多糖硫酸酯抗凝血涂層應(yīng)用于高分子醫(yī)用管路

楊雪純 ，于美麗 ，高文卿

（1.天津醫(yī)科大學(xué)三中心臨床學(xué)院，天津市人工細(xì)胞重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300170；2.天津醫(yī)科大學(xué)研究生院，天津300070；3.天津市第三中心醫(yī)院，天津市人工細(xì)胞重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300170；4.天津市第三中心醫(yī)院心臟中心，天津300170）

抗凝血涂層技術(shù)是利用化學(xué)或物理的方式，將抗凝物質(zhì)牢固地結(jié)合在管路的內(nèi)表面，抗凝血涂層技術(shù)的應(yīng)用可以減少血液凈化過(guò)程中的炎癥反應(yīng)，提高管路系統(tǒng)的生物相容性[1]。材料表面肝素化是提高材料表面血液相容性和生物相容性的有效手段。肝素是一種反應(yīng)活性高、抗凝血性突出的天然抗凝劑，通過(guò)和抗凝血酶III、肝素結(jié)合蛋白和血小板因子等活性物質(zhì)結(jié)合來(lái)發(fā)揮其抗凝血作用。研究顯示，肝素在具有抗凝血活性的同時(shí)，也具有抗血小板活性，可引發(fā)不正常出血等副作用，且存在攜帶動(dòng)物致敏原或病毒等安全隱患[2]。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟趯ふ揖哂锌鼓锘钚缘奈镔|(zhì)，作為肝素替代品，并試圖降低材料來(lái)源和制作的成本。肝素發(fā)揮抗凝血作用與分子結(jié)構(gòu)的特異性、硫酸基含量以及負(fù)電性有關(guān)。多糖的單糖分子上羥基與硫酸反應(yīng)可以得到多糖硫酸酯，抗凝血機(jī)制與肝素相似，而且多糖硫酸酯還具有抗腫瘤、抗病毒、抗氧化性和調(diào)節(jié)免疫能力等[3]，而且副作用低、生物相容性好、無(wú)毒無(wú)害，是一種良好的抗凝血?jiǎng)?。Anastase等[4]研究了葡聚糖衍生物和天然褐藻多糖中的免疫調(diào)節(jié)特性，證明了巖藻聚糖和右旋糖酐衍生物具有良好的免疫調(diào)節(jié)作用，可以作為新的抗凝血藥物或用于生物相容性材料涂層。

本研究在對(duì)醛基化海藻酸鈉抗凝血涂層的研究基礎(chǔ)[5-7]上，主要選取生物相容性較好的海藻酸鈉以及具有良好的抗炎性和抗病毒性的黃芪多糖和白芨多糖三種植物多糖，采用惰性化濃硫酸法對(duì)其進(jìn)行硫酸化修飾，并采用共價(jià)鍵結(jié)合法將修飾后的多糖硫酸酯涂層物固定于體外循環(huán)管路材料表面。通過(guò)對(duì)涂層管路表面形態(tài)的分析和表面凝血時(shí)間的對(duì)比，篩選出抗凝效果較好的植物多糖硫酸酯。

硫酸酯化多糖是一類單糖分子上羥基被硫酸根取代的多糖，也稱硫酸多糖或多糖硫酸酯[8]。海藻酸鈉具有良好的生物相容性和抗凝血性，價(jià)格低廉，容易獲得，廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)材料和生物工程領(lǐng)域。以硫酸酯基取代海藻酸鈉單糖上的羥基即得到海藻酸鈉硫酸酯，具有良好的抗凝血活性，可以降低血脂和血液粘稠度，還具有清除血漿脂蛋白和纖維蛋白原的作用。Fan等[9]研究了影響海藻酸鈉硫酸鹽取代度（DS）的因素，并發(fā)現(xiàn)高濃度和高取代度的海藻酸鈉硫酸酯能夠有效抑制內(nèi)源性凝血途徑。黃芪多糖是一種免疫促進(jìn)劑或調(diào)節(jié)劑，黃芪多糖單糖分子中的羥基與硫酸反應(yīng)，在一定取代度范圍內(nèi)，硫酸取代度越大，抗凝血活性越強(qiáng)[10]，同時(shí)黃芪多糖硫酸酯具有良好的抗病毒、抗腫瘤、抗輻射、抗氧化等作用[11]。白芨多糖具有收斂止血、消腫生肌等功效，俞林花等[12]發(fā)現(xiàn)，白芨多糖能夠有效促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖和膠原的合成，從而可以促進(jìn)潰瘍創(chuàng)面的愈合；陳景耀等[13]發(fā)現(xiàn)白芨多糖硫酸酯化處理后表現(xiàn)出很強(qiáng)的清除超氧陰離子自由基的作用，且在低濃度時(shí)表現(xiàn)出較強(qiáng)的清除羥基自由基的作用，而目前硫酸化白芨多糖在抗凝血方面并沒有深入的研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 海藻酸鈉（天津市光復(fù)科技有限公司）；白芨（河南世濟(jì)中藥材有限公司）；黃芪（四川名都藥有限公司）；氯化鈉（天津市光復(fù)科技有限公司）；乙醇（天津市中瑞潔康科技有限公司）；聚乙烯亞胺（SIGMA-ALDRICH，美國(guó)）；氰基硼氫化鈉（SIGMA-ALDRICH，美國(guó)）；98%濃硫酸（天津市光復(fù)科技有限公司）；亞硝酸鈉（SIGMA-ALDRICH，美國(guó)）。醫(yī)用PVC（天津市塑料研究所）；透析袋（天津市聯(lián)星生物有限公司）；24孔細(xì)胞培養(yǎng)板（Corning，美國(guó)）；離心機(jī)（Eppendorff，德國(guó)）；凝血自動(dòng)分析儀（DiagnosticaStago，法國(guó)）；紅外分光光度計(jì)（NICOLET 6700，Thermo，美國(guó)）；掃描電鏡（Phenom，F(xiàn)EI Company，美國(guó)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 植物多糖的提取

1.2.1.1 黃芪多糖的提取與純化：采用堿提醇沉的方法提取黃芪多糖[14]。精密稱取300 g黃芪并粉碎，向三頸燒瓶中加入水2 800 mL，95%乙醇150 mL，1 mol/L NaOH溶液，調(diào)節(jié)pH至12，浸泡24 h后，加熱至80～85℃，攪拌6 h后，過(guò)濾棄去殘?jiān)瑢⑸锨逡赫舭l(fā)濃縮至1 500 mL，冷卻至室溫后，倒入2倍體積的95%乙醇中，有白色絮狀物析出，靜置，將上層清液倒出，取出沉淀，干燥，得粗提取黃芪多糖。

1.2.1.2 白芨多糖的提取與純化：采用水提醇沉的方法提取白芨多糖[15]。準(zhǔn)確稱取240 g白芨并打碎，向三頸燒瓶中加入5 000 mL水，緩慢加入白芨粉末，控制溫度在75～80℃，攪拌4～5 h后，過(guò)濾棄去殘?jiān)?，得到白芨多糖提取物。將提取物加熱濃縮至3 000 mL，再倒入2倍體積的95%乙醇中，有白色絮狀物析出，靜置，將上層清液倒出，取出沉淀，干燥，得到粗提取白芨多糖。

1.2.2 多糖的硫酸化處理

1.2.2.1 海藻酸鈉硫酸酯（SAS）的制備：將海藻酸鈉脫水干燥。根據(jù)文獻(xiàn)[2,16]的方法，按照濃硫酸和海藻酸鈉物質(zhì)的量之比為6：1，向濃硫酸中迅速加入海藻酸鈉，0℃攪拌反應(yīng)4 h后，將反應(yīng)體系調(diào)節(jié)pH至弱堿性，得到淡黃色的海藻酸鈉硫酸酯溶液。將所得溶液透析處理20 h，倒入2倍體積的95%乙醇中，有淡黃色沉淀析出。靜置，將沉淀濾出并干燥，得到硫酸化海藻酸鈉。

1.2.2.2 黃芪多糖硫酸酯（SAPS）的制備：采用與上述相同的方法制備黃芪多糖硫酸酯。

1.2.2.3 白芨多糖硫酸酯（SBPS）的制備：采用與上述相同的方法制備白芨多糖硫酸酯。

1.2.3 材料表面預(yù)處理和表面修飾

1.2.3.1 PVC管路材料酸化預(yù)處理：配制濃度分別為30%、50%和70%的酸溶液。將PVC管路材料剪成小段備用。將剪好的PVC管路材料浸入到不同濃度的酸溶液中，酸化處理5 min后，用蒸餾水沖洗干凈并干燥。選取透明度好、表面形態(tài)結(jié)構(gòu)完整的PVC管路待用。

1.2.3.2 酸化PVC管路材料的聚氨基化處理：將酸處理后的PVC管路材料浸入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%的PEI溶液中進(jìn)行聚氨基化處理20 min，將處理后的管路材料取出，用蒸餾水清洗干凈并干燥。

1.2.3.3 涂層物的制備：將肝素鈉（效價(jià)為197.2單位/mg）充分溶解于去離子水中，加入一定量亞硝酸鈉，在酸性條件下冰浴攪拌反應(yīng)2 h；調(diào)定溶液pH至中性，得到低分子肝素鈉（LMWH）溶液；將所得LMWH溶液進(jìn)行透析處理24 h，其間更換去離子水3次，濾出分子量過(guò)小的低分子肝素[17]。

用同樣的方法對(duì)海藻酸鈉硫酸酯、黃芪多糖硫酸酯及白芨多糖硫酸酯進(jìn)行醛基化處理。

1.2.3.4 材料的表面修飾：配制不同濃度的多糖硫酸酯涂層物溶液。配制0.1 g/L LMWH溶液。向各反應(yīng)體系中加入1.75 g NaCl和20 mg NaBH3CN充分混勻，調(diào)節(jié)溶液pH為3.5，將PVC管路材料浸沒入反應(yīng)液中，40℃恒溫水浴震蕩反應(yīng)2 h。取未經(jīng)處理的PVC管路材料，浸入相同體積的蒸餾水中，在相同條件下處理2 h。

1.2.4 涂層表面形貌及功能基團(tuán)分析

1.2.4.1 涂層表面形貌分析：將涂層后的管路材料充分干燥，剪開管路暴露出涂層表面，樣品表面噴金，通過(guò)掃描電鏡觀察涂層前后材料表面形貌變化。

1.2.4.2 涂層表面功能基團(tuán)特性分析：將涂層后的管路材料充分干燥，剪開管路暴露出涂層表面，用紅外探頭掃描涂層前后材料表面，分析涂層表面的特征基團(tuán)；紅外掃描波長(zhǎng)范圍650～4 000 nm。

1.2.5 涂層表面凝血時(shí)間測(cè)定 取健康新鮮全血，離心處理10 min，獲得貧血小板血漿（Platelet-poor plasma，PPP），測(cè)定凝血常規(guī)四項(xiàng)，即部分凝血活酶時(shí)間（APTT）、凝血酶原時(shí)間（PT）、凝血酶時(shí)間（TT）和纖維蛋白原（FIB）；將不同涂層材料剪成表面積約為0.25 cm2的碎片，置于24孔培養(yǎng)板內(nèi)；每個(gè)涂層樣品孔中分別加入PPP，37℃條件下恒溫孵育反應(yīng)2 h；取出孵育后的血漿，加入離心管內(nèi)，再次測(cè)定四項(xiàng)凝血常規(guī)指標(biāo)，計(jì)算并分析每組樣品凝血時(shí)間差值和變化。

1.2.6 實(shí)驗(yàn)分組 根據(jù)涂層物類型和涂層物濃度將實(shí)驗(yàn)分為以下組：空白對(duì)照組（Em組）、低分子肝素組（LMWH組）、硫酸化海藻酸鈉組（SAS1組、SAS2組、SAS3組）、硫酸化黃芪多糖組（SAPS1組、SAPS2組、SAPS3組）、硫酸化白芨多糖（SBPS1組、SBPS2組、SBPS3組）。為保證硫酸酯化反應(yīng)過(guò)程中濃硫酸的量的充足和實(shí)驗(yàn)操作的安全性，初選取磺化劑中濃硫酸和多糖的物質(zhì)的量之比為6：1。

表1 不同多糖硫酸酯涂層物種類和濃度Tab 1 Variety and concentration of different polysaccharides sulphate coating

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本文中的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析使用SPSS 23.0軟件和Origin 8.0軟件完成。

2 結(jié)果

2.1 酸化預(yù)處理表面篩選 觀察酸化預(yù)處理后材料透明度和表面形態(tài)的完整性，篩選出經(jīng)30%酸溶液預(yù)處理的PVC管路材料。

2.2 涂層表面形貌及功能基團(tuán)分析 使用掃描電鏡對(duì)涂層表面形態(tài)進(jìn)行分析，LMWH涂層（b）分布較均勻，海藻酸鈉硫酸酯涂層（c-e）分布較不均，黃芪多糖硫酸酯涂層（f-h）和白芨多糖硫酸酯涂層（i-k）分布相比前者較均勻，管路材料表面紋理清晰可見；涂層管路和未涂層管路相比，表面可見明顯涂層物，但表面結(jié)構(gòu)未有明顯變化，可見涂層過(guò)程未破壞管路材料表面的物理結(jié)構(gòu)（見圖1）。

圖1 涂層管路材料表面形貌分析Fig 1 Surface morphology analysis of coated pipeline material

2.3 涂層表面功能基團(tuán)特性分析 通過(guò)紅外光譜法檢測(cè)到多糖涂層管路組和肝素涂層管路組在波長(zhǎng)約為3 400 cm-1處均有一個(gè)較淺的特征吸收峰，而空白對(duì)照組沒有這個(gè)吸收峰，表明實(shí)驗(yàn)中多糖硫酸酯和低分子肝素均可以固定在管路材料表面。波長(zhǎng)為1 020 cm-1處為硫酸根基團(tuán)（-SO3）的反對(duì)稱伸縮振蕩吸收峰，通過(guò)紅外光譜可以看出，多糖硫酸酯涂層組和低分子肝素涂層對(duì)照組具有硫酸根基團(tuán)的吸收峰，而空白對(duì)照組沒有，說(shuō)明通過(guò)硫酸化處理后的多糖硫酸酯具有與低分子肝素抗凝血作用相同的硫酸根基團(tuán)（-SO3），并且已經(jīng)固定于材料表面（圖 2）。

圖2 涂層管路材料紅外表征圖Fig 2 Infrared characteristics of coated pipeline materials

2.4 涂層表面凝血功能評(píng)價(jià) 通過(guò)對(duì)反應(yīng)前后以及不同涂層材料凝血常規(guī)指標(biāo)的分析，空白對(duì)照組和未經(jīng)涂層組對(duì)比，APTT未見明顯差異，而LMWH組 APTT 明顯延長(zhǎng)（P＜0.05）（表 2）?？梢娊?jīng)過(guò)涂層的管路APTT均顯著高于多糖空白對(duì)照組，說(shuō)明材料表面的抗凝血性能有明顯改善（P＜0.05）。SAS1、SAS2 組（表 3）、SAP1、SAPS2 組（表 4）和 SBPS1、SBPS2組（表5）3種多糖硫酸酯涂層的管路之間APTT無(wú)顯著性差異（P＞0.05），但均顯著長(zhǎng)于空白對(duì)照組（P＜0.05）。SAS3、SAPS3和SBPS3之間APTT未有明顯差異（P＞0.05），但均長(zhǎng)于空白對(duì)照組和單一多糖涂層組（P＜0.05），且與LMWH涂層組相比APTT無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。說(shuō)明多糖硫酸酯涂層組和多糖硫酸酯-LMWH復(fù)合涂層組均有良好的抗凝血性能。

表2 對(duì)照組材料表面凝血四項(xiàng)（±s,n=6）Tab 2 Four items of clotting routine of Material surface in control group（±s,n=6）

表2 對(duì)照組材料表面凝血四項(xiàng)（±s,n=6）Tab 2 Four items of clotting routine of Material surface in control group（±s,n=6）

涂層種類未涂層 空白對(duì)照 L M W H涂層P T-s e c 6 1 2.8±1.0 0 1 3.4±1.2 1 1 6.1±1.5 4 A P T T 6 3 5.9±2.3 5 3 6.9±4.1 1 7 1.6±1 6.6 T T 6 1 3.3±4.4 9 1 8.2±1.4 2 4 9.5±8.6 1 F I B-s e c 6 1 7.8±1.0 0 1 6.7±4.5 1 1 4.6±3.2 0 n

表3 海藻酸鈉硫酸酯涂層凝血四項(xiàng)（±s,n=6）Tab 3 Four items of clotting routine of Sodium alginate sulphatecoating（±s,n=6）

表3 海藻酸鈉硫酸酯涂層凝血四項(xiàng)（±s,n=6）Tab 3 Four items of clotting routine of Sodium alginate sulphatecoating（±s,n=6）

涂層種類S A S 1 S A S 2 S A S 3 P T-s e c 6 1 4.7±1.0 7 1 3.8 8±0.8 4 1 4.7±1.0 5 A P T T 6 4 4.6±2.8 8 4 4.1 5±1.0 6 6 4.2±1 3.6 7 T T 6 1 9.4±1.9 4 1 2.4 8±3.1 5 5 0.6±1 4.9 4 F I B-s e c 6 1 3.0±2.3 2 2 0.4 5±1.2 4 1 5.9±4.2 9 n

表4 黃芪多糖硫酸酯涂層凝血四項(xiàng)（±s,n=6）Tab 4 Four items of clotting routine of Astragalus polysaccharide sulfate coating （±s,n=6）

表4 黃芪多糖硫酸酯涂層凝血四項(xiàng)（±s,n=6）Tab 4 Four items of clotting routine of Astragalus polysaccharide sulfate coating （±s,n=6）

涂層種類S A S 1 S A S 2 S A S 3 P T-s e c 6 1 4.2±0.4 6 1 3.9 8±1.3 3 1 5.1±0.7 1 A P T T 6 4 4.6±2.8 8 4 2.1 3±3.7 1 7 9.9±8.4 1 T T 6 1 8.7±1.5 7 1 3.2 0±4.0 4 1 0 4.4±5 6.2 8 F I B-s e c 6 1 4.8±3.4 4 1 9.4 8±1.2 2 1 3.8±3.6 1 n

表5 白芨多糖硫酸酯涂層凝血四項(xiàng)（±s,n=6）Tab 5 Four items of clotting routine of Bletillastriata polysaccharide sulfate coating （±s,n=6）

表5 白芨多糖硫酸酯涂層凝血四項(xiàng)（±s,n=6）Tab 5 Four items of clotting routine of Bletillastriata polysaccharide sulfate coating （±s,n=6）

涂層種類S A S 1 S A S 2 S A S 3 P T-s e c 6 1 4.0±0.7 1 1 3.2 0±0.6 9 1 5.4±1.7 3 A P T T 6 4 5.1±5.7 7 4 3.4 0±3.5 1 7 6.2±7.4 2 T T 6 1 8.2±1.0 3 1 4.8 5±3.2 7 5 6.8±2 6.8 4 F I B-s e c 6 1 9.1±4.4 3 1 7.8 0±0.8 0 1 1.6±4.4 4 n

3 討論

高文卿[5-7]、李金友[18-19]等分別制備了醛基化海藻酸鈉-肝素復(fù)合涂層和氧化海藻酸鈉涂層，均取得了良好的抗凝血效果。本研究在此基礎(chǔ)上采用濃硫酸法修飾植物多糖，并制備了多糖硫酸酯涂層。研究結(jié)果顯示，天然植物多糖經(jīng)硫酸酯化修飾后，可以獲取植物多糖硫酸酯，具有一定的抗凝血功能。紅外譜圖掃描顯示3種多糖硫酸酯及LMWH均已固定于材料表面，證實(shí)了經(jīng)過(guò)重氮化處理可以使多糖硫酸酯及LMWH分子帶有活性醛基，帶有醛基的多糖硫酸酯及LMWH與經(jīng)過(guò)酸化和聚氨基化預(yù)處理的聚氯乙烯管道進(jìn)行了有效的共價(jià)交聯(lián)。掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)涂層過(guò)程并未改變材料表面的物理結(jié)構(gòu)。

在血液相容性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)中，LMWH涂層物通過(guò)阻斷內(nèi)源性凝血途徑可顯著延長(zhǎng)凝血時(shí)間，具有顯著抗凝效果，主要表現(xiàn)為APTT明顯延長(zhǎng)。海藻酸鈉硫酸酯涂層物、黃芪多糖硫酸酯和白芨多糖硫酸酯均可延長(zhǎng)APTT時(shí)間，具有一定的抗凝效果，3種多糖硫酸酯涂層物的抗凝血性能并無(wú)顯著性差異，考慮實(shí)驗(yàn)中選取的涂層濃度較低。SAS-LMNH復(fù)合涂層、SAPS-LMWH復(fù)合涂層和SBPS-LMWH復(fù)合涂層抗凝效果劣于LMWH涂層，但同樣可顯著延長(zhǎng)APTT及TT時(shí)間，具有較好的抗凝效果。經(jīng)涂層的材料表面主要表現(xiàn)為APTT明顯延長(zhǎng)，證實(shí)了多糖硫酸酯的抗凝血機(jī)制與低分子肝素相似，通過(guò)阻斷內(nèi)源性凝血途徑保持了良好的抗凝功效。

本研究通過(guò)定性和定量分析，初步證明了植物多糖硫酸酯制備抗凝血涂層的可行性。天然植物多糖經(jīng)硫酸酯化處理后，可以具有良好的抗凝血性質(zhì)，并且通過(guò)共價(jià)交聯(lián)的方式與管路材料有效結(jié)合，發(fā)揮抗凝血作用。對(duì)于具有促凝血作用的白芨多糖，經(jīng)硫酸化處理后，被證實(shí)具有抗凝血性，為多糖修飾研究提供了新思路。濃硫酸法操作簡(jiǎn)單，不會(huì)產(chǎn)生有機(jī)溶劑污染，但有研究表明該方法修飾所獲得的多糖硫酸酯取代度較低，因此硫酸化修飾的不同方法和條件對(duì)多糖生物活性的影響需做進(jìn)一步探究。此外，多糖硫酸酯涂層在不同高分子醫(yī)用材料中的應(yīng)用價(jià)值，以及涂層材料的抗病毒性、抗炎性以及穩(wěn)定性等安全特性，有待進(jìn)一步研究驗(yàn)證。