p-CREB 在小鼠植入前胚的表達(dá)及其與2- 細(xì)胞阻滯的關(guān)系

史河秀，許頌華，王世鄂*

（1福建衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院基礎(chǔ)部，福建福州 350101；2福建醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖與組織胚胎學(xué)系，福建福州 350108）

從新的胚胎基因組中激活基因表達(dá)為哺乳動(dòng)物植入前胚正常發(fā)育和存活所必需。誘導(dǎo)基因表達(dá)需要一系列順式作用因子的作用，包括轉(zhuǎn)錄因子及其輔助因子，這些因子結(jié)合到基因的調(diào)節(jié)區(qū)域，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄機(jī)制的招募。轉(zhuǎn)錄因子有效性或活性的調(diào)節(jié)在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄激活和整體調(diào)節(jié)中起著重要作用。cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP-response element binding protein，CREB）家族成員對(duì)于正常的植入前發(fā)育必不可少，CREB 和激活轉(zhuǎn)錄因子1（ATF1）的缺失導(dǎo)致小鼠胚胎植入期存活能力的喪失和正常發(fā)育的失敗，表明這些是早期胚胎發(fā)育必需的轉(zhuǎn)錄因子[1,2]。但CREB 與小鼠2-細(xì)胞發(fā)育阻滯的關(guān)系尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)研究活化狀態(tài)的CREB（p-CREB）在小鼠植入前胚中的表達(dá)初步探討p-CREB 在小鼠植入前胚中的作用，p-CREB 在阻滯品系昆明(Kunming，KM)小鼠與非阻滯品系(B6C3F1)小鼠體外培養(yǎng)2-細(xì)胞胚以及B6C3F1 小鼠體外培養(yǎng)與體內(nèi)發(fā)育2-細(xì)胞胚中的表達(dá)差異，探討其與2-細(xì)胞阻滯的關(guān)系。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

KM 小 鼠、C57BL/6 雌 鼠 和C3H/He 雄 鼠 購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。B6C3F1 小鼠由C57BL/6 雌鼠和C3H/He 雄鼠雜交培育所得[3]。

2 主要試劑和儀器

Phospho-CREB (Ser133)（p-CREB）兔多克隆抗體（Cell signaling），Alexa Fluor 555 標(biāo)記山羊抗兔IgG（碧云天），DAPI（碧云天），孕馬血清促性腺激素（PMSG）（Sigma），人絨毛膜促性腺激素（hCG）（ProSpec TechnoGene），激光掃描共聚焦顯微鏡（Leica SP5）。

3 植入前胚收集

雌性B6C3F1 和KM 小鼠腹腔注射 5IU PMSG，48h 后注射 5IU hCG，隨后均與雄性KM 小鼠1:1合籠，次日檢查陰栓，有陰栓者視為已受精供本實(shí)驗(yàn)使用[3]。小鼠1-細(xì)胞胚、2-細(xì)胞胚、4-細(xì)胞胚、8-細(xì)胞胚、桑椹胚和囊胚分別于hCG 注射后27h、42h、54h、64h、72h、90h，用M2 培養(yǎng)液從雌鼠輸卵管（前期階段）或子宮（桑椹胚和囊胚）中沖洗獲得。

4 體外培養(yǎng)2-細(xì)胞胚收集

上述方法獲取的1-細(xì)胞胚，經(jīng) M2 洗滌，M16培養(yǎng)液漂洗3 次，挑取形態(tài)完好的1-細(xì)胞胚到預(yù)孵育的M16 培養(yǎng)微滴中，置于37℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于hCG 注射后42h 收集2-細(xì)胞胚。

5 激光掃描共聚焦顯微鏡檢測

上述方法獲取的植入前胚，經(jīng)0.3%PVP-PBS 清洗3 次，固定液中室溫固定1h，清洗3 次后于0.25% Triton X-100 液中室溫通透1h，阻斷液清洗3 次，阻斷液中預(yù)孵育1h，p-CREB 兔多克隆抗體（1:800）4℃孵育過夜，經(jīng)3 次洗滌后于Alexa Fluor 555 標(biāo)記山羊抗兔IgG（1:400）避光室溫孵育1h，經(jīng)3 次洗滌后置入DAPI 染液中（1:10000）室溫孵育1h，洗滌3 次。經(jīng)洗滌后移入激光掃描共聚焦顯微鏡專用玻底培養(yǎng)皿的0.3% PVP-PBS 液滴中，于激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察。543nm 波長激發(fā)檢測細(xì)胞內(nèi)Alexa Fluor 555 紅色熒光，獲取p-CREB 熒光成像；405nm 波長激發(fā)DAPI 藍(lán)色熒光，獲取細(xì)胞核熒光成像。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

激光掃描共聚焦顯微鏡所得數(shù)據(jù)使用Graphpad Prism 8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和做統(tǒng)計(jì)圖，采用方差分析法分析多樣本之間的差異，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)法比較兩組之間的差異，以P＜0.05 為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。每次實(shí)驗(yàn)各比較組同一時(shí)間同一條件進(jìn)行，各組2-細(xì)胞胚的數(shù)量在16～25 枚之間。

結(jié) 果

1 p-CREB 在小鼠植入前胚內(nèi)的分布

激光掃描共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示：p-CREB 免疫陽性反應(yīng)呈紅色熒光，胞核與DAPI 結(jié)合呈藍(lán)色熒光，p-CREB 在1-細(xì)胞胚中主要定位于細(xì)胞質(zhì)中；2-細(xì)胞胚、4 細(xì)胞胚、8-細(xì)胞胚、桑椹胚和囊胚中主要定位于細(xì)胞核內(nèi)，少量分布于細(xì)胞質(zhì)；8-細(xì)胞胚和桑椹胚的細(xì)胞核內(nèi)熒光強(qiáng)度高于前期早胚，囊胚整體熒光強(qiáng)度較高（圖1）。

2 p-CREB 在B6C3F1 和KM 小鼠2-細(xì)胞胚中的表達(dá)

p-CREB 在B6C3F1 和KM 小鼠體外培養(yǎng)2-細(xì)胞胚內(nèi)的定位基本一致，均主要定位于細(xì)胞核內(nèi)（圖2A）。KM 小鼠體外培養(yǎng)2-細(xì)胞胚核內(nèi)p-CREB熒光強(qiáng)度顯著低于B6C3F1 小鼠體外培養(yǎng)組（P＜0.01）；B6C3F1 小鼠體外培養(yǎng)2-細(xì)胞胚核內(nèi)p-CREB的熒光強(qiáng)度顯著高于B6C3F1 小鼠體內(nèi)發(fā)育組（P＜0.01）（圖2A、2B）。

圖1 p-CREB 在B6C3F1 小鼠植入前胚的分布。比例尺：15 μmFig. 1 The distribution of p-CREB in B6C3F1 mice preimplantation embryos observed by laser scanning confocal microscope. Scale bar: 15 μm

圖2 p-CREB 在KM 小鼠體外培養(yǎng)組與B6C3F1 小鼠體外培養(yǎng)組以及B6C3F1 體外培養(yǎng)組與體內(nèi)發(fā)育組的2-細(xì)胞胚核內(nèi)表達(dá)比較。A，激光掃描共聚焦顯微鏡成像；B，p-CREB 的相對(duì)熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)圖，比例尺，15 μm；* P＜0.01Fig. 2 Comparison of p-CREB expression differences in the nuclei of 2-cell embryos between KM mice and B6C3F1 mice in vitro, as well as between in vitro and in vivo of B6C3F1 mice. A, laser scanning confocal microscope images； B, statistic analysis for p-CREB immunofluorescence intensity； scale bar, 15μm； *, P＜0.01

討 論

哺乳動(dòng)物植入前胚發(fā)育問題嚴(yán)重限制了體外胚胎生產(chǎn)和輔助生殖技術(shù)的成功，雖然許多研究探索了這個(gè)問題，但它仍然有待解決。哺乳動(dòng)物植入前胚的發(fā)育遵循嚴(yán)格的時(shí)間和空間順序。小鼠受精的發(fā)生和第一次卵裂，卵母細(xì)胞的RNA 和蛋白質(zhì)被激活并啟動(dòng)和調(diào)控植入前胚發(fā)育，稱為母型調(diào)控；隨著早胚繼續(xù)發(fā)育，至2-細(xì)胞期，母源基因及蛋白開始迅速降解，此時(shí)早胚的繼續(xù)發(fā)育有賴于合子基因組的激活（zygotic gene activation，ZGA），生成新的合子型的RNA 和蛋白質(zhì)來支持后續(xù)的發(fā)育過程，即合子型調(diào)控。ZGA 的產(chǎn)物推動(dòng)2-細(xì)胞胚向4-細(xì)胞胚過渡，并在4～8 細(xì)胞階段發(fā)生中期基因組激活，并完成母型-合子型過渡。新的基因組激活產(chǎn)物進(jìn)一步促進(jìn)桑椹胚和囊胚的形成。若2-細(xì)胞期ZGA 無法順利向4-細(xì)胞胚過渡則會(huì)在2-細(xì)胞期出現(xiàn)發(fā)育阻滯，稱為2-細(xì)胞阻滯[4]。根據(jù)小鼠植入前胚在傳統(tǒng)的培養(yǎng)基（如M16）中培養(yǎng)是否會(huì)產(chǎn)生2-細(xì)胞阻滯分為阻滯品系小鼠和非阻滯品系小鼠，其中本研究使用的KM 小鼠為阻滯品系小鼠，B6C3F1 小鼠是非阻滯品系小鼠。研究發(fā)現(xiàn)，降低氧自由基、改變培養(yǎng)液成分和在培養(yǎng)液中增加褪黑素等途徑可提高2-細(xì)胞到4-細(xì)胞的過渡[5]，但其機(jī)制尚不完全明了。

CREB 是一種含有341 個(gè)氨基酸殘基的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白，屬于轉(zhuǎn)錄因子bZIP家族。CREB 調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的功能，又受到其本身磷酸化作用的調(diào)節(jié)，CREB在靜止期細(xì)胞中，以去磷酸化的形式存在，當(dāng)Ser133被磷酸化后為活化狀態(tài)，磷酸化的CREB（p-CREB）與CRE 有高度的親和力，與之結(jié)合后能使 CRE 下游基因的轉(zhuǎn)錄活性大大提高。CREB參與多種信號(hào)傳導(dǎo)過程，調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、凋亡及能量代謝等，還與多種腫瘤的生長相關(guān)。膠質(zhì)瘤患者中CREB1高表達(dá)提示預(yù)后不良，下調(diào)CREB1 表達(dá)則可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力；CREB 及p-CREB 在前列腺癌組織、體外培養(yǎng)前列腺癌細(xì)胞PC3 及LNCap中高表達(dá)，并可上調(diào)PC3 及LNCap 中增殖相關(guān)基因PCNA 的表達(dá)，提高細(xì)胞增殖水平；p-CREB 參與了子宮內(nèi)膜癌和乳腺癌的雌激素信號(hào)傳導(dǎo)等諸多實(shí)驗(yàn)表明很多腫瘤的p-CREB 增高，抑制p-CREB 表達(dá)可抑制腫瘤生長；RBM10 通過RAP1/AKT/CREB 信號(hào)通路抑制肺腺癌細(xì)胞增殖[6-9]。正常的胚胎發(fā)育涉及細(xì)胞分化和增殖過程之間的平衡，這意味著CREB在胚胎發(fā)育中也起重要作用。

Jin 等發(fā)現(xiàn)CREB1 mRNA 在植入前胚各期均有表達(dá)，CREB1 和p-CREB1 定位于植入前胚各期的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)以及2-細(xì)胞和8-細(xì)胞胚的核內(nèi)；CREB 和ATF1 活化在2-細(xì)胞胚中起重要作用[2,10]。本研究結(jié)果顯示，p-CREB 在整個(gè)胚胎植入前階段都有表達(dá)，從2-細(xì)胞胚開始主要定位于植入前胚各階段的細(xì)胞核內(nèi)，而1-細(xì)胞胚則主要定位于細(xì)胞質(zhì)，這些結(jié)果表明p-CREB 在整個(gè)植入前胚發(fā)育過程中起一定作用，而與Jin 的p-CREB1 定位不太一致，可能是PCREB1 以外還有較多其他類型的p-CREB 的原因。但從1-細(xì)胞胚到2-細(xì)胞胚，p-CREB 定位向核轉(zhuǎn)移募集現(xiàn)象和Jin 研究類似，p-CREB 是一種核轉(zhuǎn)錄因子，要行使其功能，就需要定位在細(xì)胞核內(nèi)。p-CREB的核定位在2-細(xì)胞期首次觀察到明顯增加，而2-細(xì)胞期的核募集剛好是ZGA 的最重要階段。大量參與細(xì)胞增殖、存活和分化的基因的啟動(dòng)子含有CRE 元件（CREB 結(jié)合位點(diǎn)），此時(shí)p-CREB 的核定位表明它是參與ZGA 的轉(zhuǎn)錄因子之一，在2-細(xì)胞期發(fā)揮轉(zhuǎn)錄作用。另外，8-細(xì)胞期及后期的核內(nèi)表達(dá)增強(qiáng)，提示p-CREB 在致密化和囊胚的形成以及后期胚胎發(fā)育均起重要作用。

2-細(xì)胞期也是阻滯品系小鼠發(fā)生體外發(fā)育2-細(xì)胞阻滯的時(shí)期。我們前期研究證實(shí)了KM 小鼠植入前胚體外發(fā)育時(shí)，大部分停滯在2-細(xì)胞期，即2-細(xì)胞阻滯，屬于阻滯品系小鼠；而B6C3F1 小鼠是非阻滯品系小鼠[3]，我們進(jìn)一步研究p-CREB 在阻滯品系KM 小鼠與非阻滯品系小鼠B6C3F1 小鼠體外培養(yǎng)2-細(xì)胞胚中的表達(dá)差異，結(jié)果顯示，KM 小鼠體外培養(yǎng)2-細(xì)胞胚核內(nèi)p-CREB 熒光強(qiáng)度顯著低于B6C3F1 小鼠體外培養(yǎng)2-細(xì)胞胚。這表達(dá)差異提示，KM 小鼠體外發(fā)育2-細(xì)胞阻滯可能與p-CREB表達(dá)水平低相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，CREB 可通過作用于H2O2酶來減輕氧自由基對(duì)細(xì)胞的毒性損傷作用，從而保持氧化應(yīng)激環(huán)境下的線粒體活性以促進(jìn)細(xì)胞存活。Pregi 等使用cDNA 微陣列分析表明，氧化應(yīng)激誘導(dǎo)CREB 上調(diào)，促進(jìn)DNA 修復(fù)。CREB 對(duì)參與氧化損傷的DNA 修復(fù)和細(xì)胞存活有關(guān)的多種基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，以介導(dǎo)細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞抗凋亡模式形成[11，12]。本研究結(jié)果也顯示，B6C3F1 小鼠體外培養(yǎng)2-細(xì)胞胚核內(nèi)p-CREB 的熒光強(qiáng)度顯著高于B6C3F1 小鼠體內(nèi)發(fā)育2-細(xì)胞胚，這可能與體外培養(yǎng)環(huán)境氧自由基增高等有關(guān)，體外培養(yǎng)環(huán)境變化促使p-CREB 表達(dá)增高來克服這種變化帶來的損傷，而KM 小鼠體外培養(yǎng)2-細(xì)胞胚內(nèi)p-CREB 表達(dá)水平低，令其無法克服體外培養(yǎng)環(huán)境帶來的損傷而導(dǎo)致發(fā)育阻滯。p-CREB 以何機(jī)制克服2-細(xì)胞阻滯和促進(jìn)植入前胚發(fā)育還有待進(jìn)一步研究。