Oct4 mRNA在非小細胞肺癌患者腫瘤組織的表達與病理特征的相關(guān)性分析

劉天藝

肺癌為常見的肺原發(fā)性惡性腫瘤，主要分為小細胞肺癌與非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)，其中NSCLC包括鱗癌、腺癌等，約占所有肺癌的80%[1]。近年來其發(fā)病率和病死率在諸多地區(qū)逐年上升，居惡性腫瘤首位[2]。隨著醫(yī)學的不斷進步與發(fā)展，靶向治療藥物表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor, EGFR-TKIs)等在NSCLC診療方面取得了很大進展，但NSCLC患者整體生存水平仍不容樂觀[3]。因此，從分子標志物角度分析NSCLC發(fā)病機制可為該病的早期診斷及預后提升尋找有效幫助。八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4(octamer-binding transcription factor 4, Oct4) 為干細胞多能性調(diào)節(jié)基因，可與含八聚體基序(ATGCAAAT)的八核苷酸結(jié)合而調(diào)節(jié)干細胞分化過程中的基因表達[4]。 Oct4與腫瘤微血管密度呈正相關(guān)，而腫瘤微血管密度與腫瘤的生物學行為密切相關(guān)，Oct4表達上調(diào)可預測肺癌的發(fā)生[5-7]。但目前國內(nèi)關(guān)于Oct4 mRNA在NSCLC患者腫瘤組織的表達及其與病理特征關(guān)系的研究報道較少。基于此，本文通過檢測Oct4 在NSCLC組織及其相應癌旁正常組織的表達水平，旨在分析NSCLC組織中Oct4表達與NSCLC患者臨床病理特征的關(guān)系，并探討Oct4對NSCLC患者預后的影響。

材料與方法

一、臨床資料

經(jīng)本院倫理委員會批準，選取2015年7月至2017年7月在我院確診的92例NSCLC患者的癌組織及距癌組織>5.0 cm的癌旁正常組織。入選標準：①經(jīng)病理檢查確診為NSCLC，且無其他腫瘤病史；②肝腎功能及凝血功能正常；③隨訪資料完整；④病理檢查前未接受過放化療、靶向藥物治療；⑤所有研究對象及家屬簽署知情同意書。排除標準：①血常規(guī)檢測結(jié)果不正常；②肝腎功能不全；③心電圖不正常；④在本次治療前接受抗癌治療；⑤患者依從性不好。92例患者中，男性51例，女性41例；年齡45～65歲，中位年齡為52歲，年齡<52歲55例，≥52歲37例；組織分化程度：中高分化52例，低分化40例；病理類型：腺癌56例，非腺癌36例。

二、研究方法

1. 實驗試劑： 總RNA提取試劑盒(上海遠慕生物科技有限公司)、熒光定量PCR試劑盒(青島巴特菲生物科技有限公司)、無水乙醇(湖北卓奧環(huán)?？萍加邢薰?、氯仿(北京北化精細化學品有限公司)、Oct4引物(北京翰科生物科技有限公司)、瓊脂糖(上海迪奧生物科技有限公司)、PCR反應液(武漢益普生物科技有限公司)、DEPC水(北京金石百優(yōu)科技有限公司)、Trizol溶液(上?；鄯f生物科技有限公司)、兔抗人濃縮型Oct4單克隆抗體(上海田源生物技術(shù)有限公司)、10%中性甲醛溶液(上海源葉生物科技有限公司)、蘇木精染色液(上海舜田生物科技有限公司)、PBS磷酸緩沖液(環(huán)凱微生物科技公司)、DAB顯色試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司)、通用型二抗(上海立瑤生物有限公司)、免疫組織化學SP試劑盒(武漢純度生物科技有限公司)、二甲苯(上海恒遠生物科技有限公司)。

2. 熒光定量PCR法： 取92例NSCLC患者的癌組織與癌旁正常組織，按照總RNA提取試劑盒操作步驟提取總RNA，檢測RNA完整性，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以GAPDH為內(nèi)參照，采用熒光定量PCR試劑盒檢測細胞總RNA中Oct4 mRNA表達量。PCR反應條件：95 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，35次循環(huán)，整個PCR過程在ABI7900HT PCR反應系統(tǒng)上完成，熒光信號用SDS2.3軟件分析。Oct4 mRNA相對表達量計算方法：基因相對表達量=2-ΔΔCt，ΔΔCt=(CtOct4-CtGAPDH)-Avg.(CtOct4-CtGAPDH)。

3. 免疫組織化學方法： 對92例NSCLC患者的癌組織與癌旁正常組織采用10%中性甲醛溶液進行固定，脫水，用石蠟包埋成塊，切成4 μm連續(xù)切片，依次脫蠟、抗原修復、PBS漂洗、過氧化物酶阻斷，滴加兔抗人濃縮型Oct4單克隆抗體(濃度1︰100)，4 ℃冷藏過夜，PBS漂洗，再滴加通用型二抗，25 ℃孵育30 min，PBS漂洗，經(jīng)顯色、復染、封片，用于觀察Oct4蛋白表達。判定標準：由2位有經(jīng)驗的病理科醫(yī)生評定和復核。染色強度：0分為不著色，1分為淺黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色；染色細胞百分率：0分為陽性細胞率<5%，1分為陽性細胞率5%～25%，2分為陽性細胞率26%～50%，3分為陽性細胞率>50%。兩項之積為最終得分：乘積<4分判定為陰性表達，乘積≥4判定為陽性表達。

4. 評價指標： ①比較Oct4 mRNA在NSCLC組織與癌旁正常組織中的表達量；②比較Oct4蛋白在NSCLC組織與癌旁正常組織中的表達水平；③NSCLC組織中Oct4表達與NSCLC患者性別、年齡、腫瘤直徑、分化程度等臨床病理特征的關(guān)系；④采用門診復查及電話的方式隨訪1年，記錄并比較NSCLC患者中Oct4陽性表達與Oct4陰性表達者的預后情況，包括脈管浸潤率、1年生存率、遠處轉(zhuǎn)移等。

三、統(tǒng)計學方法

采用spss22.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料比較采用t檢驗，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，生存分析采用Kaplan-Mier法。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、Oct4 mRNA及Oct4蛋白在NSCLC組織與癌旁正常組織中的表達

Oct4 mRNA在NSCLC組織中的表達量(3.19±0.20)明顯高于Oct4 mRNA在癌旁正常組織中的表達量(1.50±0.08)，有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。NSCLC組織與癌旁正常組織中的Oct4蛋白均在細胞核中表達，呈棕黃色顆粒。Oct4 蛋白在NSCLC組織中的陽性表達率73.91%(68/92)明顯高于Oct4 mRNA在癌旁正常組織中的陽性表達率9.78%(9/92)，有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。

二、Oct4表達與NSCLC患者臨床病理特征的關(guān)系

TNM分期、分化程度、病理類型不同的NSCLC患者，其癌組織中Oct4陽性表達率差別明顯，有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；性別、年齡、腫瘤直徑不同的NSCLC患者，其癌組織中Oct4陽性表達率差別不明顯，無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，見表1。

表1Oct4表達與NSCLC患者臨床病理特征的關(guān)系 [n(%)]

三、NSCLC患者Oct4表達對其預后的影響

NSCLC患者Oct4陰性表達者脈管浸潤率、遠處轉(zhuǎn)移明顯低于Oct4陽性表達者，有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；NSCLC患者Oct4陰性表達者1年生存率明顯高于Oct4陽性表達者，有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，見表2。

表2NSCLC患者Oct4表達對其預后的影響[n(%)]

討 論

NSCLC是目前全球范圍內(nèi)發(fā)病率最高的惡性腫瘤，胸部脹痛、低熱、咳嗽、痰血為其早期臨床癥狀，晚期則出現(xiàn)呼吸困難、體質(zhì)量減輕、咯血等[8-10]。引發(fā)NSCLC的因素很多，吸煙已被Bayalige等[11]證實是NSCLC最重要的高危因素，煙草中的亞硝胺和多鏈芳香烴類化合物(如苯并芘)可通過多種機制損傷支氣管上皮細胞總DNA，導致抑癌基因(如APC、Rb、nm23、P53、FHIT等基因)失活與癌基因(如myc、Ras、src、myb等基因)激活，進而發(fā)生癌變[12-14]。同時，NSCLC的發(fā)生亦與職業(yè)環(huán)境、遺傳因素、電離輻射、肺部慢性感染等密切相關(guān)[15]。隨著醫(yī)學技術(shù)的不斷更新，低劑量螺旋CT篩查及分子靶向治療成功應用于NSCLC的臨床治療，為進展期的NSCLC患者帶來希望，但因NSCLC生物學特性復雜，早期癥狀不明顯，惡性程度高，且易發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，其5年生存率依在10%左右[16.17]。這與NSCLC早期缺乏特異度較高的腫瘤診斷標志物有關(guān)，目前臨床常用的腫瘤標志物靈敏度不高，且對腫瘤診斷及預后評估的意義不大[18-19]。

傳統(tǒng)觀念認為，腫瘤是由局部組織細胞增生形成的可以無限生長的新生物[20]。而有研究認為腫瘤干細胞(tumor stem cell, TSC)與腫瘤生長、轉(zhuǎn)移及復發(fā)密切相關(guān)[21]。TSC是存在于惡性腫瘤細胞中為數(shù)極少卻具有無限增殖能力并能自我更新的腫瘤細胞，具有維持腫瘤細胞生命力、促進腫瘤細胞轉(zhuǎn)移、多向分化能力、耐藥性強等生物學特性[22-23]。因此，其對以抑制腫瘤細胞增殖為靶向治療的方式并不敏感，這也是腫瘤治療困難或復發(fā)的原因之一。Oct4為TSC中最重要的維持人類胚胎干細胞自我更新的基因之一，該基因位于人類6號染色體上，由4個內(nèi)含子和5個外顯子組成，可轉(zhuǎn)錄不同的mRNA亞型，從而翻譯成多種蛋白質(zhì)，翻譯的蛋白質(zhì)含有1個保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，該結(jié)合域可與靶基因啟動因子中的八核苷酸結(jié)合從而激活或抑制干細胞分化過程中基因表型的轉(zhuǎn)變[24-25]。研究顯示，Oct4在正常細胞中不表達，僅表達于原發(fā)腫瘤細胞、胚胎干細胞(embryonic stem cell, ESC)、胚胎生殖細胞中[26-27]。Oct4與腫瘤發(fā)生、發(fā)展有一定聯(lián)系，隨著胚胎干細胞不斷分化，Oct4基因在原始內(nèi)胚層及滋養(yǎng)層外胚層中表達減少，而大量表達于腫瘤細胞及胚胎生殖細胞中。研究顯示，Oct4蛋白在膀胱癌組織中的陽性表達率(66.75%)顯著高于正常膀胱組織(25.38%)，且Oct4蛋白在G1、G2、G3級膀胱癌中的陽性表達率分別為39.23%、70.21%、92.35%，由此提示Oct4表達上調(diào)可預測膀胱癌的發(fā)生及病情進展[28]。同時Soria等[5]發(fā)現(xiàn)Oct4與腫瘤微血管密度呈正相關(guān)，兩者可共同參與腫瘤微血管生成、浸潤及血行轉(zhuǎn)移，提示Oct4可作為肺癌診斷的一個標志物。上述研究結(jié)論在本文中也得到了證實，本文結(jié)果顯示Oct4 mRNA及蛋白在NSCLC組織中的表達水平均明顯高于癌旁正常組織，因而NSCLC組織中可能存在具有無限增殖能力并能自我更新的TSC細胞，其中Oct4 參與了NSCLC的發(fā)生、侵襲及轉(zhuǎn)移等。在Oct4表達與NSCLC患者臨床病理特征及預后的相關(guān)性方面，Li等[29]的研究結(jié)果顯示Oct4蛋白在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床病理分期高患者中的陽性表達明顯多于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床病理分期低的患者。Li等[30]的生存分析結(jié)果顯示NSCLC患者中Oct4高表達組總生存率(overall survivalrate, OS)顯著低于Oct4低表達組。本文結(jié)果顯示，TNM分期、分化程度、病理類型不同的NSCLC患者，其癌組織中Oct4陽性表達率差別明顯，NSCLC患者Oct4陰性表達者脈管浸潤率、遠處轉(zhuǎn)移明顯低于Oct4陽性表達者，NSCLC患者Oct4陰性表達者1年生存率明顯高于Oct4陽性表達者，這與Li 等[16]及Li 等[17]的研究結(jié)果相似。提示Oct4在NSCLC患者腫瘤組織中的表達與NSCLC患者TNM分期、分化程度、病理類型及預后有相關(guān)性。分析其原因可能是，Oct4高表達可增加TSC細胞多樣性及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)，而EMT為腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵過程。

綜上所述，Oct4在NSCLC患者腫瘤組織中呈高表達，且與NSCLC患者TNM分期、分化程度、病理類型及預后有相關(guān)性。