尾靜脈注射方法考察Stearic-PEI/SPIO納米基因載體的基因轉(zhuǎn)染性能及磁共振可視化效果研究

謝麗斯 高 琳 王志勇* 隆曉菁 鄭海榮*

（中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院 深圳 518055）

1 引 言

安全高效的基因轉(zhuǎn)染體系以及對基因載體的無創(chuàng)性示蹤評估方法是目前基因治療研究中的兩個(gè)重要課題。聚乙烯亞胺(Polyethyleneimine，PEI)是現(xiàn)階段較成功的陽離子非病毒性基因傳遞載體之一[1]，其中，分子量為 25000 g/mol 的支鏈 PEI 已被認(rèn)為是轉(zhuǎn)染試劑中的金標(biāo)準(zhǔn)，并廣泛應(yīng)用于體內(nèi)及體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。但由于高分子量 PEI 具有較高的細(xì)胞毒性，其在臨床上的應(yīng)用潛能受到制約。而低分子量的 PEI，如 PEI 600 g/mol，雖細(xì)胞毒性較低，但其較低的正電荷密度會造成轉(zhuǎn)染性能不佳。因此，近期已報(bào)道的 PEI 實(shí)驗(yàn)主要集中于兩個(gè)方面的研究：高分子量 PEI 的低毒化處理以及對低分子量 PEI 的功能化修飾以提高其轉(zhuǎn)染性能。其中，由于低分子量 PEI 的體內(nèi)代謝相對較容易，且只需通過簡單的二硫鍵修飾或疏水自組裝就能構(gòu)建高電荷密度生物可降解大分子或納米結(jié)構(gòu)而備受關(guān)注。

針對基因載體的可視化示蹤，近年來已有很多相應(yīng)的報(bào)道，其中磁共振成像(MRI)具有較高的空間分辨率、較好的軟硬組織成像、無創(chuàng)性觀測以及生理功能性信息獲取等優(yōu)點(diǎn)，在醫(yī)療診斷特別是分子影像研究方面發(fā)揮著重要作用。隨著納米技術(shù)和 MR 分子影像的發(fā)展與結(jié)合，以超順磁性氧化鐵(SPIO)納米晶體構(gòu)建的 MR 納米探針得到了極大的關(guān)注。由于 SPIO的基本化學(xué)成分四氧化三鐵(Fe3O4)能夠在細(xì)胞內(nèi)得到有效降解，使其擁有良好的生物相容性和磁化效果，已經(jīng)應(yīng)用于臨床 MR 成像[2]。因此設(shè)計(jì)研發(fā)基因轉(zhuǎn)染與磁學(xué)性能兼?zhèn)涞亩喙δ艽殴舱穹肿犹结樐軌驅(qū)騻鬏斶M(jìn)行有效的評估。

本文嘗試將 PEI600 經(jīng)硬脂酸修飾后包封疏水性SPIO 納米粒子構(gòu)建硬脂酸-PEI600/SPIO 納米復(fù)合材料，然后通過靜電吸附 DNA 實(shí)現(xiàn)基因負(fù)載和尾靜脈注射完成基因回輸。本文主要就硬脂酸-PEI600/SPIO 納米復(fù)合材料經(jīng)由尾靜脈注射方法是否能夠有效完成基因的有效遞送進(jìn)行相關(guān)探討。

2 材料與方法

2.1 硬脂酸-PEI600/SPIO/DNA 復(fù)合物的制備

依照已有文獻(xiàn)報(bào)道[3-5]進(jìn)行硬脂酸-PEI600 大分子合成，并制備 SPIO 納米晶體。硬脂酸-PEI600/SPIO/DNA 復(fù)合物的制備按照以下步驟：將硬脂酸-PEI600/SPIO 水溶性納米復(fù)合物與 DNA(含LacZ 報(bào)告基因)溶液相混合，用移液器輕柔上下吹吸混合，于室溫放置 15～30 min，此處所制備硬脂酸-PEI600/SPIO/DNA 復(fù)合物的 N/P 比為 20( N/P為 PEI 中的氨基基團(tuán)/DNA 中的磷酸基團(tuán)的比例)。

2.2 MR 成像

6 只 BABL/c 小鼠隨機(jī)分成 A、B 二組，每組 3只。小鼠經(jīng) 1% 戊巴比妥鈉腹腔麻醉后，分別從尾靜脈注射硬脂酸-PEI600/SPIO/DNA 生理鹽水稀釋液(實(shí)驗(yàn)組)、生理鹽水(對照組)，其中每只小鼠注射的DNA 含量為 5 μg，應(yīng)用臨床西門子 3T MR 掃描儀進(jìn)行成像檢測。采用小鼠線圈，取小鼠俯臥位，先進(jìn)行 TSE 序列平掃，然后分別于尾靜脈注射 30 分鐘、48 小時(shí)后再次掃描。掃描序列及參數(shù)：TSE 序列，TR＝3000 ms，TE＝48 ms，F(xiàn)OV＝25×25.5 mm，層厚 1 mm，F(xiàn)A180°，對小鼠行橫斷面和冠狀面進(jìn)行成像。在 T2 加權(quán)成像圖片上測量平掃前后 2 組實(shí)驗(yàn)動物各時(shí)間點(diǎn)肝臟的平均信號強(qiáng)度(Signal Intensity，SI)。最后應(yīng)用 eFilm1.5.3 版本軟件，選取肝臟組織局部信號相對均勻、無明顯偽影的 4 個(gè)區(qū)域，讀取信號值并計(jì)算平均值。

2.3 組織學(xué)檢查

MR 掃描之后取實(shí)驗(yàn)組和對照組肝臟組織，通過TOC 包埋冷凍后進(jìn)行連續(xù)切片，切片厚度 10 mm。然后用 2.5% 戊二醛固定 10 分鐘，PBS 水洗 5 分鐘后進(jìn)行 X-Gal 染色，同樣的切片預(yù)處理方法進(jìn)行普魯士藍(lán)染色、核固紅染色。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用 SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)分析，其中，取兩組獨(dú)立樣本均數(shù)進(jìn)行 t 檢驗(yàn)、協(xié)方差分析；雙尾檢驗(yàn)比較硬脂酸-PEI600/SPIO/DNA 納米復(fù)合物組和對照組肝臟 SI 值的差異，當(dāng) P＜0.05 時(shí)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 MR 成像結(jié)果

圖1、圖 2 顯示，與注射生理鹽水的對照組相比，實(shí)驗(yàn)組注射硬脂酸-PEI600/SPIO/DNA 納米復(fù)合物 0.5 小時(shí)后的 T2 加權(quán)成像信號值顯著降低，降低64.7%。48 小時(shí)后，硬脂酸-PEI600/SPIO/DNA 實(shí)驗(yàn)組信號強(qiáng)度略有恢復(fù)，但仍保持信號相對較低值。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，實(shí)驗(yàn)組與對照組在 T2 加權(quán)成像信號值變化差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。

圖1 生理鹽水組與納米復(fù)合物組肝臟 T2 加權(quán)成像

圖2 生理鹽水組與納米復(fù)合物組 T2 加權(quán)信號值比較

3.2 組織學(xué)檢查

顯微鏡觀察普魯士藍(lán)染色結(jié)果顯示：注射生理鹽水的對照組未見任何的藍(lán)染顆粒(見圖 3a)，而注射硬脂酸-PEI600/SPIO/DNA 納米復(fù)合物實(shí)驗(yàn)組的正常肝臟組織和血管內(nèi)皮細(xì)胞均出現(xiàn)藍(lán)染顆粒(見圖 3b)。實(shí)驗(yàn)過程中表達(dá) LacZ 基因的細(xì)胞經(jīng) X-Gal 染色后將會呈現(xiàn)藍(lán)染顆粒。本研究的 X-Gal 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，生理鹽水組未見藍(lán)色斑點(diǎn)，而實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)藍(lán)染的陽性細(xì)胞(見圖 3 c、d)。

4 討 論

PEI 陽離子大分子已被廣泛作為非病毒型基因載體?；?Fe3O4組分構(gòu)建的 SPIO 納米粒子也已進(jìn)入臨床應(yīng)用。SPIO納米粒子優(yōu)良的生物可降解性及較高的馳豫效能也使它在磁共振分子影像中備受關(guān)注。

圖3 肝臟組織切片普魯士藍(lán)染色及 X-Gal 染色

本研究利用兩親性硬脂酸-PEI600 大分子與疏水SPIO 納米晶體通過自組裝作用構(gòu)建納米復(fù)合基因載體，應(yīng)用聚陽離子水溶液中呈現(xiàn)的正電性有效負(fù)載基因質(zhì)粒。該納米復(fù)合材料通過尾靜脈注入小鼠體內(nèi)，經(jīng)臨床 3T MR 掃描結(jié)果顯示，小鼠肝臟 T2 加權(quán)成像信號強(qiáng)度顯著降低，48 h 后，肝臟信號強(qiáng)度雖有所回升，但仍較注射生理鹽水對照組信號強(qiáng)度低。

文獻(xiàn)報(bào)道[6]的經(jīng)由聚己內(nèi)酯-聚乙二醇嵌段共聚物包裹 SPIO 構(gòu)建的納米粒子在尾靜脈注射 48 h 后MRI 信號值回升到正常值。但本研究中實(shí)驗(yàn)組的MRI 信號值仍然維持在較低位，造成這一原因可能是由于硬脂酸-PEI600/SPIO 納米復(fù)合物能夠有效地進(jìn)入肝臟細(xì)胞從而延長了代謝時(shí)間。從組織學(xué)檢查結(jié)果可以看到，48 h 后組織切片顯示硬脂酸-PEI600/SPIO/DNA 復(fù)合物已經(jīng)進(jìn)入肝臟組織細(xì)胞中，這與MRI 成像結(jié)果一致；此外，這也證明 LacZ 基因在組織細(xì)胞中有一定量的表達(dá)，但尾靜脈注射法表達(dá)量較先前報(bào)道的膽囊注射法表達(dá)量低[7]。造成這一現(xiàn)象的原因可能是由于正電性納米粒子在血液中會接觸或附著大量蛋白、細(xì)胞等負(fù)電性物質(zhì)，造成基因與載體的脫離或形成遮蔽，影響了基因表達(dá)效率，而此推測尚需后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行佐證。PEI 作為基因載體時(shí)，分子量越大，其電荷量也越大，細(xì)胞毒性也越強(qiáng)[8-10]。而文獻(xiàn)報(bào)道[11-13]中將膽固醇、聚氧乙烯硬脂酸酯[14]等脂溶性的物質(zhì)接枝到 PEI 上均能與 DNA 復(fù)合形成單分散性很好的納米粒子。

本研究通過硬脂酸修飾低分子量 PEI，利用其脂質(zhì)特性的親油基團(tuán)或許能夠增強(qiáng)復(fù)合物與細(xì)胞膜的結(jié)合能力，促進(jìn)被細(xì)胞吸收的機(jī)率，從而可以提高轉(zhuǎn)染效率，此結(jié)論同樣需要進(jìn)一步證明。綜上所述，采用硬脂酸-PEI600 復(fù)合 SPIO、DNA 形成 N/P 為 20的復(fù)合物，在肝臟組織中具有很好的磁共振成像效果。該納米顆粒兼具基因轉(zhuǎn)染與磁學(xué)性能，可作為潛在的 MRI 可見基因載體，并有望在基因治療中得到進(jìn)一步的應(yīng)用。

[1]Merdan T, Kopecek J, Kissel T. Prospects for cationic polymers in gene and oligonucleotide therapy against cancer [J].Advanced Drug Delivery Reviews, 2002, 54(5): 715-758.

[2]Margolis D J , Hoffman J M, Herfkens R J, et al. Molecular imaging techniques in body imaging [J]. Radiology, 2007,245(2): 333-356.

[3]Antonietti L, Aymonier C, Schloterbeck U, et al. Coreshell-structured highly branched poly(ethylenimine amide)s:synthesis and structure [J]. Macromolecules, 2005, 38 (14):5914-5920.

[4]Sun S H, Zeng H, Robinson D B, et al. Monodisperse MFe2O4(M =Fe, Co, Mn)nanoparticles [J]. Jouranl of the Amerian Chemical Society, 2004, 126 (1): 273-279.

[5]Sun S H, Zeng H. Size-controlled synthesis of magnetite nanoparticles [J]. Journal of the American Chemical Society,2002, 124(28): 8204-8205.

[6]Lu J, Ma S, Sun J, et al. Manganese ferrite nanoparticle micellar nanocomposites as MRI contrast agent for liver imaging [J].Biomaterials, 2009, 30(15): 2919-2928.

[7]Gao L, Long X, Wang Z, et al. Eff i cacy of MRI visible iron oxide nanoparticles in delivering minicircle DNA into liver via intrabiliary infusion [J]. Biomaterials, 2013, 34(14): 3688-3696.

[8]Aoyama Y, Kanamori T, Nakai T, et al. Artificial viruses and their application to gene delivery. size-controlled gene coating with glycocluster nanoparticles [J]. Journal of the Amerian Chemical Society, 2003, 125(12): 3455-3457.

[9]Sugiyama M, Matsuura M, Takeuchi Y, et al. Possible mechanism of polycation liposome (PCL)-mediated gene transfer [J]. Biochimica et Biophysica Acta, 2004, 1660(1-2):24-30.

[10]Nimesh S, Goyal A, Pawar V, et al. Polyethylenimine nanoparticles as efficient transfecting agents for mammalian cells [J]. Journal of Controlled Release, 2006, 110(2): 457-468.

[11]Wang D A, Narang A S, Kotb M, et al. Novel branched poly(ethylenimine)-cholesterol water soluble lipopolymers for gene delivery [J]. Biomacromolecules, 2002, 3: 1197-1207.

[12]Furgeson D Y, Chan W S, Yockman J W, et al. Modified linear polyethylenimine-cholesterol conjugates for DNA complexation [J]. Bioconjugate Chemistry, 2003, 14(4): 840-847.

[13]Han S O, Mahato R I, Kim S W. Water-soluble lipopolymer for gene delivery [J]. Bioconjugate Chemistry, 2001, 12(3): 337-345.

[14]Gao S, Yin D F, Ding X Y, et al. The preparation and application of nonionic surfactant modified polyethyleneimine: China,200710171722.3 [P]. 2007-12-04.