

金磊，郭潔，劉昊，康云帆*，徐長福

（1 西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心胸外科，2 急診科，西安710077；3 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，西安710061）

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，其疾病發(fā)病率和死亡率正在逐年升高，嚴(yán)重威脅著人類生命健康。但是由于肺癌在早期無明顯發(fā)病癥狀，因此很大部分患者都是在晚期才能被確診，從而導(dǎo)致肺癌發(fā)生轉(zhuǎn)移，使得患者錯(cuò)過最佳治療時(shí)間[1-3]。肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移是其惡化的標(biāo)志和特征，也是影響肺癌患者治療效果并導(dǎo)致患者死亡的最主要原因。肺癌的侵襲、轉(zhuǎn)移是一個(gè)極其復(fù)雜的過程，該過程中涉及一系列腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因或蛋白，一些功能性基因被激活或抑制，另一些基因則表現(xiàn)為缺失或功能失活，或者相互拮抗，從而影響機(jī)體免疫系統(tǒng)抗侵襲、轉(zhuǎn)移功能的正常發(fā)揮，最終導(dǎo)致肺癌組織的轉(zhuǎn)移[4-6]。

癌基因和抑癌基因與腫瘤的發(fā)生、形成有著密切的關(guān)系，但是目前關(guān)于癌癥基因、抑癌基因與肺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移之間的關(guān)聯(lián)性仍無明確共識(shí)。有研究表明Kelch 樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1（Kelchlike ECH-associated protein 1, Keap1）/核因子E2 相關(guān)因子2（nuclear factor-E2- related factor 2, Nrf2）信號(hào)通路在肺癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。Nrf2 可以預(yù)防腫瘤的發(fā)生，而Keap1 是Nrf2的內(nèi)源性酶抑制劑，對(duì)Nrf2 表達(dá)水平具有調(diào)控作用[7-9]。

姜黃素是中藥姜黃的主要活性成分，具有較強(qiáng)的抗癌作用，還可對(duì)肺癌達(dá)到早期的預(yù)防作用。大量研究[10-12]表明姜黃素可通過調(diào)節(jié)ERK信號(hào)通路、mTOR 信號(hào)通路等進(jìn)而發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用；此外，姜黃素還可通過調(diào)節(jié)Rho GTP、β-catenin、capasse-8 等蛋白的表達(dá)，發(fā)揮對(duì)肺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的抑制作用及誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡等作用，并呈現(xiàn)劑量依賴性；但是鮮有文獻(xiàn)報(bào)道其對(duì)Keap1/Nrf2 信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用。因此，本研究采用A549 肺癌細(xì)胞，檢測姜黃素對(duì)于Keap1/Nrf2 信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用和對(duì)A549 肺癌細(xì)胞遷移、侵襲和凋亡的影響，并分析二者之間的關(guān)系。

材料與方法

1 材料與儀器

A549 細(xì)胞由中科院上海細(xì)胞庫提供，姜黃素購買自中國食品藥品檢定研究院，RPMI1640 細(xì)胞培養(yǎng)液購買自美國 Gibco 公司，胎牛血清購買自美國Amresco 公司，一抗Keap1、Nrf2、β-actin 均購買自美國sigma 公司。

3111 型CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)器（Thermo 公司，美國），Power Wave XS 型酶標(biāo)儀（BIO TEK 公司，美國），熒光顯微鏡（Olympus，日本）。

2 細(xì)胞培養(yǎng)

使用含有10%胎牛血清的RPM11640 培養(yǎng)液進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，每2d 更換一次細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)條件為37℃，細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)CO2濃度為5%；待細(xì)胞長滿瓶底面積80%、且處于對(duì)數(shù)期時(shí)，加入0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化、傳代，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

3 MTT 檢測細(xì)胞增殖

取對(duì)數(shù)期肺癌A549 細(xì)胞，加入RPM11640 培養(yǎng)液，接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔1×104 個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)48h 貼壁后，將細(xì)胞分為4 組，分別加入0、1.25、2.5 和5μmol/L 姜黃素，每個(gè)濃度設(shè)4 個(gè)復(fù)孔。于培養(yǎng)終止前4h 每孔加入20μl 的MTT溶液。終止細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，棄去上清，每孔加入100μl DMSO，于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育30min，置于微孔板振蕩器振蕩20s，采用酶標(biāo)儀于490nm 處測定各孔吸光度OD 值，計(jì)算細(xì)胞增殖率。

4 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測A549 細(xì)胞侵襲能力

取對(duì)數(shù)生長期的A549 細(xì)胞，胰酶消化收集細(xì)胞，2000r/min 離心5min，洗去培養(yǎng)液后，采用PBS 再次浸洗細(xì)胞，干細(xì)胞培養(yǎng)基吹打均勻，進(jìn)行Transwell 實(shí)驗(yàn)。取基質(zhì)膠放置于冰上待其融化后，并用冷的RPMI1640 培養(yǎng)基按照4:1 的比例進(jìn)行稀釋，每孔加入45μl 基質(zhì)膠，鋪勻后放置在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2h，并調(diào)整細(xì)胞濃度為每升5×108，每個(gè)小室加入200μl 細(xì)胞懸液，即1×105個(gè)細(xì)胞，并加入不同濃度（0、1.25、2.5 和5μmol/L）的姜黃素，培養(yǎng)48h。然后吸取上室的細(xì)胞懸浮液，用4%的多聚甲醛固定15min，再加入結(jié)晶紫染色15min。然后用PBS 清洗2 次，用棉棒擦去上室未遷移細(xì)胞。顯微鏡下取 3 個(gè)隨機(jī)視野進(jìn)行拍照。上述試驗(yàn)重復(fù)3 次。

5 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測A549 細(xì)胞遷移能力

取生長狀態(tài)良好的A549 細(xì)胞，用胰酶消化收集細(xì)胞后，再用PBS 重復(fù)洗去血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，然后用不含血清的RPMI 640 培養(yǎng)基，將細(xì)胞濃度調(diào)整為每升2.5×108。小室上室加入200μl 細(xì)胞懸液，并加入不同濃度（0、1.25、2.5 和5μmol/L）的姜黃素。同侵襲試驗(yàn)方法處理細(xì)胞，培養(yǎng)48h，然后吸取上室的細(xì)胞懸浮液，用4%的多聚甲醛固定15min，再加入結(jié)晶紫染色15min。然后用PBS 清洗2 次，用棉棒擦去上室未遷移細(xì)胞。顯微鏡下取 3 個(gè)隨機(jī)視野進(jìn)行拍照。上述試驗(yàn)重復(fù)3 次。

6 流式細(xì)胞術(shù)檢測肺癌A549 細(xì)胞的凋亡程度

取生長對(duì)數(shù)期的A549 細(xì)胞，采用姜黃素（1.25、2.5和5μmol/L）處理48h后，用磷酸緩沖鹽（phosphate buffered saline，PBS）洗滌細(xì)胞2 次后，采用胰蛋白酶消化、收集細(xì)胞，離心后棄去上清后制成細(xì)胞懸液，加入5μl 的Annexin V-FITC 染液，混勻后再加入10μl 的碘化丙啶染色，混勻。37℃放置4min，PI染色后用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞的凋亡情況。上述試驗(yàn)重復(fù)3 次。

7 Western blot 檢測相關(guān)蛋白表達(dá)

取對(duì)數(shù)生長期的A549 細(xì)胞，加入姜黃素作用24h 后，取3 組細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，采用細(xì)胞超聲破碎儀進(jìn)行超聲破碎，在12000r/min、4℃條件下離心15min，取上清，按照每孔20μg 蛋白樣品量上樣。采用SDS-PAGE 電泳分離蛋白，100V 恒壓轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF 膜上，用5%的胎牛血清（BSA）封閉2h，然后分別用Keap1、Nrf2、β-actin 抗體4℃孵育過夜，TBST 洗滌3 次后加入熒光二抗，孵育2h；棄去液體，TBST 洗滌3 次。用UVI 凝膠成像分析系統(tǒng)測量目的條帶的光密度；以β-actin 為內(nèi)參，以目的蛋白和內(nèi)參蛋白的光密度比值為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

8 RT-PCR 檢測相關(guān)蛋白mRNA 的表達(dá)

提取3 組細(xì)胞的總RNA，并測定其濃度，逆轉(zhuǎn)錄后得到cDNA。然后按照試劑盒說明書的具體指示測定Keap1 mRNA 和Nrf2 mRNA 的表達(dá)。Nrf2 引物序列（F：3’-GACTCTACCACTGTTCCCAA-5’；R：3’-CCATTCTTATTTCACCGACG-5’）；Keapl 引 物序列（F：3’-TTCAAGCCGCAGTTGCTCA-5’；R：3’-TTAGTCACCAGCGGGACG-5’）；β-actin 引 物序列（F：3’-TCAGGTCATCACTATCGGCAAT-5’；R：3’-AAAGAAAGGGTGTAAAACGCA-5’），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。反應(yīng)條件為：90℃變性20min 后，然后92℃ 45s，56℃ 32s，72℃ 55s，共42 個(gè)循環(huán)。取4μl 進(jìn)行6%的聚丙烯凝膠電泳。電泳結(jié)束將凝膠浸泡在0.5μg/ml 溴化乙錠（EB）溶液中染色，后應(yīng)用LAPHA 凝膠成像系統(tǒng)對(duì)Keapl 和Nrf2 電泳條帶進(jìn)行光密度掃描。由計(jì)算機(jī)計(jì)算出各自積分吸光度值，以Keapl 和Nrf2 與β-actin 的光密度比值（Keapl/β-actin、Nrf2/β-actin）表示相對(duì)強(qiáng)度。

9 統(tǒng)計(jì)與分析

本研究所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3 次重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 22.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用GraphPad Prism 6 制圖。多組間比較均采用單因素方差分析，以P＜0.05 為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 姜黃素抑制A549 細(xì)胞增殖

MTT 實(shí)驗(yàn)檢測所示，0、1.25、2.5 和5μmol/L濃度的姜黃素作用于肺癌A549 細(xì)胞后，其增殖力較未用姜黃素處理者明顯降低，并且隨著姜黃素濃度的增加，細(xì)胞增殖力降低逐漸明顯，呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性（圖1）。

圖1 MTT 法檢測不同濃度姜黃素對(duì)A549 細(xì)胞增殖力的影響。與對(duì)照組相比：*，0.01＜P＜0.05；**，P＜0.01。與1.25μmol/L 組相比：#，0.01＜P＜0.05；##，P＜0.01。與2.5μmol/L 組相比：&，0.01＜P＜0.05；&&，P＜0.01Fig. 1 MTT assay for the effect of different concentrations (0, 1.25, 2.5, 5μmol/L) of curcumin on cell proliferation. Compared with the control group: *, 0.01＜P＜0.05； **, P＜0.01. Compared with the 1.25μmol/L group, #, 0.01＜P＜0.05； ##, P＜0.01. Compared with the 2.5μmol/L group: &, 0.01＜P＜0.05； &&, P＜0.01

2 姜黃素抑制A549 細(xì)胞的侵襲與遷移

Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力結(jié)果顯示，姜黃素（1.25、2.5 和5 μmol/L）能夠明顯抑制A549 細(xì)胞的侵襲，其48h 的抑制率分別為52.63%±6.32%、69.77%±7.58%和81.47%±7.57%；姜黃素（1.25、2.5 和5μmol/L）能夠有效降低A549 細(xì)胞的遷移能力，其48h的抑制率分別為（41.58±8.47%），58.62%±8.97%，65.37±7.84%。

3 姜黃素促進(jìn)肺癌A549 細(xì)胞凋亡

為了探究姜黃素是否能夠促進(jìn)肺癌A549 細(xì)胞的凋亡，采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)姜黃素處理48h后的細(xì)胞進(jìn)行Annexin V-PI 雙染凋亡檢測。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，隨著姜黃素濃度（1.25、2.5 和5μmol/L）不斷增加，肺癌A549 細(xì)胞的凋亡程度呈現(xiàn)上升趨勢，與濃度呈現(xiàn)正相關(guān)，表明姜黃素能夠促進(jìn)肺癌A549 細(xì)胞的凋亡。

圖2 不同濃度（0、1.25、2.5、5μmol/L）姜黃素對(duì)A549 細(xì)胞侵襲與遷移影響的Transwell 實(shí)驗(yàn)分析。A，代表性Transwell 實(shí)驗(yàn)結(jié)果。B，姜黃素對(duì)A549 細(xì)胞侵襲影響的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。C，姜黃素對(duì)A549 細(xì)胞遷移影響的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。與對(duì)照組相比：*， 0.01＜P＜0.05；**，P＜0.01。與1.25 μmol/L 組相比：#，0.01＜P＜0.05；##，P＜0.01。與2.5 μmol/L 組相比：&，0.01＜P＜0.05；&&，P＜0.01Fig. 2 Transwell assay for effects of different concentrations (0, 1.25, 2.5, 5μmol/L) of curcumin on invasion and migration of A549 cells. A, representative results of Transwell assay. B, statistical analysis for effect of curcumin on invasion of A549 cells. C, statistical analysis for effect of curcumin on migration of A549 cells. Compared with the control group: *, 0.01＜P＜0.05； **, P＜0.01. Compared with the 1.25μmol/L group: #, 0.01＜P＜0.05； ##, P＜0.01. Compared with the 2.5μmol/L group: &, 0.01＜P＜0.05； &&, P＜0.01

圖3 不同濃度（0、1.25、2.5、5μmol/L）姜黃素對(duì)肺癌A549 細(xì)胞凋亡程度影響的流式細(xì)胞術(shù)分析。A，代表性流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果。B，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。與對(duì)照組相比：*，0.01＜P＜0.05；**，P＜0.01。與1.25μmol/L 組相比：#，0.01＜P＜0.05；##，P＜0.01。與2.5μmol/L 組相比：&, 0.01＜P＜0.05；&&，P＜0.01Fig.3 Flow cytometry analysis for effect of different concentrations (0, 1.25, 2.5, 5μmol/L) of curcumin on apoptosis of lung cancer A549 cells. A, representative results of flow cytometry analysis. B, statistical analysis. Compared with the control group: *, 0.01＜P＜0.05； **, P＜0.01. Compared with the 1.25 μmol/L group, #, 0.01＜P＜0.05； ##, P＜0.01. Compared with the 2.5 μmol/L group, &, 0.01＜P＜0.05； &&, P＜0.01

4 姜黃素降低A549 細(xì)胞Keap1 和Nrf2 水平

Western blot 實(shí)驗(yàn)顯示，不同濃度的姜黃素處理后的A549細(xì)胞，隨著藥物濃度的增加，各組中Keap1和Nrf2 的蛋白表達(dá)量在A549 細(xì)胞中顯著性降低，表明姜黃素能夠顯著性調(diào)節(jié)A549 細(xì)胞中Keap1 和Nrf2 的蛋白表達(dá)，對(duì)于Keap1/Nrf2 信號(hào)通路具有抑制作用（圖4）。

圖4 不同濃度（0、1.25、2.5、5μmol/L）姜黃素對(duì)肺癌A549 細(xì)胞Keap1 和Nrf2 水平影響的Western blot 檢測。A，代表性Western blot 結(jié)果。B，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。與對(duì)照組相比：*，0.01＜P＜0.05；**，P＜0.01；與1.25μmol/L 組相比：#，0.01＜P＜0.05；##，P＜0.01；與2.5μmoL/L組相比：&，0.01＜P＜0.05；&&，P＜0.01Fig.4 Western blot detection for effect of different concentrations (0, 1.25, 2.5, 5μmol/L) of curcumin on levels of Keap1 and Nrf2 in A549 cells. A, representative results of Western blot. B, statistical analysis. Compared with the control group: *, 0.01＜P＜0.05； **, P＜0.01. Compared with the 1.25μmol/L group, #, 0.01＜P＜0.05； ##, P＜0.01. Compared with the 2.5μmoL/L group, &, 0.01＜P＜0.05； &&, P＜0.01

5 姜黃素抑制A549 細(xì)胞中Keap1 mRNA 和Nrf2 mRNA 的表達(dá)

RT-PCR 檢測顯示，姜黃素處理后，A549 細(xì)胞中Keap1 mRNA和Nrf2 mRNA水平均較空白組顯著性降低，與姜黃素濃度呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，表明姜黃素能在轉(zhuǎn)錄水平顯著抑制A549 細(xì)胞中Keap1 和Nrf2 的表達(dá)。

圖5 不同濃度（0、1.25、2.5、5μmol/L）姜黃素對(duì)肺癌A549 細(xì)胞Keap1 和Nrf2 mRNA 表達(dá)影響的RT-PCR 檢測。A，代表性RT-PCR 結(jié)果。B，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。與對(duì)照組相比：*，0.01＜P＜0.05；**，P＜0.01；與1.25μmol/L 組相比：#，0.01＜P＜0.05；##，P＜0.01；與2.5μmoL/L組相比：&，0.01＜P＜0.05；&&，P＜0.01Fig.5 RT-PCR assay for effect of different concentrations (0, 1.25, 2.5, 5μmol/L) of curcumin on mRNA levels of Keap1 and Nrf2 in A549 cells. A, representative results of RT-PCR. B, statistical analysis. Compared with the control group: *, 0.01＜P＜0.05； **, P＜0.01. Compared with the 1.25μmol/L group, #, 0.01＜P＜0.05； ##, P＜0.01. Compared with the 2.5μmoL/L group, &, 0.01＜P＜0.05； &&, P＜0.01

結(jié) 論

肺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移是其疾病病程惡化的重要標(biāo)志和特征，也是影響患者治療效果、并導(dǎo)致患者死亡的主要原因。然而肺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移是一個(gè)非常復(fù)雜的病理過程，涉及多種蛋白、基因的調(diào)節(jié)，是一種細(xì)胞增殖和凋亡均發(fā)生異常的疾病[13-15]。從基因和蛋白水平來解釋肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，對(duì)于肺癌的臨床新藥研發(fā)、預(yù)防和治療具有重要意義。姜黃素作為中藥姜黃的主要活性成分，多項(xiàng)研究表明其具有廣泛的抗炎、抗氧化和抗腫瘤等多種藥理活性，且對(duì)于多種腫瘤的耐藥作用均具有逆轉(zhuǎn)作用[16-18]。本研究基于肺癌A549 細(xì)胞，探究姜黃素對(duì)A549 細(xì)胞遷移、侵襲的抑制作用及其調(diào)節(jié)機(jī)制，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示姜黃素能夠顯著性抑制肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并能夠促進(jìn)肺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。

Keap1/Nrf2 信號(hào)通路與腫瘤細(xì)胞的耐藥性具有密切關(guān)系。Keap1 蛋白是Nrf2 的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)基因，也是調(diào)節(jié)Nrf2 介導(dǎo)的抗氧化反應(yīng)的“分子開關(guān)”[19,20]。正常情況下，Nrf2 位于細(xì)胞質(zhì)中，Keap1 在細(xì)胞質(zhì)中能夠與Nrf2 結(jié)合形成Keap1-Nrf2 復(fù)合物，使Nrf2在胞質(zhì)內(nèi)持續(xù)泛素化，并進(jìn)一步被蛋白降解，從而使得Nrf2 從胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到胞內(nèi)的過程被抑制。既往研究表明，Keap1/Nrf2 信號(hào)通路在抗腫瘤的研究中發(fā)揮者重要作用。在許多腫瘤細(xì)胞中，Nrf2 蛋白均處于過表達(dá)狀態(tài)，表明Nrf2 蛋白對(duì)于腫瘤的發(fā)生起著重要作用[21-23]。本研究通過測定Keap1 和Nrf2 蛋白及其mRNA 水平，證明姜黃素能夠顯著抑制Keap1/Nrf2信號(hào)通路蛋白的表達(dá)，表明姜黃素對(duì)于Keap1/Nrf2信號(hào)通路活性具有抑制作用作用。

綜上所述，本研究通過增殖、侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)證實(shí)姜黃素能夠有效抑制肺癌A549 細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，進(jìn)而影響肺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力，并能夠促進(jìn)肺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。姜黃素對(duì)A549 細(xì)胞的這些作用可能是通過抑制Keap1/Nrf2 信號(hào)通路蛋白表達(dá)而抑制該信號(hào)通路活性實(shí)現(xiàn)的。