靖州楊梅果酒發(fā)酵菌種篩選、鑒定及發(fā)酵性能研究

陽(yáng)秀蓮劉 偉林樹(shù)花陳萬(wàn)能張菊華,3

(1. 湖南大學(xué)研究生院隆平分院，湖南 長(zhǎng)沙 410125；2. 湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所， 湖南 長(zhǎng)沙 410125；3. 果蔬貯藏加工與質(zhì)量安全湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410125； 4. 湖南省靖州縣湘百仕酒業(yè)有限責(zé)任公司，湖南 懷化 418400)

楊梅(MyricarubraSieb. & Zucc.)為楊梅屬楊梅科喬木或灌木常綠植物。中國(guó)楊梅產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的98%以上[1]，浙江、湖南等省份均有分布。目前湖南楊梅栽培面積約1.0×104hm2，其中，靖州縣栽培面積達(dá)到6 667 hm2，年產(chǎn)楊梅6.0×104t，已成為中西部地區(qū)最大的產(chǎn)區(qū)。楊梅酸甜可口營(yíng)養(yǎng)豐富，不僅能生津止渴、消食解暑[2]，還具有抗氧化[3]、降血糖[4]、抑癌[5]等功效。由于果實(shí)裸露，易受到機(jī)械損傷和微生物侵染，不耐貯運(yùn)且上市集中，極大地制約了楊梅產(chǎn)業(yè)發(fā)展。楊梅酒加工有助于減少采后損失、改善楊梅營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及延長(zhǎng)貨架期，提高水果產(chǎn)業(yè)附加值[6]。

發(fā)酵型楊梅酒是以楊梅汁為原料，加入優(yōu)質(zhì)的釀酒酵母發(fā)酵而成，口感柔和，營(yíng)養(yǎng)豐富，具有楊梅果的典型性。發(fā)酵型果酒品質(zhì)取決于所選擇的酵母性能，酵母菌株的起酵、產(chǎn)酒、產(chǎn)香、耐性等特性不同，其作用也相差甚遠(yuǎn)。選育發(fā)酵性能優(yōu)良、適合特定水果發(fā)酵的專用酵母已成為果酒釀造的研究熱點(diǎn)[7]。釀酒酵母分離篩選主要是在酵母菌活躍存在的地方，如成熟水果、鮮榨果汁、果園土壤、空氣和發(fā)酵醪[8]。目前，已從草莓[9]、人參果[10]、獼猴桃[11]等水果中篩選出發(fā)酵專用酵母，并開(kāi)展了發(fā)酵性能和工藝優(yōu)化等的研究。但目前市場(chǎng)上幾乎沒(méi)有楊梅果酒專用酵母，分離篩選適宜釀造楊梅酒菌種的研究也鮮有報(bào)道。僅杜晶等[12]從楊梅果園周邊環(huán)境及自然發(fā)酵醪中篩選鑒定4株酵母(1株釀酒酵母和3株非釀酒酵母屬酵母)，其發(fā)酵性能還有待研究。

本研究為挖掘靖州楊梅主產(chǎn)區(qū)的酵母資源，擬從土壤及果品表面開(kāi)展酵母菌株的篩選，篩選出起酵速率快、酒精轉(zhuǎn)化率高、酒精耐受力高、抗SO2能力強(qiáng)和風(fēng)味獨(dú)特的優(yōu)質(zhì)楊梅釀酒酵母，并進(jìn)行菌株鑒定，確定菌株的最佳生長(zhǎng)條件，以期為工業(yè)化生產(chǎn)提供優(yōu)良發(fā)酵劑。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品采集

從靖州縣多個(gè)楊梅園采集鮮果、楊梅葉和土壤。

1.1.2 培養(yǎng)基

麥芽汁培養(yǎng)基、酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(YPD培養(yǎng)基)、酵母浸出粉胨葡萄糖液體培養(yǎng)基(YPD液體培養(yǎng)基)：自然pH值，115 ℃高壓滅菌15 min，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；

2,3,4-氯化三苯基四氮唑(TTC)上層培養(yǎng)基：添加0.05% TTC試劑至滅菌冷卻約50 ℃的YPD培養(yǎng)基中混合均勻；

TTC下層培養(yǎng)基：YPD培養(yǎng)基。

1.1.3 主要試劑與儀器

蔗糖：食品級(jí)，大潤(rùn)發(fā)超市；

TTC：分析純，上海靈錦精細(xì)化工有限公司；

其他試劑：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

智能恒溫恒濕培養(yǎng)箱：HWS型，寧波江南儀器廠；

全自動(dòng)色度分析儀：Color Quest XE型，美國(guó)HunterLab公司；

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：UV-1800型，島津儀器(蘇州)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株分離

(1) 樣品處理：分別稱取土壤、楊梅果、樹(shù)葉各10 g于90 mL YPD液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)24 h，取上清液梯度稀釋，涂布于YPD培養(yǎng)基上，倒置培養(yǎng)2～3 d[13]。楊梅果實(shí)破碎去核榨汁，裝入無(wú)菌三角瓶中發(fā)酵，不定期振搖，發(fā)酵第1，3，5，7天取樣，梯度稀釋涂布于YPD培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2～3 d。培養(yǎng)溫度均為28 ℃。

(2) 分離純化：挑選具有典型酵母特征的菌落進(jìn)行平板劃線，純化后接種至YPD斜面培養(yǎng)12～24 h，置于4 ℃冰箱保存[14]。

1.2.2 酵母篩選

(1) 一級(jí)篩選(TTC顯色法)：參考文獻(xiàn)[15]。

(2) 二級(jí)篩選(杜氏管法)：參考文獻(xiàn)[12]修改如下，菌種添加量為5%(菌液濃度為107CFU/mL)，楊梅汁的SSC為7%，pH為3.0，85 ℃水浴加熱15 min后迅速冷卻。

(3) 三級(jí)篩選(糖發(fā)酵試驗(yàn))：參考文獻(xiàn)[16]修改如下， 5 mL 的豆芽汁中分別加入葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、果糖，不加糖的豆芽汁為對(duì)照組。

(4) 四級(jí)篩選(楊梅酒發(fā)酵法)：活化酵母菌液，接種量為5%，SO2添加量為50 mg/L、加糖量為170 g/L，楊梅汁pH為2.7，主發(fā)酵溫度 24 ℃，主發(fā)酵停止后測(cè)定總糖、總酸、總花色苷、色差值并進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。

1.2.3 形態(tài)學(xué)觀察 將斜面保藏的酵母在YPD平板上劃線，28 ℃培養(yǎng)3～4 d后觀察菌落形態(tài)，并制成菌懸液，在10×100倍顯微鏡下觀察菌株的形態(tài)及出芽方式等。

1.2.4 分子生物學(xué)鑒定 采用上海生工Ezup柱式酵母基因組DNA抽提試劑盒提取菌株DNA，對(duì)26S rDNA中的D1/D2區(qū)域基因進(jìn)行序列擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖電泳進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)純化后送至生工生物工程(上海)公司測(cè)序，在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)的BLAST程序中比對(duì)，用MEGA 4.0繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，確定菌株的種屬。

1.2.5 酵母發(fā)酵性能

(1) 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定：參考文獻(xiàn)[17]修改如下，將菌液以1%的接種量分別接種至18瓶麥芽汁培養(yǎng)基中，設(shè)置1瓶未接種的發(fā)芽汁為空白對(duì)照，28 ℃振蕩培養(yǎng)，前期每2 h取樣，后期每4 h或6 h間隔取樣，據(jù)實(shí)際情況稀釋，測(cè)定麥芽汁培養(yǎng)基的OD值(600 nm)，重復(fù)3次，繪制生長(zhǎng)曲線。

(2) 酵母耐糖、SO2、pH、酒精性能研究：將菌株活化后接種至YPD液體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)12 h，接種量為3%，分別添加菌液至含SSC(16%，20%，24%，28%，32%)的YPD液體培養(yǎng)基、含SO2(40，80，120，160，200 mg/L)的YPD液體培養(yǎng)基、含酒精(8%，10%，12%，14%，16% Vol)的YPD液體培養(yǎng)基和不同pH值(2.0，2.5，3.0，3.5，4.0)的YPD液體培養(yǎng)基中。28 ℃振蕩培養(yǎng)48 h，取樣稀釋10倍，測(cè)量其OD值(600 nm)，重復(fù)3次。

1.2.6 檢測(cè)方法

(1) 總糖：采用直接滴定法[18]5。

(2) 總酸：采用電位滴定法[18]7。

(3) 酒精度：采用酒精計(jì)法[18]4。

(4) 色差值：采用色差儀測(cè)定。

(5) TSS：采用手持糖度儀測(cè)定。

(6) pH值：采用pH計(jì)測(cè)定。

(7) 總花色苷：采用pH示差法[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母的分離

從靖州縣不同楊梅園中采集樣本共67份，經(jīng)梯度稀釋涂布、分離純化和菌落形態(tài)觀察后共得到172株菌，其中土壤43株，楊梅葉32株，鮮果59株，發(fā)酵汁38株。

2.2 酵母的篩選

2.2.1 一級(jí)篩選 利用TTC顯色原理對(duì)酵母菌株的活性和產(chǎn)酒精能力進(jìn)行篩選。菌落顏色越深，表明其活性越高，產(chǎn)酒精能力越強(qiáng)；呈淺紅色或無(wú)色，表明其活性較低，產(chǎn)酒精能力較弱或不產(chǎn)酒精[20]。TTC顯色反應(yīng)后的菌株呈色情況如圖1所示，共有65株呈深紅色，49株呈玫紅色，37株呈淡粉色，21株基本無(wú)顏色變化。TTC顯色法中選取菌落顏色呈深紅色的65株菌株進(jìn)行下一步篩選。

圖1 TTC平板顯色篩選

2.2.2 二級(jí)篩選 酵母發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生CO2氣體，杜氏管中氣泡的體積和數(shù)量可直接反映菌株發(fā)酵的起酵速度和發(fā)酵能力[21]。通過(guò)杜氏管篩選試驗(yàn)，篩選出能在低pH的楊梅汁中發(fā)酵產(chǎn)氣，且在48 h內(nèi)充滿杜氏管的菌株[22]。如表1所示，19株在48 h內(nèi)充滿杜氏管，36株規(guī)定時(shí)間內(nèi)未充滿杜氏管或沒(méi)有明顯產(chǎn)氣現(xiàn)象。選取充滿杜氏管的19株進(jìn)行下一步篩選。

表1 杜氏管產(chǎn)氣情況?

? “+”表示杜氏管已充滿；“-”表示杜氏管未充滿。

2.2.3 三級(jí)篩選 碳源的利用能力是考察菌株性能的一個(gè)重要指標(biāo)，在糖發(fā)酵試驗(yàn)中，菌株對(duì)各類糖的利用程度不一[23]。如表2所示，72 h內(nèi)充滿杜氏管的菌株，蔗糖組有9株，葡萄糖組有9株，果糖組有11株，麥芽糖組和對(duì)照組無(wú)充滿現(xiàn)象。結(jié)果表明，果糖最易被菌株利用，起酵速度快且產(chǎn)氣速率高，蔗糖和葡萄糖次之。但考慮工廠實(shí)際成本，添加蔗糖(白砂糖)作為菌株能量來(lái)源最為經(jīng)濟(jì)，故選取能有效利用蔗糖的9株菌株進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

表2 不同糖發(fā)酵72 h杜氏管產(chǎn)氣結(jié)果?

? “-”表示杜氏管中沒(méi)有氣泡產(chǎn)生；“+”表示杜氏管中有氣泡產(chǎn)生但未被充滿；“√”表示杜氏管已被充滿。

2.2.4 四級(jí)篩選 通過(guò)比較9株菌發(fā)酵果酒的各項(xiàng)指標(biāo)，篩選出發(fā)酵能力強(qiáng)、香氣濃郁、色澤鮮亮的菌株。

由圖2可知， DY5與JW14發(fā)酵果酒在色澤和香氣特征方面最為突出，綜合感官評(píng)分高，具有濃郁和諧的果香和酵母香，但酒味不突出；RY1具有較好的酒香味，其果香不明顯，滋味和風(fēng)格最好，綜合評(píng)分較高；其他6株發(fā)酵果酒整體評(píng)分偏低，風(fēng)格和滋味特征不顯著。結(jié)果表明，JW14與DY5色澤顯著；DY5香氣顯著；RY1在風(fēng)格與滋味上顯著，此3株菌株的綜合感官評(píng)分高于其他菌株。

圖2 果酒感官評(píng)分雷達(dá)圖

通過(guò)色差L*、a*、b*值(圖3)結(jié)合總花色苷(表3)含量可知，楊梅汁的顏色最深，L*值最小，總花色苷含量最高，為187.491 mg/L。在發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)酵溫度、SO2添加量、pH、酵母菌株等因素會(huì)引起果酒色澤和花色苷含量的變化[24]。在9株酵母發(fā)酵果酒中，顏色最深的為DY5和JW14，其色差值相差較小，但DY5總花色苷含量最高；RY1顏色稍淺，可能是該菌株活性高對(duì)花色苷的降解作用大而導(dǎo)致；其他果酒花色苷含量低，色澤較差。

圖3 發(fā)酵楊梅酒的色差值比較

表3 菌株發(fā)酵楊梅酒的理化指標(biāo)?

? “-”表示該指標(biāo)未檢測(cè)。

楊梅酒理化指標(biāo)如表3所示，RY1酒精度最高，DY5和JW14次之，其他楊梅酒的酒精度皆低于6% Vol；總糖含量RY1最低，DY5和JW14較低，其他楊梅酒的總糖含量比RY1高2.7～3.4倍。在初始糖含量相等的情況下，總糖含量越低，酒精度越高，則菌株的發(fā)酵能力越強(qiáng)。由于楊梅汁的總酸含量較高，采用小容器發(fā)酵且未進(jìn)行降酸處理，導(dǎo)致9株菌發(fā)酵的楊梅酒口感偏酸[25]。

綜上，RY1菌株的產(chǎn)酒精能力強(qiáng)，感官評(píng)分高，酵母活性好，適合普通的楊梅果酒釀造。DY5菌株和JW14菌株產(chǎn)酒精能力較強(qiáng)，果酒中果香濃郁，總花色苷含量高，酒體顏色艷麗，感官評(píng)分高，適合釀造低度數(shù)果酒飲料或協(xié)助增香。此3株酵母具有較好的應(yīng)用前景，故選取RY1、DY5、JW14 3株菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)鑒定。

2.3 形態(tài)學(xué)鑒定

DY5、RY1、JW14 3株菌株的形態(tài)見(jiàn)圖4。

(1) DY5菌株：菌落呈圓形，菌株平整，乳白色，中心處顏色較深，邊緣整齊，菌落光滑濕潤(rùn)易挑起，有濃郁的酵母香；細(xì)胞形態(tài)為紡錘狀，出芽生殖。

(2) RY1菌株：菌落呈圓形，中心點(diǎn)凸起，色澤呈乳白色，顏色均勻，邊緣整齊，菌落光滑濕潤(rùn)易挑起，有輕微的酒香；細(xì)胞形態(tài)為球形，出芽生殖。

(3) JW14菌株：菌落呈圓形，中心點(diǎn)微凸起，乳白色，邊緣處顏色微淺，顏色似同心圓狀，表面光滑不黏稠，不易挑起，有較濃郁的酵母香；細(xì)胞形態(tài)為紡錘狀，出芽生殖。

2.4 分子生物學(xué)鑒定

以NL1和NL4為引物，對(duì)篩選得到的酵母菌進(jìn)行了26S rDNA D1/D2區(qū)域序列擴(kuò)增,得到的電泳圖如圖5所示。

圖4 酵母菌形態(tài)特征圖

將所得堿基序列在NCBI上比對(duì)，RY1的序列長(zhǎng)度為588 bp，確定該酵母為釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)；DY5的序列長(zhǎng)度為586 bp，確定該酵母為仙人掌有孢漢遜酵母(Hanseniasporaopuntiae)；JW14的序列長(zhǎng)度585 bp，確定該酵母為有孢漢遜酵母屬(Hanseniasporapseudoquilliermondii)，各株菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖6～8所示。

2.5 酵母發(fā)酵性能

2.5.1 生長(zhǎng)曲線測(cè)定 如圖9所示，菌株RY1與菌株DY5活性較高，前2 h為延滯期，之后迅速進(jìn)入對(duì)數(shù)期，RY1對(duì)數(shù)期時(shí)長(zhǎng)為16 h，在18 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，其進(jìn)入對(duì)數(shù)期早，時(shí)間長(zhǎng)；DY5菌株對(duì)數(shù)期時(shí)長(zhǎng)為14 h；JW14菌株的延滯期稍長(zhǎng)，呈指數(shù)增長(zhǎng)速度較慢，在16 h以后趨于平穩(wěn)。3株菌株在48 h內(nèi)沒(méi)有明顯的衰亡期，與前人[26-27]研究結(jié)果一致。

1. JW14菌株 2. DY5菌株 3. RY1菌株 M. Mark

2.5.2 高糖耐受性 在楊梅果酒發(fā)酵過(guò)程中需添加蔗糖，為酵母的生長(zhǎng)代謝提供充足的能量。糖原添加量過(guò)高會(huì)降低酵母活性，抑制其生長(zhǎng)。耐受較高濃度糖溶液的菌株，其產(chǎn)酒精能力強(qiáng)，可降低發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)菌株本身的毒害和抑制作用[28]。由圖10可知，3株酵母菌在SSC為16%時(shí)，OD值最大，表明該糖濃度下菌株生長(zhǎng)旺盛；隨著SSC增加，OD值均有所減小；在SSC為32%時(shí)，RY1菌株與DY5菌株的OD值略有下降，JW14菌株的曲線變化較大，OD值最小。結(jié)果表明，含糖量越高，酵母在高滲透壓的環(huán)境下其生長(zhǎng)活性受到了一定的抑制，其中RY1具有在高糖溶液下發(fā)酵的潛力，DY5菌株和JW14菌株適合在正常糖含量的環(huán)境下發(fā)酵。

圖6 菌株RY1系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

圖7 菌株DY5系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

圖8 菌株JW14系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

圖9 菌株生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

圖10 菌株高糖耐受性

2.5.3 SO2耐受性 在果酒發(fā)酵過(guò)程中，SO2添加量過(guò)低，發(fā)酵液易受到雜菌的污染；SO2添加量過(guò)高，酵母的生長(zhǎng)繁殖受到抑制，發(fā)酵進(jìn)程緩慢[29]。由圖11可知，3株菌株的OD值隨SO2添加量增加而有所減小，在SO2添加量為200 mg/L 時(shí)，仍保持較高的活性，OD值相差較小。加入高濃度的SO2，菌株前期受到抑制，在震蕩培養(yǎng)過(guò)程中SO2加速揮發(fā)，其抑制能力減弱，菌株正常生長(zhǎng)，在48 h后測(cè)其OD值，數(shù)值變化不大。結(jié)果表明3株酵母均能耐受200 mg/L的SO2添加量。

圖11 菌株SO2耐受性

2.5.4 低pH耐受性 耐酸性是考察酵母性能的一個(gè)重要指標(biāo)，楊梅果汁中的pH值普遍較低，為3.0左右，菌株的低pH耐受性強(qiáng)，可降低發(fā)酵液被污染的風(fēng)險(xiǎn)。由圖12 可知，RY1菌株最適生長(zhǎng)pH值為3.0，DY5菌株和JW14菌株的最適生長(zhǎng)pH為3.5。3株菌株都能耐受pH 2.0的環(huán)境，在pH 2.5及以上能較好地生長(zhǎng)，在pH 3.0 左右生長(zhǎng)旺盛，此pH與楊梅汁相近，因此均適合楊梅酒發(fā)酵。

圖12 菌株pH耐受性

2.5.5 酒精耐受性 酵母菌在產(chǎn)酒精的同時(shí)，自身會(huì)受到脅迫作用，酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)會(huì)因酒精的毒害作用而受到抑制，從而影響發(fā)酵液中酒精的形成[30]。菌株對(duì)酒精的耐受性分為3個(gè)等級(jí)：只能耐受酒精含量為6% Vol以下的菌株，乙醇耐受性差；能耐受6%～10% Vol，菌株耐受性一般；能耐受11% Vol及以上的對(duì)酒精具有高耐受性[31]。由圖13可知，菌株RY1、DY5與JW14隨著酒精體積分?jǐn)?shù)增大，OD值稍有下降，在酒精含量為16% Vol時(shí)，OD值下降不明顯，菌株仍保持較好的活性，說(shuō)明3株菌株均能耐受高酒精含量的溶液，能滿足楊梅酒的釀造需求[32]。

圖13 菌株酒精耐受性

綜上所述，通過(guò)測(cè)定RY1、DY5、JW14菌株在高糖、低pH、高SO2添加量及高酒精體積分?jǐn)?shù)環(huán)境下的耐受性，發(fā)現(xiàn)釀酒酵母RY1的活力最高，耐受性最強(qiáng)，能在SSC 36%、pH 2.0、SO2添加量200 mg/L、酒精含量16% Vol 的環(huán)境下保持較好的生長(zhǎng)活性；JW14酵母活性較低，其耐受性相對(duì)較差，勉強(qiáng)能耐受32%的高糖溶液和pH 2.0 的低酸溶液；DY5酵母活性及耐受性介于菌株RY1和JW14之間，3株酵母的性能符合果酒釀造要求，適用于發(fā)酵楊梅酒。

3 結(jié)論

本研究篩選出3株綜合性能優(yōu)良的菌株，經(jīng)分子生物學(xué)鑒定：菌株RY1為釀酒酵母屬(Saccharomycescerevisiae)，菌株DY5為仙人掌有孢漢遜酵母屬(Hanseniasporaopuntiae)，菌株JW14為有孢漢遜酵母屬(Hanseniasporapseudoquilliermondii)。通過(guò)耐受性試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)RY1酵母活性高，產(chǎn)酒精能力及耐受性強(qiáng)，香氣協(xié)調(diào)，適合發(fā)酵楊梅果酒；DY5和JW14酵母酒精發(fā)酵能力一般，具有較好的產(chǎn)香能力，適宜發(fā)酵低度數(shù)楊梅飲料和輔助發(fā)酵增香。

但有關(guān)湖南地區(qū)酵母菌的生理生化、發(fā)酵特性及其進(jìn)一步利用仍需繼續(xù)研究。