慢性哮喘小鼠肺組織中組蛋白乙酰化修飾位點(diǎn) H2BK16ac 表達(dá)增強(qiáng)

任媛，蘇新明，陸常玲，李朋，李孟露，白詩瑤，康健

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，沈陽，110001)

慢性哮喘是由多種細(xì)胞和細(xì)胞組分參與的氣道炎癥性疾病，主要表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的喘息、氣急、胸悶、咳嗽等癥狀，其發(fā)病與肺組織中細(xì)胞因子、炎性介質(zhì)及相關(guān)酶類等眾多因素的異常密切相關(guān)[1]。研究發(fā)現(xiàn)組蛋白乙酰化、甲基化、泛素化等修飾在調(diào)控哮喘炎癥基因表達(dá)過程中發(fā)揮了重要作用，尤其是組蛋白乙酰化修飾通過改變?nèi)旧|(zhì)的空間構(gòu)象，在調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄激活、延伸、表達(dá)等方面不可或缺[2,3]。然而組蛋白上存在許多潛在的乙?；稽c(diǎn)，不同位點(diǎn)的乙酰化修飾活化后的作用并不完全相同[4]。本次研究旨在明確慢性哮喘時(shí)組蛋白乙酰化位點(diǎn)H2BK16ac 的表達(dá)變化，以期為闡明H2BK16ac與慢性哮喘之間的關(guān)系提供依據(jù)。

材料和方法

1 慢性哮喘模型小鼠的制備及分組

6～8 周SPF 級 雌 性BALB/C 小 鼠 購 自 遼 寧長生生物技術(shù)有限公司[動物許可證號：SCXK(遼)2010-0001]。隨機(jī)分為正常組和慢性哮喘組，12只/組。于實(shí)驗(yàn)第0、7、14 天，慢性哮喘組小鼠予以卵蛋白OVA（20μg）和氫氧化鋁凝膠（2mg）混懸液腹腔注射致敏。末次致敏7d 后，OVA（20mg/ml）超聲霧化（3ml/min）8 周，3 次/周，30min/次。正常組均用等量生理鹽水代替OVA 處理。

2 HE 染色觀察氣道炎癥浸潤

取小鼠左側(cè)肺組織制成0.5μm 石蠟切片用于病理染色。石蠟切片脫蠟水化，蘇木素染5min，洗去浮色后，鹽酸酒精分化3s，流水返藍(lán)20min，伊紅復(fù)染2min，洗去浮色后梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。光鏡下觀察小鼠氣道肺組織炎癥浸潤水平。

3 AB-PAS 染色觀察氣道上皮杯狀細(xì)胞增生及黏液分泌情況

石蠟切片脫蠟至水，3%醋酸洗2min，阿利新蘭染10min，蒸餾水洗去浮色，0.5%過碘酸染5min，蒸餾水洗去浮色，70%酒精洗，Schiff氏染15min，流水沖洗10min，蘇木素染核5min，水洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察氣道上皮杯狀細(xì)胞增生改變及黏液分泌情況。

4 Masson 染色觀察上皮下膠原沉積

石蠟切片脫蠟水化，Masson 復(fù)合染液染5min，0.2%醋酸洗去浮色，5%鎢鉬酸染10min，0.2%醋酸水溶液洗2 次，苯胺藍(lán)染色5min，0.2%醋酸水洗2 次，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。光鏡下觀察上皮下膠原沉積。

5 Western blot

取小鼠右側(cè)新鮮肺組織50mg 充分裂解、勻漿后，4℃下12000g 離心取上清。BCA 試劑盒檢測蛋白濃度，調(diào)整濃度后加熱變性，SDS 聚丙烯酞胺凝膠電泳（80V，30min；120V，90min），轉(zhuǎn)膜（0.25A, 60min），脫脂奶粉室溫封閉2h。H2BK16ac 多克隆兔源性抗體（1:1000，杭州景杰生物科技）4℃孵育過夜。辣根酶標(biāo)記山羊抗兔二抗（北京中山金橋生物技術(shù)有限公司）室溫孵育1h，ECL 法檢測蛋白表達(dá)，UVP 系統(tǒng)成像，Gel-Pro Analyzer 凝膠定量分析軟件進(jìn)行結(jié)果分析。

6 免疫組織化學(xué)染色

石蠟切片脫蠟水化，3% H2O2室溫孵育5min，PBS 洗3 次，5min/次；微波修復(fù)4 次，6min/次，待回復(fù)至室溫后PBS 洗3 次，5min/次；10% BSA 室溫孵育30min，H2BK16ac 兔源性多克隆抗體（1:1000，杭州景杰生物科技）4℃孵育過夜。辣根酶標(biāo)記山羊抗兔二抗（北京中山金橋生物技術(shù)有限公司，1:500）37℃ 孵育60min，PBS 洗3 次，5min/次；DAB 顯色3min 后終止顯色，流水沖洗，蘇木素染核，鹽酸酒精分化2s，流水20min 返藍(lán)后脫水、透明、封片。光鏡下觀察H2BK16ac 在肺組織中的表達(dá)分布。

7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均用±s形式表示，應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間均數(shù)的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，顯著性標(biāo)準(zhǔn)為P＜0.05。

結(jié) 果

1 成功構(gòu)建慢性哮喘小鼠模型

OVA 霧化8 周后，HE 染色在小鼠氣道、血管周圍可見大量炎癥細(xì)胞聚集，部分氣道管腔纖毛脫落（圖1A）；PAS 染色可見小鼠氣道纖毛上皮粘膜表面被黏液覆蓋，杯狀細(xì)胞明顯增多（圖1B）；Masson 染色可見氣道及血管周圍大量膠原沉積，上皮下纖維明顯增多（圖1C）。表明建模慢性哮喘小鼠模型成功。

2 慢性哮喘小鼠肺組織中H2BK16ac 水平升高

Western blot 檢測顯示，慢性哮喘小鼠肺組織中H2BK16ac 水平較正常小鼠顯著升高，約為正常小鼠肺組織中H2BK16ac 水平的3.5 倍（圖2）。

圖1 慢性哮喘小鼠肺組織組織學(xué)檢測。 HE 染色觀察氣道炎癥浸潤； AB-PAS 染色觀察氣道杯狀細(xì)胞增生； Masson 染色觀察上皮下膠原沉積。比例尺，50μmFig. 1 Histological examination of the lung tissues of the mice with chronic asthma. HE staining observed airway inflammatory infiltration； AB-PAS staining observed mucus secretion； Masson staining observed subepithelial collagen deposition； scale bar, 100μm

圖2 Western Blot 檢測肺組織中H2BK16ac 水平。A，H2BK16ac 水平的代表性Western blot 檢測結(jié)果；B，H2BK16ac 水平的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析； *，與正常組比較，P＜0.01Fig. 2 Detection for expression level of H2BK16ac in the lung tissue. A, representative results of H2BK16ac level detected by Western blot； B, statistical analysis for level of H2BK16ac detected by Western blot； *, P＜0.01, compared with the normal

3 慢性哮喘小鼠氣道纖毛柱狀上皮細(xì)胞、氣道血管周圍炎癥細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞中H2BK16ac 免疫反應(yīng)性增強(qiáng)

正常小鼠氣道纖毛柱狀上皮細(xì)胞未見H2BK-16ac 表達(dá)（圖3A），慢性哮喘組小鼠氣道纖毛柱狀上皮細(xì)胞細(xì)胞核中高表達(dá)H2BK16ac（圖3B）；正常小鼠氣道血管周圍未發(fā)現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤（圖3A），慢性哮喘小鼠肺組織中可見大量炎癥細(xì)胞包繞在氣道及血管周圍，且部分炎癥細(xì)胞的細(xì)胞核中可見H2BK16ac 免疫陽性反應(yīng)（圖3B）；正常小鼠肺組織各級血管的平滑肌細(xì)胞中未見H2BK16ac 表達(dá)（圖3C、3E），慢性哮喘小鼠各級血管的平滑肌細(xì)胞中H2BK16ac免疫反應(yīng)呈強(qiáng)陽性，尤其在新生或重塑的血管周圍H2BK16ac 表達(dá)水平明顯升高（圖3D、3F）。

圖3 肺組織中H2BK16ac 水平的免疫組織化學(xué)檢測。黑粗箭頭，氣道周圍炎癥細(xì)胞；紅粗箭頭，纖毛柱狀上皮細(xì)胞；黑細(xì)箭頭，血管平滑肌細(xì)胞；紅細(xì)箭頭，新生血管平滑肌細(xì)胞；比例尺，200μmFig. 3 Immunohistochemical examination for H2BK16ac level in the lung tissues. black thick arrows, inflammatory cells around the airway； red thick arrows, ciliated columnar epithelial cells； black thin arrows, vascular smooth muscle cells； red thin arrows, neovascular smooth muscle cells； scale bar, 200μm

討 論

為明確哮喘致病時(shí)肺組織中組蛋白乙?；揎椢稽c(diǎn)H2BK16ac 的表達(dá)變化，我們通過OVA 致敏、激發(fā)方法構(gòu)建了慢性哮喘小鼠模型。HE、PAS 和Masson 染色發(fā)現(xiàn)， OVA 霧化8 周后，小鼠氣道血管周圍大量炎癥細(xì)胞浸潤，部分氣道管腔纖毛脫落，纖毛上皮粘膜表面黏液覆蓋，杯狀細(xì)胞增生，氣道及血管周圍大量膠原沉積，上皮下纖維明顯增多，具有慢性哮喘的主要特點(diǎn)，表明構(gòu)建小鼠模型成功。為進(jìn)一步探討乙酰化修飾位點(diǎn)H2BK16ac 與慢性哮喘之間的關(guān)系，我們采用Western blot 檢測發(fā)現(xiàn)慢性哮喘時(shí)肺組織中H2BK16ac 表達(dá)水平明顯增多，免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示慢性哮喘時(shí)H2BK16ac 高表達(dá)于肺組織氣道纖毛柱狀上皮細(xì)胞、氣道及血管旁炎癥細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞，尤其在新生或重塑的血管周圍H2BK16ac 表達(dá)水平明顯升高。眾所周知，慢性哮喘時(shí)嗜酸性粒細(xì)胞、T 淋巴細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等眾多細(xì)胞均被激活，參與氣道炎癥、氣道重塑和氣道高反應(yīng)的發(fā)生[5]。同時(shí)，慢性哮喘時(shí)肺組織中血管平滑肌的表型、結(jié)構(gòu)和功能均有不同程度的改變，參與血管再生和重塑的發(fā)生[6,7]。綜合H2BK16ac 在慢性哮喘肺組織中的表達(dá)分布，我們推測H2BK16ac 很可能與慢性哮喘時(shí)上述細(xì)胞異常的基因表達(dá)有關(guān)。

組蛋白的乙?；揎椩谌旧|(zhì)重塑和基因表達(dá)過程中發(fā)揮重要作用，組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶通過乙酰化修飾，使得基因啟動子區(qū)的可接近性增加，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子與DNA 的結(jié)合，啟動轉(zhuǎn)錄和DNA 表達(dá)[8]。然而在組蛋白八聚體中存在眾多的乙?；揎椢稽c(diǎn)，各個(gè)位點(diǎn)的作用和保守性并不完全一致，其中H3 和H4 上乙酰化位點(diǎn)相對保守，如H3K9、H3K14、H3K18、H3K23、H4K5、H4K8、H4K12等，而H2A 和H2B 上乙?；稽c(diǎn)則相對不保守[9]。近年來組蛋白上相關(guān)位點(diǎn)乙酰化修飾在各種病理生理過程中發(fā)揮的作用越來越受到重視[10,11]。Cui 等[12]發(fā)現(xiàn)慢性哮喘時(shí)肺組織中CD4+T 淋巴細(xì)胞中H3K9、H3K14、H3K27、H3K18、H4K16 的乙?；揎椝缴?，與Notch1 啟動子表觀遺傳狀態(tài)密切相關(guān)。Iwanowycz 和Zsolt 等[13,14]發(fā)現(xiàn)H3K27 的乙?；揎椝街苯佑绊懢奘杉?xì)胞啟動子區(qū)M1 型和M2 型轉(zhuǎn)錄因子（STAT1 和STST6）的結(jié)合水平，調(diào)控其下游基因的轉(zhuǎn)錄激活，最終影響巨噬細(xì)胞M1/M2 極化過程。

綜上所述，H2BK16 的乙?；揎椇芸赡芘c慢性哮喘時(shí)異常基因表達(dá)密切相關(guān)，明確H2BK16ac所調(diào)控的下游轉(zhuǎn)錄因子有望從表觀遺傳的角度闡明慢性哮喘的發(fā)病機(jī)制，為慢性哮喘的治療提供新的靶點(diǎn)。