朝鮮薊中2種木犀草素類化合物液相制備條件優(yōu)化

師明月曹清明李 群鐘文惠王元清劉志文張喜平

(1. 中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長沙 410004；2. 匯美農(nóng)業(yè)科技有限公司， 湖南 常德 415137；3. 常德市農(nóng)林科學(xué)研究院，湖南 常德 415000)

朝鮮薊是一種高營養(yǎng)價值的保健蔬菜[1-2]，被譽為“蔬菜之皇”[3-4]，其提取物一直用于民間醫(yī)藥[5]，在各種藥理試驗中表現(xiàn)出促進消化[6]、保肝[7]、利膽[8]、抗癌[9]以及抑制低密度脂蛋白氧化[10]的能力。臨床試驗表明，朝鮮薊具有降低血漿膽固醇[11-12]、降低腸易激綜合征[13]、減肥[14]以及控制空腹血糖升高[15]等功效。

朝鮮薊的次生代謝產(chǎn)物主要是多酚類化合物[16-18]和具有苦味的愈創(chuàng)木烷倍半萜內(nèi)酯類化合物。多酚類化合物表現(xiàn)出抗氧化能力等活性，愈創(chuàng)木烷倍半萜內(nèi)酯表現(xiàn)出抗炎及抑制腫瘤等多種功效[19-20]。

Pandino等[21]報道了6個品種朝鮮薊的3個部位(包括花托、外苞片和內(nèi)苞片)的多酚含量，研究結(jié)果表明木犀草素糖苷類化合物含量為24(Tema 2000品種的外苞片)～620 mg/kg(Tondo di Paestum品種的花托)，其含量比咖啡?？鼘幩犷惢衔锖縖23(Tema 2000品種的內(nèi)苞片)～5 771 mg/kg(Violetto di Sicilia品種的內(nèi)苞片)]和芹菜素含量[870(Blanc Hyerois品種的內(nèi)苞片)～5 397 mg/kg(Tema 2000品種的花托)]低。木犀草素(luteolin)類化合物含量雖低于其他2類酚類化合物，但由于其B環(huán)具有鄰二酚羥基結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)出強抗氧化活性、抑制膽固醇合成、抑制糖尿病以及抗腫瘤活性等功效。Schlupper等[22]研究木犀草素及其衍生物的活性發(fā)現(xiàn)，木犀草素、木犀草素7-O-糖苷在極低濃度下表現(xiàn)出明顯的抗氧化能力；Gebhardt[23]研究表明木犀草素類化合物的木犀草素配苷主要負責(zé)抑制肝臟膽固醇的生物合成，而綠原酸、咖啡酸、洋薊素和其他二咖啡?？鼘幩釤o顯著影響；且木犀草素亦能有效阻斷胰島素對膽固醇生物合成的影響，從而驗證了朝鮮薊的降血脂作用。木犀草素對表皮生長因子受體—酪氨酸激酶(EGFR-TK)具有明顯抑制作用。Rahimuddin等[24]研究發(fā)現(xiàn)木犀草素及其糖苷對UVA導(dǎo)致的皮膚成纖維細胞脂質(zhì)過氧化具有抑制作用。

目前，中國種植的朝鮮薊品種主要有：改良綠球、綠寶石、帝王之星、A106、A109、洛爾卡和上海朝鮮薊等[25]。洛爾卡(Lorca)是常德市于2005年從法國引進的一個加工型朝鮮薊新品種，并通過常德市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所、匯美農(nóng)業(yè)科技有限公司選育，經(jīng)過多年試驗與示范，目前已成為湖南省的主要栽培品種[26]。課題組擬以洛爾卡朝鮮薊作為研究對象，開發(fā)木犀草素類化合物的分離純化新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

朝鮮薊(CynarascolymusL.)花苞：洛爾卡(Lorca)品種，常德匯美農(nóng)業(yè)科技有限公司提供。

大孔樹脂：AB-8型，安徽三星樹脂科技有限公司；

木犀草苷-7-β-D-蕓香糖苷標(biāo)準(zhǔn)品：HPLC純，純度≥98.0%，美國Sigma-Aldrich公司；

木犀草素7-O-β-D-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品：HPLC純，純度≥98.0%，美國Sigma-Aldrich公司；

氘代試劑CH3OD：氘代率≥99.8%，美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

RP-C18層析柱：Sepax GP-C18型，粒徑40～60 μm，蘇州賽分科技有限公司；

Sepax GP-C18柱：4.6 mm×150 mm，40～60 μm，自制；

Venusil MP C18柱：4.6 mm×250 mm，5 μm，天津博納艾杰爾科技有限公司；

Venusil MP C18柱：10 mm×250 mm，5 μm，天津博納艾杰爾科技有限公司；

Unitary C18柱：4.6 mm×250 mm，5 μm，華譜新創(chuàng)科技有限公司；

高效液相色譜儀：LC3000型(配備Newstyle NU3000 Serials UV/VIS檢測器)，北京創(chuàng)新恒通科技有限公司；

高效液相色譜:2695-2996型，美國Waters公司；

質(zhì)譜儀：UHPLC-QTOF/1290-6530型，美國安捷倫科技有限公司；

核磁共振儀：Bruker AVANCE-500MHz型，德國Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 朝鮮薊粗提液的制備 將朝鮮薊曬干，粉碎，得到1.1 kg朝鮮薊粉末。在室溫下，將1.1 kg朝鮮薊粉末按料液比1∶10(g/mL)的比例，用70%乙醇浸提72 h。過濾，得到2 L粗提液。

1.3.2 液相色譜條件 對朝鮮薊粗提液進行液相條件摸索：進樣量20 μL，流動相為甲醇-0.1%甲酸水，流速1 mL/min，檢測波長205 nm時，峰的數(shù)量較多，為朝鮮薊提取液分析的較好條件，如無另外說明，將采納該條件。

1.3.3 AB-8型大孔樹脂對提取物進行粗分 采用大孔樹脂吸附法(AB-8型)對朝鮮薊粗提液(1 L)進行分離純化。具體步驟：將1 L柱體積的大孔樹脂顆粒進行預(yù)處理后裝柱，用水沖至無醇味，上樣過程中，接收流出液進行液相色譜檢測(分析上樣量是否超載)，洗脫梯度為0～30 min，流動相A由5%增至100%。待樣品完全吸附后，依次用水，20%，50%，80%乙醇進行洗脫，洗脫至無色或顏色較淺，將接收的流出液依次編號為：A1、A2、A3……，經(jīng)高效液相色譜檢測進行合并，洗脫梯度為0～30 min，流動相A由5%增至100%。

1.3.4 RP-C18對A27～29組分進行細分 用Sepax GP-C18填料(40～60 μm)自制液相柱優(yōu)化洗脫程序，以確定RP-C18層析柱的洗脫程序。將4 g冷凍干燥樣品(A27～29組分)用50%甲醇完全溶解，濃度為40 mg/mL。根據(jù)分離度選擇優(yōu)化洗脫條件。將液相優(yōu)化程序用于柱層析洗脫程序。將接收的流出液依次編號為：C1、C2、C3……。

1.3.5 組分C16～19的液相半制備 由于半制備時液相色譜采用的色譜柱的靈敏度和分離度都較低，故在進行液相半制備之前，需對半制備條件進行摸索。試驗以分離度和峰型為優(yōu)化目的，設(shè)置了5種流動相組成(體積比)，流動相1、流動相2、流動相3、流動相4和流動相5分別為60∶40的甲醇-0.1%甲酸水、45∶55的甲醇-0.1% 甲酸水、40∶60的乙腈-0.1%甲酸水、30∶70的乙腈-0.1%甲酸水、23∶77的乙腈-0.1%甲酸水，比較分析以獲得最佳流動相分析條件。待條件優(yōu)化后，采用Venusil MP C18(10 mm×250 mm，5 μm)半制備柱，流速增至3 mL/min進行放大制備。為避免樣品浪費，縮短制備時間，還需確定進樣量，試驗設(shè)置了30，50 μL進樣量進行研究。

1.3.6 質(zhì)譜條件

(1) 質(zhì)譜工作站軟件：Agilent MassHunter B.06.00版。色譜工作站軟件：Agilent 1200化學(xué)工作站。

(2) LC-MS工作條件：Unitary C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱，洗脫劑乙腈—水(體積比25∶75)，進樣量2 μL，檢測波長254 nm；電噴霧離子源，正、負離子檢測。

1.3.7 核磁共振檢測條件 溶劑為CH3OD，NMR的工作頻率分別為1H譜500 MHz，13C譜為125 MHz。1H-NMR 譜采樣脈沖寬度90°，累加32次；13C-NMR譜采樣脈沖寬度90°，累加2 000次。

2 結(jié)果與分析

2.1 AB-8型大孔樹脂對樣品進行粗分

根據(jù)HPLC圖的峰型和出峰時間進行合并，A27～29組分出峰相對簡單(如圖 1所示)，3個組分出峰相似，合并，濃縮，冷凍干燥，得到4 g目標(biāo)組分A27～29。

2.2 RP-C18對A27～29組分進行細分

優(yōu)化的洗脫條件見表1，此條件下分離效果較好。將此條件用于A27～29組分的洗脫，即：依次用30%，48%，100%甲醇進行洗脫。通過計算，30%甲醇用量為6 L，48%甲醇用量為4 L，100%甲醇用量為2 L。根據(jù)液相檢測結(jié)果合并為C1、C2～4、C5～10、C11～15、C16～19……，分別減壓濃縮，冷凍干燥，得到C16～19組分0.32 g。圖2中，組分C16～19出峰較為簡單，能夠分離出純化合物，考慮對C16～19組分進行液相半制備。

圖1 A29組分的HPLC分析圖

表1 HPLC洗脫程序

圖2 C16～19組分的HPLC分析圖

2.3 組分C16～19的液相半制備

2.3.1 液相條件的優(yōu)化

(1) 流動相的優(yōu)化：對5個不同流動相進行比較，得到乙腈∶0.1%甲酸水(體積比)=23∶77(流動相5)為最優(yōu)流動相。

由圖3(a)可知，在流動相1條件下，甲醇濃度為60%，由于甲醇濃度過高，造成各峰一起被洗脫，且未達到基線分離，故需要降低甲醇濃度。圖3(b)中，在流動相2條件下，降低甲醇濃度，分離效果仍不太理想，故改用乙腈作為流動相，40%乙腈濃度(流動相3)色譜圖如3(c)，峰一下被洗脫，需降低乙腈濃度，故改用流動相4(30%乙腈)，出峰如圖3(d)，各峰集中，較快被洗脫，說明30%乙腈濃度過高，將乙腈濃度降低到23%(流動相5)，如圖3(e)所示，各峰的分離效果比較好。故優(yōu)化的液相分析條件：流動相A為乙腈(23%)，B為0.1%甲酸水(77%)；優(yōu)化的洗脫條件見表2。

(2) 分離度比較：為判斷物質(zhì)在色譜柱中的分離情況，常用分離度作為柱的總分離效能指標(biāo)，分離度越大則表明物質(zhì)在色譜柱中的分離效果越好。對上述的5種不同的流動相分析條件所得的圖譜進行分離度比較(以色譜圖中第一、第二2個峰之間的分離度計算)，結(jié)果如表3所示。

從圖2(e)、表3可知，在乙腈∶0.1%甲酸水為23 ∶77(體積比)的條件下，分離度較大，分離效果最好，且峰形尖銳，保留時間合適，對環(huán)境有害的有機相使用比例更少。

圖3 C16～19組分在5種不同流動相下的HPLC分析圖

表2 優(yōu)化的C16～19組分HPLC洗脫程序

表3 5種分離條件下的分離度

(3) 制備條件的確定：利用上述優(yōu)化的條件，除將柱子改為半制備柱[Venusil MP C18(10 mm×250 mm，5 μm)，流速改為3 mL/min]外，其他條件不變，即洗脫程序為表2所示。將C16～19組分用23%乙腈溶解，分別對進樣量30，50 μL進行優(yōu)化，所得制備圖(50 μL進樣量色譜見圖4)差異較小，為節(jié)省溶劑，縮短試驗時間及損耗，本試驗選擇進樣量為50 μL。

圖4 C16～19組分的HPLC半制備圖(50 μL)

綜上所述，半制備條件為：流速3 mL/min，進樣量50 μL，流動相A為乙腈，流動相B為0.1%甲酸水，洗脫程序如表2所示(40 min后的梯度為沖洗色譜柱)。

2.3.2 液相半制備 將0.32 g C16～19組分用23%乙腈溶解，濃度為200 mg/mL，按優(yōu)化的條件制備。如圖4所示，峰I、II分離效果較好，分別收集峰I、II。將收集液減壓濃縮，冷凍干燥后，稱重，液相色譜測定純度，并得到純度較高的2個化合物，記為H-01、H-02，其質(zhì)量分別為30，15 mg，提取得率分別為54.5，27.3 mg/kg，純度分別為97.8%，96.5%。2個樣品純度均符合核磁檢測條件。

2.4 化合物的結(jié)構(gòu)解析

2.4.1 H-01 ESI-MS給出：正離子模式下，質(zhì)譜數(shù)據(jù)m/z595.165 7[M+H]+；負離子模式下，質(zhì)譜數(shù)據(jù)m/z593.149 2[M-H]-，推測其分子式為C27H30O15。1H-NMR：6.52(1H，s，H-3)， 6.46(1H，d，J=2 Hz，H-6)，6.63(1H，d，J=2 Hz，H-8)，7.33(2H，m，H-2′，6′)，6.88(1H，s，H-5′)，5.00(1H，m，H-1″)，3.64(1H，m，H-6″a)，4.05(1H，d，J=9.7 Hz，H-6″b)，4.73(1H，s，H-1?)，3.93(1H，s，H-2?)，3.76(1H，d，J=9.4 Hz，H-3?)，1.20(3H，d，J=5.8 Hz，H-6?)。13C-NMR：166.73(C-2)， 104.14(C-3)，183.85(C-4)，162.76(C-5)，101.07(C-6)，164.57(C-7)，96.16(C-8)， 158.67(C-9)，107.00(C-10)，123.37(C-1′)，116.85(C-2′)，146.84(C-3′)，151.06(C-4′)，114.29(C-5′)，120.62(C-6′)，102.05(C-1″)，74.71(C-2″)，77.73(C-3″)，71.31(C-4″)，77.09(C-5″)，67.47(C-6″)，101.54(C-1?)，72.37(C-2?)，72.03(C-3?)，74.03(C-4?)，69.77(C-5?)，17.91(C-6?)。

綜合所有核磁譜圖及質(zhì)譜結(jié)果，H-01鑒定為Luteolin 7-O-α-L-Rhamnosyl(1-6)-β-D-Glucoside(木犀草素7-O-α-L-鼠李糖(1-6)-β-D-葡萄糖苷)，將其1H-NMR、13C-NMR以及質(zhì)譜數(shù)據(jù)與文獻[27]報道的化合物3對照，基本一致。

2.4.2 H-02 質(zhì)譜數(shù)據(jù)m/z449.109 4[M+H]+、碎片離子287.057 5+，推測其分子式為C21H20O11，含有一個黃酮骨架和一個葡萄糖糖苷。1H-NMR：6.56(1H，s，H-3)，6.45(1H，s，H-6)，6.74(1H，s，H-8)，7.37(1H，s，H-2′)，6.89(1H，d，J=8.0 Hz，H-5′)，7.38(1H，d，J=8.0 Hz，H-6′)，5.07(1H，d，J=7.0 Hz，H-1″)， 3.50～3.60(2H，m，H-2″，H-3″)，3.40(1H，m，H-5″)，3.96(1H，d，J=12.2 Hz，H-6″a)，3.72-3.75 (1H，dd，J=12.2，5.6 Hz，H-6″b)。13C-NMR：166.82(C-2)，107.08(C-3)，183.99(C-4)，164.74(C-5)，101.16(C-6),，162.82(C-7)，96.07(C-8)，158.93(C-9)，104.18(C-10)，123.48(C-1′)，114.31(C-2′)，147.03(C-3′)，151.16(C-4′)，116.80(C-5′)，120.53(C-6′)，101.64(C-1″)，74.75(C-2″)，77.86(C-3″)，71.29(C-4″)，78.39(C-5″)，62.49(C-6″)。

綜合所有核磁譜圖及質(zhì)譜結(jié)果，H-02鑒定為Luteolin 7-O-β-D-Glucoside(木犀草素7-O-β-D-葡萄糖苷)，將其1H-NMR、13C-NMR及質(zhì)譜數(shù)據(jù)與文獻[28]報道的化合物1對照，基本一致。

2.5 C16～19組分中木犀草素含量的確定

采用表2優(yōu)化的液相條件，將木犀草苷-7-蕓香糖苷和木犀草素7-O-β-D-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)樣品分別用乙腈溶解，進行液相分析。采用外標(biāo)法，對C16～19組分中的木犀草苷-7-蕓香糖苷和木犀草素7-O-β-D-葡萄糖苷進行定量，結(jié)果表明，2個化合物在C16～19流分中的含量分別為10.4%，5.1%，C16～19流分中H-01和H-02制備的得率分別為90.1%，91.9%，說明該液相制備方法的優(yōu)化合理，可應(yīng)用于類似組分的分離制備。

3 結(jié)論

本研究以洛爾卡(Lorca)為研究對象，開發(fā)了木犀草素類化合物的分離純化新方法，得到純度分別為97.8%和96.5%的木犀草苷-7-蕓香糖苷和木犀草素7-O-β-D-葡萄糖苷，其總提取得率分別為54.5，27.3 mg/kg，與Pandino等[21]研究的朝鮮薊相比，本試驗中所采集的樣品木犀草素類化合物含量中等，若能選擇木犀草素類化合物含量高的樣品，可制備更多的純品。木犀草素糖苷由于B環(huán)具有3’，4’鄰二酚羥基結(jié)構(gòu)，其具有較強的抗氧化功能，分離和純化木犀草素糖苷具有非常重要的意義。