可切換親水溶劑高效提取藻油及巖藻黃素含量分析

孫維維，林 欣，史博文，溫運(yùn)啟，李兆杰，姜曉明，黃文燦，薛長湖

(中國海洋大學(xué) 食品學(xué)院，山東 青島 266003)

巖藻黃素是一種主要的海洋類胡蘿卜素，在一些大型和微型藻類中大量存在，占自然界類胡蘿卜素估計總產(chǎn)量的10%以上。在微藻中尋找天然巖藻黃素來源時發(fā)現(xiàn)，三角褐指藻含有的巖藻黃素為主要類胡蘿卜素[1]。巖藻黃素及其代謝產(chǎn)物已被證明具有多種益處[2]，包括抗氧化、抗炎、抗癌和抗肥胖效果[3-4]。Maeda等[5]證明，在小鼠和大鼠的飲食中添加巖藻黃素導(dǎo)致其腹部白色脂肪組織減少。因此，巖藻黃素值得進(jìn)一步研究。

目前從微藻中提藻油的方法主要使用有機(jī)溶劑提取，經(jīng)過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到藻油[6-7]，如果要投入工廠化生產(chǎn)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)耗能巨大。本文采用可切換溶劑，用CO2和水，節(jié)能高效地提取藻油?？汕袚Q溶劑是可以轉(zhuǎn)換親水親油特性的一種特殊液體，在通入或者去除CO2的情況下可逆地從一種形式切換到另一種形式[8]，包括可轉(zhuǎn)換親水性溶劑(SHS)和可轉(zhuǎn)換極性溶劑(SPS)[9]，其不揮發(fā)且不易燃，從而避免溶劑回收過程中的揮發(fā)或蒸餾。作為提取溶劑，SHS比SPS以及常規(guī)提取溶劑更具吸引力，因為SHS更適合提取含水量較多的物料。如果SPS提取含水量較高的物料則會形成一種碳酸氫鹽[10]。除此之外，SHS價格更低，更穩(wěn)定。SHS與水的混溶性是完全可逆的，因為在輕輕地除去(即用低熱量，用惰性氣體鼓泡)之后，SHS會返回到原來的疏水狀態(tài)。Huang等[11]提出用可切換溶劑N，N-二甲基環(huán)己胺(DMCHA)從雨生紅球藻中提取蝦青素。

本文探討可切換親水溶劑DMCHA提取三角褐指藻藻油的可行性，探究三角褐指藻干粉以及80%水分含量的三角褐指藻藻泥的藻油得率隨著時間以及料液比的變化，用掃描電鏡觀察三角褐指藻干粉提油前后的表面結(jié)構(gòu)變化，并分析比較了氯仿甲醇法、乙醇法、DMCHA法提取的藻油巖藻黃素含量，最后通過分析藻油中溶劑殘留判斷分離效果。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

三角褐指藻藻泥，青島能源所提供。藻泥儲存在-20℃，藻泥凍干后得到的干粉儲存在干燥器皿內(nèi)。

乙腈(色譜純)，德國Merck公司；甲基叔丁基醚(色譜純)，美國Muskegon公司；鹽酸、N,N-二甲基環(huán)己胺(DMCHA)、對苯二甲酸二甲酯、二氯甲烷、氯仿、無水乙醇、D-14己烷，均為分析純。

磁力攪拌器；循環(huán)水式真空泵；TGL-20K離心機(jī)；1100型HPLC儀(配有二極管陣列檢測器),美國Agilent公司；Lab-1A-50E冷凍干燥機(jī)；UV-2550紫外分光光度計，日本島津公司；Hitachi S-4800掃描電子顯微鏡，日本Hitachi；MMV-1000W型振搖器；核磁日本精密電子天平；RE52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；布魯克600 MHz核磁共振譜儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 三角褐指藻藻油提取

分別稱量三角褐指藻藻泥和干粉1 g加入一定量的DMCHA。將微藻-DMCHA混合物在室溫下磁力攪拌一段時間。然后，以7 000 r/min離心5 min。上清液加入相當(dāng)于DMCHA兩倍體積的H2O，并使用氣體分散管對混合物進(jìn)行CO2鼓泡15 min。在藻油層漂浮到溶液頂部之后，收集藻油入玻璃瓶中，放入-20℃的冰箱中儲存。

1.2.2 巖藻黃素含量測定

1.2.2.1 提取

氯仿甲醇法：取三角褐指藻干粉1 g，加入20 mL 氯仿甲醇(體積比2∶1)混合溶劑，室溫磁力攪拌器提取1 h后抽濾，濾液加入與甲醇等體積的水，靜置分層后取氯仿層旋蒸得到藻油，溶于乙腈中并用0.22 μm的濾膜過濾于液相小瓶中待檢測。

乙醇法：取三角褐指藻干粉1 g，加入20 mL無水乙醇，室溫磁力攪拌器提取3 h后抽濾，濾液旋蒸得到藻油，溶于乙腈中并用0.22 μm的濾膜過濾于液相小瓶中待檢測。

DMCHA法：取三角褐指藻干粉1 g，加入20 mL DMCHA，室溫磁力攪拌器提取3 h后加水通CO2后得到藻油，溶于乙腈中并用0.22 μm的濾膜過濾于液相小瓶中待檢測。

1.2.2.2 液相色譜分析

使用裝備有紫外檢測器(日本京都島津的SPD-20A)和Eclipse XDB-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)的HPLC測定巖藻黃素含量。流動相為80%的乙腈(A)和20%甲基叔丁基醚(B)；流速0.8 mL/min；洗脫程序為0～8 min 100%A，8～16 min 90%A，16～22 min 100%A；柱溫25℃；進(jìn)樣量30 μL；檢測波長450 nm。

1.2.3 藻粉提油前后表面結(jié)構(gòu)變化

使用掃描電子顯微鏡在20 kV的加速電壓下表征三角褐指藻干粉提油前后的形態(tài)[12]。

1.2.4 藻油中DMCHA殘留量分析

2 結(jié)果與討論

2.1 三角褐指藻干粉的藻油得率

選擇三角褐指藻干粉為原料，在室溫下，測定三角褐指藻干粉在不同料液比、不同提取時間條件下的藻油得率。結(jié)果見圖1。

由圖1可知，隨著料液比由1∶5增加到1∶25，藻油得率不斷上升，增長趨勢逐漸降低，到1∶15之后藻油得率緩慢增長，到1∶20之后幾乎無增長。根據(jù)傳質(zhì)平衡的原理，在一定范圍內(nèi)，提取溶劑越多，溶解于其中的油越多，得率越高[14]。隨著提取時間延長，藻油得率也逐漸增加，到12 h以后趨于穩(wěn)定。隨著提取時間的延長，藻粉與提取溶劑中的油濃度差不斷縮小，一定時間后，二者中的油濃度基本相同，此時擴(kuò)散基本達(dá)到平衡[15]。最終干粉藻油得率在料液比1∶25、提取時間24 h條件下達(dá)到21.29%。

圖1 三角褐指藻干粉藻油得率隨料液比、提取時間的變化

2.2 三角褐指藻藻泥的藻油得率

選擇三角褐指藻藻泥為原料，在室溫下，測定三角褐指藻藻泥在不同料液比、不同提取時間條件下的藻油得率。結(jié)果見圖2。

圖2 三角褐指藻藻泥藻油得率隨料液比、

由圖2可知，三角褐指藻藻泥的藻油得率明顯比干粉藻油得率低，隨著料液比由1∶5增加到1∶25，藻油得率先快速上升，到1∶20之后藻油得率趨于穩(wěn)定。隨著提取時間延長，藻油得率也逐漸增加，到12 h后趨于穩(wěn)定，與三角褐指藻干粉提取藻油的趨勢一致。最終三角褐指藻藻泥的藻油得率在料液比1∶25、提取時間24 h條件下達(dá)到13.29%。

2.3 藻油中巖藻黃素含量

2.3.1 巖藻黃素的全波長掃描(見圖3)

由圖3可知，三角褐指藻DMCHA提取液顯示出巖藻黃素的特征吸收峰，最大的吸收峰在449 nm，可以確定提取液中主要成分為巖藻黃素。此外，在667 nm波長處有一個小的吸收峰，查閱文獻(xiàn)[16-17]可知，此處為葉綠素的特征峰，說明提取液中含有一定量的葉綠素。

圖3 巖藻黃素提取液全波長掃描

2.3.2 不同提取方法的巖藻黃素含量比較(見表1)

表1 氯仿甲醇法、DMCHA法、乙醇法提取藻油巖藻黃素含量比較 mg/g

由表1可以看出，DMCHA法提取的藻油巖藻黃素總含量為9.17 mg/g，與氯仿甲醇法總含量相差不大，證明其能較好地提取出巖藻黃素。相同提取條件下乙醇法提取的巖藻黃素總含量最高，與之前的研究相符[1]?？赡苁菐r藻黃素溶出速率比較高，且乙醇對巖藻黃素的溶解度高。與氯仿甲醇法和乙醇法相比，DMCHA法提取的巖藻黃素異構(gòu)體I含量最低，值得進(jìn)一步探究其原因及改進(jìn)措施來提高DMCHA對巖藻黃素的提取率。

2.4 提油前后三角褐指藻干粉的表面結(jié)構(gòu)變化(見圖4)

A

B

由圖4A可知，提油前，三角褐指藻干粉具有規(guī)則的表面并且被油性物質(zhì)覆蓋而沒有明顯的破壞。提油后(圖4B)，三角褐指藻干粉更加分散，且表面出現(xiàn)許多空隙，證明DMCHA破壞了三角褐指藻整體結(jié)構(gòu)的完整性，從而增加了藻油的溶出。

2.5 DMCHA在藻油中的殘留(見圖5)

由圖5可知，在藻油層中存在19.861 mg DMCHA，相當(dāng)于DMCHA添加量(10 mL)的0.231%。證明所提取的藻油溶劑殘留很低，分離效果很好。另外水層胺恢復(fù)成油溶性DMCHA之后經(jīng)測定，溶劑回收率為93.2%，可以循環(huán)使用。

注：A為對苯二甲酸二甲酯的苯環(huán)上的氫峰，B為對苯二甲酸二甲酯的特征性甲基氫峰，C為DMCHA的特征性甲基氫峰，D為溶劑(D-14己烷)特征峰。

圖5 藻油中DMCHA殘留核磁圖

3 結(jié) 論

本文用可切換親水溶劑DMCHA從三角褐指藻干粉以及藻泥中提取藻油，與氯仿甲醇法提取的藻油中巖藻黃素總含量相差不大，低于乙醇法提取的藻油中巖藻黃素總含量。在室溫下，料液比1∶25提取24 h，三角褐指藻干粉藻油得率為21.29%，藻泥藻油得率為13.29%。因此，用干粉作為藻油的提取原料時提取效率更高。DMCHA溶劑的回收率為93.2%，藻油中DMCHA殘留量為DMCHA添加量的0.231%。