臘八蒜黃色素形成機(jī)制及穩(wěn)定性研究進(jìn)展

郭思文 ，趙曉燕，馬越，張敏，趙煜煒，王丹*

1. 北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心、北京市果蔬農(nóng)產(chǎn)品保鮮與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部蔬菜產(chǎn)后處理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（北京 100097）；2. 沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院（沈陽(yáng) 110866）；3. 龍大食品集團(tuán)有限公司（萊陽(yáng) 265231）

大蒜屬百合科蔥屬，2年生草本植物。大蒜營(yíng)養(yǎng)成分非常豐富，含有多種生物活性物質(zhì)，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值[1-2]。迄今為止，在大蒜中已發(fā)現(xiàn)200余種化合物[3]，目前認(rèn)為含硫化合物是主要的生物活性物質(zhì)，主要有二烯丙基一硫化合物、二烯丙基二硫化合物、二烯丙基三硫化合物等[4]。大蒜色變是蒜制品粗加工過(guò)程中常見(jiàn)的現(xiàn)象，打破休眠期的大蒜經(jīng)機(jī)械破碎或一元有機(jī)弱酸處理后發(fā)生色變[5-6]，產(chǎn)生的是一種含氮的花青素類色素[7]。多年來(lái)，國(guó)內(nèi)外相關(guān)學(xué)者對(duì)臘八蒜黃色素進(jìn)行研究，但由于反應(yīng)物質(zhì)和色素組成的多樣性和復(fù)雜性，其形成研究仍處于推測(cè)層面上，仍需更多的試驗(yàn)數(shù)據(jù)證明其具體的反應(yīng)歷程。研究發(fā)現(xiàn)，綠色素實(shí)際上由藍(lán)色素和黃色素組成，藍(lán)色素不穩(wěn)定逐漸轉(zhuǎn)化為黃色素[8]。在黃色素提取過(guò)程中，很多物質(zhì)如粗蛋白、可溶性糖等溶出至浸泡液，分離難度較大[9]。因此結(jié)合各層析方法的特點(diǎn)，對(duì)臘八蒜黃色素進(jìn)行分離純化與鑒定。同時(shí)，臘八蒜黃色素作為一種潛在的色素資源，其穩(wěn)定性是影響其開(kāi)發(fā)與應(yīng)用的主要因素。

目前對(duì)于臘八蒜黃色素研究甚少，結(jié)合前人的研究成果，論述臘八蒜黃色素形成機(jī)制，歸納臘八蒜黃色素分離純化及鑒定的方法與進(jìn)展，并分析影響臘八蒜黃色素穩(wěn)定性因素，以期為中國(guó)大蒜的深加工產(chǎn)業(yè)和臘八蒜黃色素的開(kāi)發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1 臘八蒜黃色素形成的原理

自Cruss發(fā)現(xiàn)加入乙酸的蒜泥會(huì)產(chǎn)生綠色素，即大蒜綠變，已有70余年，至今其機(jī)理仍未闡明，而由綠色素轉(zhuǎn)化的臘八蒜黃色素的形成途徑，更是處于推測(cè)階段。研究發(fā)現(xiàn)，臘八蒜綠色素不同于葉綠素及其他含卟啉類色素，而是一種含氮的花青素類色素，具有多個(gè)吡咯環(huán)，當(dāng)吡咯環(huán)的聚合度增加時(shí)，其顏色由紫紅向藍(lán)、綠、黃方向改變。隨著蔥屬植物研究的進(jìn)一步深化，發(fā)現(xiàn)洋蔥與大蒜的色變機(jī)制具有驚人的相似之處[10]。

1.1 大蒜的生理特性和處理方法對(duì)色變的影響

大蒜在較高溫度下（22 ℃）具有休眠特性，一般為2～3個(gè)月[11]。大蒜的色變與貯藏溫度有關(guān)，貯藏溫度在22 ℃以上可有效防止大蒜在加工過(guò)程中色變現(xiàn)象的發(fā)生，新蒜也不會(huì)發(fā)生色變，只有在低溫（12 ℃）條件下儲(chǔ)藏一段時(shí)間的蒜才具有色變能力[12-13]，此過(guò)程是可逆的。在此期間大蒜中的多種化學(xué)成分發(fā)生變化，定義為大蒜打破休眠的過(guò)程。

最早發(fā)現(xiàn)大蒜的色變是在破碎的蒜瓣中，顏色變化過(guò)程是藍(lán)→綠→黃。常規(guī)的大蒜色變有2種方式，一是機(jī)械破碎，即蒜泥的綠變，機(jī)械破碎會(huì)使存在于細(xì)胞質(zhì)中的半胱氨酸亞砜底物與存在于液泡中的蒜酶接觸，從而發(fā)生一系列化學(xué)反應(yīng)而產(chǎn)生綠色素。研究發(fā)現(xiàn)，臘八蒜的色變與破碎程度直接相關(guān)，蒜瓣破碎得越細(xì)，色變?cè)娇靃14]。二是醋酸浸泡，將大蒜鱗莖浸泡在醋酸中，通過(guò)改變細(xì)胞膜及液泡膜的通透性，從而使蒜酶與半胱氨酸亞砜接觸，繼而產(chǎn)生綠色素。白冰[6]采用具有與醋酸近似pKa值的一元有機(jī)弱酸（丙酸、丁酸、戊酸等）對(duì)大蒜進(jìn)行浸泡處理，發(fā)現(xiàn)都具有使打破休眠期的大蒜變綠的能力，而二元或多遠(yuǎn)有機(jī)弱酸（蘋果酸、檸檬酸等）則不能，這與一元有機(jī)弱酸的pKa值有關(guān)。一元弱酸在達(dá)到解離平衡過(guò)程中產(chǎn)生具有細(xì)胞毒性的中性分子，會(huì)非特異性地破壞液泡膜，從而產(chǎn)生一系列反應(yīng)。多元有機(jī)酸如蘋果酸和檸檬酸雖然可以改變細(xì)胞膜的通透性，但同時(shí)也是參加三羧酸循環(huán)的重要有機(jī)酸，所以植物細(xì)胞中具有調(diào)控這些多元有機(jī)酸的機(jī)制，從而不會(huì)破壞液泡膜，臘八蒜不會(huì)變綠。但無(wú)論是綠變的蒜泥或是蒜瓣，隨著儲(chǔ)藏時(shí)間延長(zhǎng)，色變的過(guò)程都是由藍(lán)綠色逐漸向黃色轉(zhuǎn)化。

1.2 大蒜色變過(guò)程中化學(xué)成分的變化

在大蒜色變過(guò)程中，主要是酶和含硫化合物發(fā)揮作用，伴隨著酶促反應(yīng)和非酶反應(yīng)。大蒜中含有多種酶類，包括γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶、蒜氨酸酶、超氧化物歧化酶、過(guò)氧化物酶等。在低溫貯藏（打破休眠）期間存在于大蒜鱗莖中的關(guān)鍵的含硫次生代謝產(chǎn)物是一類含硫非蛋白質(zhì)氨基酸，即半胱氨酸亞砜[15-16]，如蒜氨酸、異蒜氨酸、環(huán)蒜氨酸等[17-18]。

研究表明，γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（GGT）在臘八蒜的變色過(guò)程中起到了重要的作用，GGT是生物體中普遍存在的酶，認(rèn)為與次級(jí)代謝有關(guān)。江英等[19]發(fā)現(xiàn)γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（GGT）的活性與臘八蒜色變的變化是保持一致的，并且在大蒜變色的過(guò)程中作為水解酶存在，可以使蒜中的某種γ-谷氨肽水解[20]。由于GGT在低溫下具有較高的活性，因此大蒜在低溫儲(chǔ)藏過(guò)程中，GGT可以通過(guò)切割γ-谷氨酰肽中的?；糠稚上鄳?yīng)的半胱氨酸[21]，而后在H2O2或氧化酶的作用下生成亞砜類物質(zhì)[22]，如蒜氨酸（1-PeSCO）和異蒜氨酸（2-PeCSO）等[23-24]。研究表明，新鮮大蒜中PeCSO含量很低，經(jīng)低溫貯藏后在GGT的作用下含量升高，作為大蒜色變的重要因素之一，具有使不能色變的大蒜變色的能力，且色變程度與其含量呈正比。但在高溫或堿性條件下，PeCSO會(huì)發(fā)生環(huán)化，產(chǎn)生環(huán)蒜氨酸，環(huán)蒜氨酸較為穩(wěn)定[25]，且不參與大蒜的色變過(guò)程，這也是高溫下大蒜不能產(chǎn)生色變的原因之一。

蒜氨酸裂解酶是蔥屬植物色變的前提，位于液泡中，具有Cβ-Sγ鍵裂解酶活性。以前的研究表明，由于大蒜中PeCSO和蒜酶分別存在于細(xì)胞的不同部位，因此大蒜的綠化只發(fā)生在加工大蒜中，如蒜泥或臘八蒜。這些處理是通過(guò)機(jī)械破碎或一元弱酸改變液泡膜通透性的原理使蒜氨酸裂解酶與細(xì)胞質(zhì)中底物接觸，從而將半胱氨酸亞砜裂解為二丙烯基硫代亞磺酸酯（色素中間體）和烯丙基硫代亞磺酸酯（大蒜素）[26]。

2004年，Kubec等[10]通過(guò)體外試驗(yàn)得出洋蔥紅變和大蒜綠變的色變前體都是含丙烯基的硫代亞磺酸酯。2005年，李蕾等[27]發(fā)現(xiàn)大蒜綠變能力同硫代亞磺酸酯含量呈正相關(guān)，此后研究發(fā)現(xiàn)隨臘八蒜綠變程度加深，其內(nèi)部硫代亞磺酸酯含量降低。為進(jìn)一步證明硫代亞磺酸酯直接參與色素形成，向反應(yīng)體系中添加半胱氨酸以消耗硫代亞磺酸酯，最終溶液中并無(wú)色素產(chǎn)生，認(rèn)為硫代亞磺酸酯很可能參與色素形成的一系列反應(yīng)。

1.3 臘八蒜黃色素的形成途徑

隨著研究的進(jìn)一步深入，發(fā)現(xiàn)臘八蒜綠色素實(shí)際上是先生成藍(lán)色素，藍(lán)色素不穩(wěn)定，對(duì)光、熱敏感，隨時(shí)間延長(zhǎng)分解產(chǎn)生一種比藍(lán)色素相對(duì)分子質(zhì)量更小的黃色素，二者綜合呈現(xiàn)出綠色。藍(lán)色素和黃色素的紫外可見(jiàn)吸收峰分別在590和440 nm處[28]。有學(xué)者就臘八蒜黃色素的形成途徑及化學(xué)結(jié)構(gòu)式進(jìn)行探討，主要分為兩部分：一是由藍(lán)色素降解得到；二是由中間產(chǎn)物吡咯基氨基酸中間體和丙酮酸反應(yīng)得到黃色素。

低溫貯藏過(guò)程中γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶活性增加，催化γ-谷氨酰肽，如γ-谷氨酰-S-烯丙基-L-半胱氨酸（GSAC）和谷氨酰-S-丙烯基-L-半胱氨酸（GSPC）轉(zhuǎn)化為S-烯丙基-L-半胱氨酸亞砜（2-PeCSO）和S-丙烯基-L-半胱氨酸亞砜（1-PeCSO）。大蒜組織破損后，PeCSO在蒜酶的作用下分解為次磺酸和丙酮酸，次磺酸不穩(wěn)定，進(jìn)一步聚合生成相應(yīng)的硫代亞磺酸酯[29]。Imai等[30]通過(guò)體外的模式反應(yīng)提出吡咯基氨基酸可能作為大蒜綠變的中間體。經(jīng)進(jìn)一步研究，楠丁呼思勒等[31]發(fā)現(xiàn)在醋泡的新蒜中添加吡咯基纈氨酸后導(dǎo)致新蒜綠變，但游離氨基酸或吡咯則不具備此功能，由此證明吡咯基氨基酸作為大蒜綠變過(guò)程中的中間體。因此，丙烯基硫代亞磺酸酯和氨基酸反應(yīng)生成吡咯基氨基酸中間體后，吡咯基氨基酸與烯丙基硫代亞磺酸酯結(jié)合生成藍(lán)色素，藍(lán)色素不穩(wěn)定，降解為黃色素。

Bai等[32]、王丹等[33]通過(guò)Paal-Knorr反應(yīng)以6種疏水鏈的氨基酸為原料合成吡咯基氨基酸模型物，通過(guò)體外試驗(yàn)與丙酮酸反應(yīng)生成黃色素，該黃色素在418～460 nm范圍內(nèi)具有最大吸收，與臘八蒜黃色素的吸收相似。此外，臘八蒜色變的程度與吡咯基氨基酸結(jié)構(gòu)有關(guān)，即模型化合物的側(cè)鏈基團(tuán)越小，產(chǎn)生的黃色素越多。此外，對(duì)吡咯基甘氨酸、吡咯基纈氨酸和吡咯基異亮氨酸與丙酮酸產(chǎn)生的黃色素的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定，所產(chǎn)生的黃色素的紫外吸收峰分別在400.9，432.9和433.9 nm處有最大吸收，相對(duì)分子質(zhì)量分別為300，384和412，它們都是2個(gè)吡咯環(huán)通過(guò)共軛雙鍵的連接聚合而成的[34]。同樣，在吡咯基天冬氨酸與丙酮酸的反應(yīng)中同樣觀察到黃色素的產(chǎn)生，其結(jié)構(gòu)與吡咯基纈氨酸與臘八蒜素產(chǎn)生的色素結(jié)構(gòu)相似[30,35]。由此推測(cè)吡咯基氨基酸作為色素前體參與了臘八蒜黃色素的形成，與丙酮酸反應(yīng)生成黃色素，且產(chǎn)生的黃色素結(jié)構(gòu)相似。

2 臘八蒜黃色素分離純化及結(jié)構(gòu)表征

臘八蒜浸泡液或蒜泥長(zhǎng)時(shí)間放置會(huì)變?yōu)辄S色，對(duì)黃色素進(jìn)行分離純化并鑒定其結(jié)構(gòu)對(duì)于臘八蒜黃色素的形成機(jī)理至關(guān)重要。目前通常采用柱層析、高效液相色譜法對(duì)臘八蒜黃色素進(jìn)行分離提純，并采用高分辨率質(zhì)譜對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定分析。

趙曉丹等對(duì)臘八蒜綠色素提取溶劑的選擇、色素的極性、分離介質(zhì)進(jìn)行研究。結(jié)果表明，水、醋酸等極性較高的溶劑和非極性溶劑對(duì)色素的提取效果不佳，甲醇和95%乙醇對(duì)色素的提取效果較好，通過(guò)萃取溶劑的確定認(rèn)為色素屬于中等極性的物質(zhì)。趙曉丹還對(duì)比了強(qiáng)離子交換樹(shù)脂、弱離子交換樹(shù)脂及不同極性的大孔吸附樹(shù)脂，發(fā)現(xiàn)色素易于被極性樹(shù)脂吸附，SIPI-40樹(shù)脂對(duì)色素的吸附率最高。已知臘八蒜綠色素為黃色素和藍(lán)色素的混合物，因此在此基礎(chǔ)上建立提取分離臘八蒜黃色素的方法，根據(jù)色素極性采用甲醇作為黃色素提取溶劑，經(jīng)真空濃縮除去甲醇后，得到乳狀色素提取液，使用乙酸乙酯進(jìn)行萃取。而后經(jīng)大孔吸附樹(shù)脂SIPI-40、Sephadex LH-20凝膠層析和C18固相微萃取分離精制，再通過(guò)高效液相色譜進(jìn)一步分離，得到臘八蒜黃色素。

司君偉[36]研究發(fā)現(xiàn)，得到的黃色素并非一種物質(zhì)，而是由不同黃色素組成，推斷黃色素可能含有183 Da的物質(zhì)，但對(duì)于提取出的物質(zhì)沒(méi)有進(jìn)一步解離及電子轟擊進(jìn)行鑒定。另外，在使用Amberlite CG-50分離藍(lán)色素時(shí)，發(fā)現(xiàn)部分黃色素也被洗脫下來(lái)，由此得到黃色素與藍(lán)色素的極性相似，且相對(duì)分子質(zhì)量小于藍(lán)色素，推測(cè)這部分黃色素可能是藍(lán)色素向黃色素轉(zhuǎn)化的最初黃色素形態(tài)。

Wang等[7]在模擬體系中使用吡咯基甘氨酸、吡咯基纈氨酸、吡咯基異亮氨酸分別與丙酮酸反應(yīng)產(chǎn)生黃色素，通過(guò)固相微萃取、液質(zhì)聯(lián)機(jī)、高分辨率質(zhì)譜、多級(jí)質(zhì)譜分離純化鑒定此色素，闡明其分子組成并推測(cè)化學(xué)結(jié)構(gòu)、質(zhì)譜碎片裂解機(jī)理及形成機(jī)理。其中吡咯基甘氨酸與丙酮酸產(chǎn)生2種黃色素，紫外吸收光譜分別為436.9和400.9 nm，相對(duì)分子質(zhì)量分別為328和300，相應(yīng)的分子式為C18H20N2O4和C16H16N2O4，都是兩摩爾的2-吡咯基乙酸通過(guò)共軛雙鍵的連接聚合生成的，但相對(duì)分子質(zhì)量328的色素較相對(duì)分子質(zhì)量為300的在連接兩摩爾的吡咯基甘氨酸的基團(tuán)上多了2個(gè)甲基。由吡咯基纈氨酸和吡咯基異亮氨酸與丙酮酸反應(yīng)產(chǎn)生的黃色素的紫外吸收光譜分別為432.9和433.9 nm，相對(duì)分子質(zhì)量分別為384和412，相應(yīng)的分子式為C22H28N2O4和C24H32N2O4，是兩摩爾的吡咯基纈氨酸或兩摩爾的吡咯基異亮氨酸通過(guò)共軛雙鍵的連接聚合生成的。

國(guó)內(nèi)外對(duì)于臘八蒜黃色素這種未知結(jié)構(gòu)的色素研究較少，Wang等[7]通過(guò)人工合成的黃色素結(jié)構(gòu)的鑒定，進(jìn)一步證實(shí)前人提出的吡咯基氨基酸作為“臘八蒜”色素中間體這一假設(shè)的正確性，并為今后研究真實(shí)體系中黃色素形成奠定基礎(chǔ)。

3 臘八蒜黃色素穩(wěn)定性的研究進(jìn)展

臘八蒜黃色素作為天然色素，在提取和應(yīng)用過(guò)程中的穩(wěn)定性備受關(guān)注。白冰[6]在蒜泥浸提液中發(fā)現(xiàn)，黃色素在常溫（25 ℃）儲(chǔ)藏期間其吸光度呈先上升后下降趨勢(shì)。隨著研究深入，趙曉丹等[37]對(duì)于臘八蒜黃色素的穩(wěn)定性進(jìn)行探討。

3.1 溫度

研究發(fā)現(xiàn)，臘八蒜黃色素對(duì)熱敏感，熱處理時(shí)溫度越高，色素?fù)p失越大。研究表明，加熱處理會(huì)加快臘八蒜藍(lán)色素向黃色素的轉(zhuǎn)化[38]。高溫（大于80 ℃）加熱，會(huì)使黃色素受到較大破壞。

3.2 pH

臘八蒜黃色素在酸性條件下較為穩(wěn)定，但過(guò)酸（pH＜3）或偏中性條件會(huì)加快色素分解，堿性條件下色素分解得更快。趙曉丹等[37]發(fā)現(xiàn)當(dāng)把堿性的色素溶液用酸溶液重新調(diào)至酸性pH時(shí)，色素變化具有可逆性，但吸光度有所降低。這可能是由于pH的改變影響色素的呈色基團(tuán)結(jié)構(gòu)，從而使色素的顯色受影響，并且這種影響是可逆的。

3.3 光照

很多天然色素在自然光照射下會(huì)褪色，研究發(fā)現(xiàn)臘八蒜黃色素?fù)p失率隨著光照時(shí)間增加緩慢增加。30 d后，經(jīng)光照處理的黃色素的損失率約9.3%，未經(jīng)光照的黃色素?fù)p失率約為4%。由此可見(jiàn)，光照對(duì)臘八蒜黃色素穩(wěn)定性有一定影響，但影響不大。

3.4 氧化劑和還原劑

過(guò)氧化氫和亞硫酸鈉作為一種常見(jiàn)的強(qiáng)氧化劑和還原劑，以不同濃度與臘八蒜黃色素溶液混合，反應(yīng)一段時(shí)間后，臘八蒜黃色素吸光度顯示出一定的劑量依賴性。在過(guò)氧化氫和亞硫酸鈉濃度為1.5%時(shí)，臘八蒜黃色素的損失率分別達(dá)到22.8%和81.4%，由此可見(jiàn)，氧化劑和還原劑都會(huì)嚴(yán)重影響臘八蒜黃色素的穩(wěn)定性。

3.5 金屬離子

一些具有金屬離子活性的副族金屬離子也會(huì)影響色素的穩(wěn)定性，使色素發(fā)生褪色或沉淀[39]。在酸性條件下向臘八蒜黃色素溶液中加入不同的金屬離子，發(fā)現(xiàn)Cu2+，Zn2+，Al3+，Mn2+，F(xiàn)e2+對(duì)黃色素的穩(wěn)定性無(wú)顯著影響，而加入Fe3+的黃色素吸光度略有增加。

3.6 食品添加劑

天然色素穩(wěn)定性普遍較差，使用食品中常用的抗氧化劑維生素C和防腐劑山梨酸鉀添加到臘八蒜黃色素中，以期在實(shí)際生產(chǎn)中將食品添加劑應(yīng)用于臘八蒜黃色素中。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照相比，在維生素C的存在下，臘八蒜黃色素隨放置時(shí)間延長(zhǎng)，其損失率不斷增加。而添加山梨酸鉀（添加量＜1%）對(duì)黃色素?zé)o顯著影響。由此說(shuō)明在臘八蒜黃色素過(guò)程中應(yīng)盡量避免使用維生素C，可以適量與山梨酸鉀共用。

因此，臘八蒜黃色素應(yīng)盡量處于低溫、避光、酸性條件下進(jìn)行貯藏，并避免與維生素C、氧化劑和還原劑接觸。色素的穩(wěn)定性對(duì)于開(kāi)發(fā)應(yīng)用至關(guān)重要，目前對(duì)于提高臘八蒜黃色素穩(wěn)定化方法研究較少。天然色素常采用色素穩(wěn)定劑、?；脑旌臀⒛z囊化技術(shù)等[40-42]提高穩(wěn)定性，對(duì)于提高臘八蒜黃色素穩(wěn)定性的調(diào)控技術(shù)以及進(jìn)一步應(yīng)用還有待探討。

4 展望

雖然目前對(duì)于臘八蒜黃色素的化學(xué)結(jié)構(gòu)及形成途徑是通過(guò)模擬體系推測(cè)得出，但通過(guò)模擬體系合成黃色素的方法對(duì)研究真實(shí)體系中的臘八蒜黃色素具有重要意義。另外，就臘八蒜黃色素穩(wěn)定性的研究表明，黃色素的穩(wěn)定性較好，具有一定的應(yīng)用可能性。在此基礎(chǔ)上未來(lái)可以考慮對(duì)臘八蒜黃色素進(jìn)行開(kāi)發(fā)利用，明確其生物活性和吸收轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，為功能性天然色素的開(kāi)發(fā)利用及大蒜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供理論基礎(chǔ)。