蛋黃主要蛋白質(zhì)研究進(jìn)展

謝云霄，耿放，王金秋*

農(nóng)業(yè)部雜糧加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院（成都 610106）

蛋黃蛋白質(zhì)因其優(yōu)良的營(yíng)養(yǎng)特性、多樣的功能特性和生物活性，一直是食品蛋白質(zhì)研究的重要對(duì)象。蛋黃中的蛋白質(zhì)主要包括卵黃免疫球蛋白（Immunoglobulin Y，IgY）、蛋黃低密度脂蛋白（Egg yolk low density lipoprotein，EY-LDL）、蛋黃高密度脂蛋白（Egg yolk high density lipoprotein，EY-HDL）以及卵黃高磷蛋白（Phosvitin，Pv）等。就蛋黃主要蛋白質(zhì)的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，為蛋黃蛋白質(zhì)的深入研究和功能性高值化新型蛋制品的開(kāi)發(fā)提供參考。

1 蛋黃蛋白質(zhì)的合成與轉(zhuǎn)運(yùn)

與蛋清蛋白質(zhì)主要在輸卵管中合成不同，蛋黃蛋白質(zhì)的前體主要由母雞的肝臟合成并分泌到血液中，通過(guò)血液循環(huán)達(dá)到卵巢、轉(zhuǎn)移到卵母細(xì)胞中，再經(jīng)過(guò)酶解和重新組合，形成蛋黃中的卵黃顆粒（Yolk granule）和漿質(zhì)（Yolk plasma）。

1.1 載脂蛋白（Apolipoprotein B）與蛋黃低密度脂蛋白

雞蛋黃低密度脂蛋白（EY-LDL）存在于卵黃漿質(zhì)中，約占蛋黃干重的65%。EY-LDL是一種脂蛋白復(fù)合體，其脂質(zhì)部分約占90%，主要為甘油三脂和膽固醇，其由母雞血液中的極低密度脂蛋白（VLDL）轉(zhuǎn)化而來(lái)。VLDL在母雞的肝臟中合成，隨血液運(yùn)輸通過(guò)卵母細(xì)胞膜上的受體介導(dǎo)和吞噬進(jìn)入卵母細(xì)胞（蛋黃）。研究表明，EY-LDL的蛋白質(zhì)部分的前體主要為載脂蛋白B（Apolipoprotein B，APOB）[1]。APOB由4 631個(gè)氨基酸組成，其翻譯后被裂解為7個(gè)片段（Apovitellenin 1～7），這些蛋白質(zhì)片段與磷脂、甘油三脂和膽固醇組合，共同構(gòu)成了EY-LDL。

1.2 卵黃蛋白原（Vitellogenins）與蛋黃高密度脂蛋白和卵黃高磷蛋白

蛋黃高密度脂蛋白（EY-HDL）含量約占蛋黃蛋白質(zhì)的16%，卵黃高磷蛋白的含量約占蛋黃蛋白質(zhì)的4%，它們都來(lái)源于卵黃蛋白原（Vitellogenins）。卵黃蛋白原在母雞肝臟中合成并分泌到血液中，經(jīng)血液循環(huán)轉(zhuǎn)運(yùn)到卵巢后，在受體介導(dǎo)下通過(guò)內(nèi)吞作用進(jìn)入卵母細(xì)胞。轉(zhuǎn)運(yùn)到蛋黃中的卵黃蛋白原主要有三種，Vitellogenin 1～3，它們序列差異較大，但具有相同的結(jié)構(gòu)域。隨后，卵黃蛋白原發(fā)生裂解，產(chǎn)生Lipovitellin-1、Lipovitellin-2、卵黃高磷蛋白和卵黃糖蛋白（Yolk glycoproteins，YGPs）[2]。其中，Lipovitellin-1、Lipovitellin-2與磷脂結(jié)合，組裝成為EY-HDL復(fù)合體，而YGPs則進(jìn)入到卵黃漿質(zhì)部分。EY-HDL與卵黃高磷蛋白、少量的EY-LDL進(jìn)一步組裝形成卵黃顆粒。

1.3 卵黃免疫球蛋白

卵黃免疫球蛋白（IgY）主要存在于卵黃漿質(zhì)中，約占蛋黃總蛋白質(zhì)的10%。IgY是由母雞血清中的免疫球蛋白在特異性受體介導(dǎo)下從血液轉(zhuǎn)移到卵母細(xì)胞中。在胚胎發(fā)育過(guò)程中，蛋黃中的IgY再次由受體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移到胚胎血液中，為胚胎發(fā)育提供被動(dòng)免疫[3-4]。

2 蛋黃蛋白質(zhì)在蛋黃中的組織狀態(tài)

在天然條件下，蛋黃由連續(xù)的水相（卵黃漿質(zhì)）和大小在0.3～2 μm范圍內(nèi)的不溶性顆粒組成[5]，而EY-LDL以膠體顆粒的形式（17～60 nm）分散在卵黃漿質(zhì)中。卵黃顆粒的組成為：70%的EY-HDL、10%的Pv和12%的EY-LDL。EY-HDL是一個(gè)類似球狀的假分子結(jié)構(gòu)，通過(guò)磷酸鈣橋與Pv相結(jié)合，形成復(fù)雜的卵黃顆粒結(jié)構(gòu)，其間含有嵌入式的EY-LDL囊泡。有研究發(fā)現(xiàn)，卵黃顆粒中摻入的EY-LDL是電荷和空間位阻作用的結(jié)果，其可使卵黃顆粒整體結(jié)構(gòu)更為緊密和平滑，降低整體空間阻力[6]。卵黃漿質(zhì)部分的組成為：約85%的EY-LDL和15%的球狀蛋白，主要為血清蛋白（Serum Albumin，又被稱為α-livetin）、IgY（γ-livetin）和卵黃糖蛋白（YGP42/YGP40/YGP30等，亦被稱為β-livetin）[7]。

3 雞蛋黃蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能

3.1 IgY的結(jié)構(gòu)與功能

IgY由4個(gè)亞基組成，包括兩條重鏈和兩條輕鏈。重鏈包含1個(gè)可變域和4個(gè)恒定域，輕鏈由1個(gè)可變域和1個(gè)恒定域組成。由質(zhì)譜分析得出IgY的分子質(zhì)量為167 250 Da，其中重鏈的分子質(zhì)量為65 105 Da，輕鏈的分子質(zhì)量為18 660 Da。IgY可分為2個(gè)抗原結(jié)合片段（Fab）和1個(gè)可結(jié)晶片段（Fc），其中Fc部分是大多數(shù)生物功能作用的位點(diǎn)[8]。

用抗原刺激產(chǎn)蛋母雞的免疫系統(tǒng)，即可表達(dá)和分泌特異性的抗體，并轉(zhuǎn)移至蛋黃中，從而獲得特異性IgY。特異性IgY與病原體結(jié)合，可阻滯病原體的繁殖、加速病原體的清除，因此在免疫治療方面具有廣闊的應(yīng)用前景。在畜禽養(yǎng)殖中，特異性IgY可抵御病原微生物的侵染、繁殖，起到預(yù)防和治療流行性疾病、促進(jìn)畜禽幼仔生長(zhǎng)發(fā)育、增強(qiáng)免疫力的作用[9]。喂食了特異性IgY的雛雞，其對(duì)球蟲(chóng)病的抵抗力顯著增強(qiáng)，且減少了盲腸損傷和卵囊脫落，同時(shí)增強(qiáng)了雛雞體重[10]。在仔豬飼養(yǎng)中，特異性的抗病毒IgY（豬傳染胃腸炎病毒與豬流行性腹瀉病毒）具有很好的應(yīng)用效果，能夠快速抑制病毒的復(fù)制，并顯著降低仔豬病死率[8]。特異性IgY亦可用于人類病原傳染病的防治，如抗輪狀病毒IgY用于治療小兒輪狀病毒腸炎，可加快病毒清除、改善臨床體征并縮短病程[11]。

此外，IgY具有很強(qiáng)的特異性和靈敏度，因此在免疫檢測(cè)和診斷上得到了廣泛的應(yīng)用。利用免疫母雞制備抗血吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵特異性IgY，并將其作為捕捉抗體用于ELISA檢測(cè)，可有效檢出人尿液中的血吸蟲(chóng)可溶性蟲(chóng)卵抗原[12]。王云蕓等[13]研究建立了基于特異性IgY的ELISA檢測(cè)體系，對(duì)引起腹瀉的諾如病毒進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示出良好的特異性?；谔禺愋訧gY建立的食品中慶大霉素ic-ELISA檢測(cè)方法，其對(duì)慶大霉素具有很好的檢出效果，該方法具有推廣到其他抗生素殘留檢測(cè)的潛力[14]。

3.2 EY-LDL的結(jié)構(gòu)與功能

研究表明，EY-LDL為球形納米顆粒（17～60 nm），磷脂、蛋白質(zhì)和少量膽固醇形成外層膜狀結(jié)構(gòu)，包圍著由甘油三酯和膽固醇組成的脂質(zhì)核心。在外層膜結(jié)構(gòu)中，磷脂和蛋白質(zhì)提供兩親特性，對(duì)EYLDL的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性起著重要作用，而外層膜中鑲嵌的少量膽固醇分子，則增加了磷脂的剛性[7]。采用原子顯微鏡觀察EY-LDL，發(fā)現(xiàn)在溶液體系中，EY-LDL的濃度較低時(shí)，LDL呈單個(gè)分子的分散狀態(tài)，其尺寸一般在50～80 nm之間；且隨著濃度的增加，EY-LDL開(kāi)始聚集，形成聚合物，成像尺寸增大[15]。

新鮮蛋黃是由約50%的水、30%～35%的脂質(zhì)和15%～18%蛋白質(zhì)組成的穩(wěn)定乳液體系。EY-LDL分子自身的水包油型乳化納米顆粒結(jié)構(gòu)，被認(rèn)為是蛋黃乳液體系保持穩(wěn)定的重要原因[16]。EY-LDL在油水界面吸附時(shí)，會(huì)發(fā)生破裂，釋放出中性脂質(zhì)、磷脂、載脂蛋白，中性脂質(zhì)聚集形成油滴，而磷脂、載脂蛋白則吸附在界面上，形成較為穩(wěn)定的界面膜[7]。而在氣液界面上，EY-LDL破裂后，其中性脂質(zhì)、載脂蛋白和磷脂組分均參與形成界面膜[17]。EY-LDL穩(wěn)定的乳化納米分子結(jié)構(gòu)，是構(gòu)建新型食品納米乳化體系的絕佳參考模型，需要更為深入和系統(tǒng)的研究。

除了乳化穩(wěn)定特性，EY-LDL還具有良好的凝膠特性，對(duì)蛋黃及其制品的加工和產(chǎn)品的質(zhì)構(gòu)特性具有重要影響[18]。研究顯示，EY-LDL水溶液（4%）在70℃時(shí)開(kāi)始發(fā)生變性，并在75 ℃下形成熱凝膠。在加熱過(guò)程中，EY-LDL分子中的蛋白質(zhì)部分發(fā)生變性解和去折疊，內(nèi)部官能團(tuán)暴露并通過(guò)疏水作用、交聯(lián)作用等發(fā)生重排，從而形成凝膠[7]。此外，EY-LDL在冷凍時(shí)亦會(huì)發(fā)生凝膠化，利用該特性，將其應(yīng)用于動(dòng)物精液（公牛、公羊、馬）的冷凍保存，可顯著提高精子的存活率和人工受精的成功率，對(duì)家畜的繁育具有重要作用[18]。

3.3 EY-HDL的結(jié)構(gòu)與功能

EY-HDL是一個(gè)分子量約400 kDa的球狀分子，其蛋白質(zhì)部分由4個(gè)亞基組成，分別為2個(gè)Lipovitellin-1（約125 kDa）和2個(gè)Lipovitellin-2（約25 kDa）；脂質(zhì)占總分子量的25%左右，以磷脂為主。EY-HDL的蛋白質(zhì)部分通過(guò)折疊，形成一個(gè)疏水性的漏斗形空腔，磷脂分子先與空腔表面的疏水性氨基酸吸附，而后甘油三酯再吸附于磷脂分子形成的新的疏水空腔中[19-20]。

在雞胚發(fā)育過(guò)程中，EY-HDL不僅分解自身為胚胎發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還可以轉(zhuǎn)運(yùn)微量元素和脂質(zhì)，從而促進(jìn)胚胎的生長(zhǎng)。研究顯示，EY-HDL參與鋅離子的轉(zhuǎn)運(yùn)，從而降低雞胚發(fā)育過(guò)程中的畸變[21]。EYHDL對(duì)腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌以及大腸桿菌均有一定的抑制作用，可以抵御病菌入侵保護(hù)胚胎[22]。與血清HDL功能相似，EY-HDL也可清除血管內(nèi)壁沉積的膽固醇，具有潛在的預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化的作用[2]。此外，EY-HDL水解后產(chǎn)生的多肽具有一定的抗氧化活性，是食品源功能性多肽的潛在來(lái)源[23]。

3.4 Pv的結(jié)構(gòu)與功能

Pv是已知蛋白質(zhì)中磷酸化程度最高的蛋白之一，在其217個(gè)氨基酸殘基中，絲氨酸（Ser）殘基為123個(gè)，占比高達(dá)56.7%，并且絕大部分絲氨酸都發(fā)生了磷酸化修飾。高度磷酸化的Pv分子整體呈無(wú)規(guī)則卷曲的線狀結(jié)構(gòu)，在其N-末端和C-末端為小的疏水區(qū)域，連續(xù)的磷酸化絲氨酸片段分布于分子中部，形成了兩端疏水、中間親水的兩親性結(jié)構(gòu)[24]。

由于高度的磷酸化修飾，Pv在水溶液中為典型的酸性蛋白質(zhì)，易與各種陽(yáng)離子（如Fe3+、Fe2+、Ca2+、Mg2+等）相結(jié)合，如蛋黃中95%的鐵離子都是以與Pv結(jié)合的形式存在的。由于鐵離子是微生物生長(zhǎng)必須元素，亦是氧化反應(yīng)的重要催化劑，因此與鐵離子的高結(jié)合力，使Pv具有一定的抑菌作用和抗氧化活性。此外，Pv與鈣離子相互作用形成的磷酸鈣橋，是Pv與EY-HDL結(jié)合形成卵黃顆粒的最為重要的作用力。

兩端疏水、中間親水的分子結(jié)構(gòu)，使Pv具有良好的乳化性，其分子內(nèi)大量的磷酸根提供高負(fù)電荷和靜電斥力，維持了油水界面的穩(wěn)定性，抑制了乳化液的絮凝和聚集。常見(jiàn)的食品添加劑（如甘油、果膠、海藻糖等）可適當(dāng)增加Pv的疏水性，共同使用時(shí)具有協(xié)同增效作用。同時(shí)Pv糖基化作用，可提高Pv的乳化穩(wěn)定性和對(duì)極端pH環(huán)境的抗性，Pv疏水末端脂肪酸（FA）的引入是改善Pv加工特性的另一種有效手段[25]。此外，金屬離子對(duì)Pv的乳化特性具有一定影響，在乳化液形成之前添加鐵離子，Pv的乳化性能變?nèi)?，但抗絮凝的能力變?qiáng)[26]。熱處理對(duì)Pv的乳化性具有負(fù)面的影響，當(dāng)熱處理溫度高于65 ℃時(shí)，其乳化能力開(kāi)始下降，而高于70 ℃時(shí)，乳化穩(wěn)定性也開(kāi)始下降[27]。

Pv水解后產(chǎn)生的磷酸肽（PPPs），具有多種生物活性。PPPs中的磷酸化絲氨酸殘基能夠與鈣離子結(jié)合形成可溶性絡(luò)合物，從而抑制鈣離子形成不溶性的鹽，避免鈣的流失并促進(jìn)腸內(nèi)鈣的吸收[28]。徐彩娜等[29]研究表明，PPPs具有清除DPPH自由基、抗氧化能力，可降低細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

4 雞蛋黃蛋白質(zhì)的分離純化

在蛋黃蛋白質(zhì)的分離純化過(guò)程中，一般先將蛋黃稀釋后離心，分別獲得卵黃漿質(zhì)（上層溶液）和卵黃顆粒（下層沉淀）部分。為了達(dá)到較好的分離效果，該步驟中蛋黃的稀釋倍數(shù)通常為1～5倍，同時(shí)可添加適當(dāng)濃度的鹽（＜0.3 mol/L），以提高分離效率。

4.1 卵黃漿質(zhì)蛋白質(zhì)的分離純化

IgY為水溶性蛋黃蛋白質(zhì)，溶解于卵黃漿質(zhì)中，因此，在分離獲得卵黃漿質(zhì)部分后，需將其與EYLDL分開(kāi)。目前常用的方法為硫酸銨沉淀法或者多聚物沉淀法，操作簡(jiǎn)單、條件溫和，對(duì)IgY的活性影響較小。在此過(guò)程中，聚乙二醇或高分子多糖等多聚物的使用，可以促進(jìn)EY-LDL的沉淀與析出，從而提高分離效率[30]。經(jīng)過(guò)分離獲得的IgY純度一般可達(dá)到81%，如需進(jìn)一步純化，可采用陰離子交換層析法，最終可使IgY的純度達(dá)到95%以上[30]。

在獲得卵黃漿質(zhì)之后，若以EY-LDL為目標(biāo)蛋白，則可通過(guò)硫酸銨沉淀法或聚乙二醇沉淀法對(duì)漿質(zhì)中的EY-LDL進(jìn)行進(jìn)一步分離。Wang等[31]對(duì)比了上述兩種方法，結(jié)果顯示，用硫酸銨沉淀法分離提取EYLDL時(shí)，硫酸銨飽和度為30%時(shí)的效果最佳，EY-LDL的得率較高且雜蛋白含量少；聚乙二醇沉淀法中，在PEG分子量為4 000、濃度為5%、卵黃漿質(zhì)溶液的pH為6的條件下，分離效果最佳。兩種方法對(duì)比，PEG沉淀法提取得到的粗提LDL干物質(zhì)含油率和蛋白質(zhì)提取率分別為68.14 g/100 g干物質(zhì)和69.91%，硫酸銨沉淀法得到的粗提LDL干物質(zhì)含油率和蛋白質(zhì)提取率分別為57.72 g/100 g干物質(zhì)和69.41%，前者效果要優(yōu)于后者。若需要獲得更高純度的EY-LDL，可基于EYLDL分子量較大的特點(diǎn)，通過(guò)凝膠過(guò)濾層析法進(jìn)一步除去雜蛋白。

4.2 卵黃顆粒蛋白的分離純化

卵黃顆粒中的主要蛋白質(zhì)為EY-HDL和Pv，這兩種蛋白質(zhì)通過(guò)磷酸鈣橋緊密結(jié)合，若要分別獲得EYHDL和Pv，首先需對(duì)卵黃顆粒進(jìn)行處理，打開(kāi)磷酸鈣橋。目前常用較高的離子強(qiáng)度打開(kāi)磷酸鈣橋，如Zhang等[32]將卵黃顆粒與9倍質(zhì)量的高鹽溶液（100 g/L氯化鈉）混合，攪拌使卵黃顆粒解聚，隨后向溶液中加入4%的聚乙二醇并調(diào)整溶液pH為4.5，此時(shí)在聚乙二醇作用下，EY-HDL聚集發(fā)生沉淀。從而與Pv分開(kāi)。如需進(jìn)一步的純化，可采用陰離子交換層析等方法[24]。

5 結(jié)語(yǔ)與展望

當(dāng)前，對(duì)于蛋黃蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、功能和特性已經(jīng)有了較為豐富和深入的研究，為蛋黃蛋白質(zhì)的應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。但是，蛋黃及蛋黃蛋白質(zhì)仍有諸多未知領(lǐng)域，如蛋黃蛋白質(zhì)的翻譯后修飾結(jié)構(gòu)、EY-LDL分子及卵黃顆粒超分子的組裝機(jī)制、蛋黃自身（水、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)多相體系）的穩(wěn)定機(jī)制等。未來(lái)，針對(duì)這些科學(xué)問(wèn)題的深入探索，將進(jìn)一步加深對(duì)蛋黃蛋白質(zhì)的認(rèn)識(shí)，促進(jìn)蛋黃及蛋黃蛋白質(zhì)的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用。