欣力康膠囊對(duì)Lewis肺癌模型小鼠生存期的影響及作用機(jī)制初探

王 青 ，闕祖俊，田建輝

目前肺癌已成為發(fā)病率和死亡率增長(zhǎng)最快的惡性腫瘤，且肺癌轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致死亡的主要原因。欣力康膠囊是中藥復(fù)方制劑，具有補(bǔ)氣養(yǎng)血，化瘀解毒等功效，可用于癌癥放化療的輔助治療[1-2]，增強(qiáng)放化療的療效[3]，提高生活質(zhì)量，預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移[4]。前期體外研究結(jié)果表明，欣力康膠囊對(duì)人肺癌細(xì)胞，鱗癌細(xì)胞及乳腺癌細(xì)胞等均有一定程度的抑制作用[5-6]。但是，欣力康膠囊在體內(nèi)對(duì)肺癌的藥效并不清楚，而且缺乏作用機(jī)制的研究。STAT3與NFκB信號(hào)通路能夠影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展，遷移侵襲及分化[7]，并且與機(jī)體免疫及炎癥均有密切關(guān)系[8-9]。本研究通過尾靜脈注射肺癌細(xì)胞建立了肺轉(zhuǎn)移模型小鼠，觀察了不同濃度的欣力康膠囊對(duì)肺轉(zhuǎn)移模型小鼠生存期和生存狀態(tài)的影響，同時(shí)研究了欣力康對(duì)STAT3與NFκB信號(hào)通路的作用，以期為欣力康預(yù)防肺癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的臨床用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 小鼠（C57BL/6小鼠，6～7周齡，體質(zhì)量約20 g）；注射細(xì)胞（對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LLC-luc細(xì)胞）；注射器；生理鹽水；欣力康膠囊。

1.2 造模 采用實(shí)驗(yàn)性肺轉(zhuǎn)移模型進(jìn)行藥效評(píng)價(jià)[10-11]。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LLC-luc細(xì)胞，將細(xì)胞消化后用生理鹽水洗滌一次，將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×107個(gè)/mL。將飼養(yǎng)的C57BL/6小鼠分為3組，每組10只。每只小鼠尾靜脈注射上述細(xì)胞懸液0.1 mL，造模后自由飲食與進(jìn)水。

1.3 藥物溶解及配制 取欣力康膠囊（0.45 g/粒）20粒，將粉末倒出，稱取8.0 g，置于20 mL定量容量瓶中。加入10 mL水，超聲10 min溶解，定容，配制成0.40 g/mL的樣品溶液。取3 mL繼續(xù)稀釋5倍，配制成0.08 g/mL的樣品溶液。

1.4 給藥 按照動(dòng)物-人體計(jì)量換算公式，人：0.45 g/?！??！?次=6.75 g/d，計(jì)算小鼠每日劑量：6.75 g/70 kg×9.1×20 g/只=17.5 mg/只。將小鼠分為3組，分組給藥，造模后第2 d開始給藥，直至小鼠死亡。生理鹽水組：灌胃生理鹽水，0.22 mL每只，1次/d；低濃度欣力康組（臨床劑量）：灌胃低濃度欣力康溶液（0.08 g/mL），0.22 mL每只，1次/d；高濃度欣力康組（5倍臨床劑量）：灌胃高濃度欣力康溶液（0.40 g/mL），0.22 mL每只，1次 /d。

1.5 Luciferase活性測(cè)定 構(gòu)建分別轉(zhuǎn)染了STAT3-luciferase報(bào)告基因質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染了NFκB-luciferase報(bào)告基因質(zhì)粒的腫瘤細(xì)胞，體外培養(yǎng)。細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，收集細(xì)胞，1000 r/min離心5 min。棄上清，適量培養(yǎng)基懸浮，調(diào)整細(xì)胞濃度至3×105/mL。將細(xì)胞懸液接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL，放置細(xì)胞培養(yǎng)箱（37℃，5%CO2）中培養(yǎng)48 h。吸去培養(yǎng)基，每孔加入100 μL稀釋好的藥物（欣力康膠囊0.1、0.5、1、5、10 mg/mL），每藥設(shè)2個(gè)復(fù)孔。設(shè)4個(gè)陽(yáng)性對(duì)照孔，兩個(gè)陰性對(duì)照孔，培養(yǎng)1 h。每孔加入激動(dòng)劑Interleukin-6/Tumor necrosis factor-α （IL-6/TNF-α）11 μL，培養(yǎng)5.5 h。棄去培養(yǎng)基，每孔加入1×細(xì)胞裂解液30 μL，震蕩使細(xì)胞充分裂解。取20 μL到酶標(biāo)板中，加入30 μL熒光素酶底物。酶標(biāo)儀檢測(cè)，計(jì)算各濃度下的抑制率。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法 通過Kaplan-Meier方法計(jì)算存活分析，并通過log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行比較，P＜0.05代表具有顯著性差異。所有數(shù)據(jù)用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析, 均數(shù)比較采用One-way ANOVA方差分析，P＜0.05代表具有顯著性差異，Post test檢測(cè)采用Bonfemoni法分析，計(jì)算各組間統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性。

2 結(jié)果

2.1 小鼠肺癌肺轉(zhuǎn)移模型構(gòu)建成功 尾靜脈注射LLC-luc細(xì)胞的C57BL/6小鼠，造模2周后進(jìn)行解剖。結(jié)果顯示，LLC-luc細(xì)胞只轉(zhuǎn)移到了肺部，腎臟及其他部位并無發(fā)生轉(zhuǎn)移（圖1）。說明肺癌肺轉(zhuǎn)移模型構(gòu)建成功。

圖1 尾靜脈注射肺癌肺轉(zhuǎn)移造模結(jié)果

2.2 欣力康膠囊改善模型小鼠生存狀態(tài) 生理鹽水組小鼠普遍表現(xiàn)為精神萎靡、嗜睡、毛色無光澤、基本無活動(dòng)，且極少進(jìn)食與飲水；低濃度欣力康組小鼠表現(xiàn)與生理鹽水組相似；高濃度欣力康組小鼠精神狀態(tài)明顯改善、毛色相對(duì)光澤、活動(dòng)性增強(qiáng)，且進(jìn)食與飲水量明顯增加。說明欣力康膠囊能夠明顯改善小鼠生存狀態(tài)。

2.3 欣力康膠囊延長(zhǎng)模型小鼠生存期 分別計(jì)算3組小鼠的中位生存時(shí)間，生理鹽水組小鼠中位生存時(shí)間為17 d，低濃度欣力康組為17.5 d，高濃度欣力康組為21 d（見表1）。高濃度欣力康組小鼠生存時(shí)間明顯長(zhǎng)于生理鹽水組（P＜0.05，圖2）。表明欣力康膠囊能夠延長(zhǎng)肺癌肺轉(zhuǎn)移模型小鼠的生存期。

表1 各組小鼠生存時(shí)間的比較（）

表1 各組小鼠生存時(shí)間的比較（）

注：a:與生理鹽水組比較，P＜0.05；b:與低濃度欣力康組比較，P＜0.05

組別 n 中位生存時(shí)間（d）生理鹽水組 10 17±3.83低濃度欣力康組 10 17.5±2.09高濃度欣力康組 10 21±4.18a、b

圖2 欣力康延長(zhǎng)肺癌肺轉(zhuǎn)移模型小鼠的生存期

2.4 欣力康膠囊抑制腫瘤相關(guān)STAT3和NFκB信號(hào)通路激活 體外Luciferase活性測(cè)定結(jié)果顯示，欣力康膠囊能夠呈濃度依賴性的抑制腫瘤相關(guān)STAT3和NFκB通路激活，且具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)（圖3)。表明欣力康膠囊改善小鼠生存狀態(tài)，延長(zhǎng)模型小鼠生存期的作用機(jī)制與欣力康抑制STAT3和NFκB信號(hào)通路有關(guān)。

3 討論

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，近年來發(fā)病率和病死率呈上升趨勢(shì)，已居于各種惡性腫瘤的首位。肺癌起病隱匿，早期常被漏診，臨床上很多肺癌患者就診時(shí)已屬中晚期，失去了早期手術(shù)切除的最佳機(jī)會(huì)。中晚期肺癌多以放化療為主，部分患者也會(huì)使用靶向藥物治療。而放化療在殺滅惡性腫瘤細(xì)胞的同時(shí)會(huì)有各種毒性反應(yīng)，靶向藥物價(jià)格昂貴，且瘤細(xì)胞易對(duì)其產(chǎn)生耐藥性[12]。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展，人們逐漸認(rèn)識(shí)到惡性腫瘤治療的目的不僅僅是消除腫瘤細(xì)胞、縮小腫瘤、更重要的是提高患者的生存質(zhì)量，延長(zhǎng)生存期[13-14]。中醫(yī)藥在改善臨床癥狀，提高患者生存質(zhì)量方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，應(yīng)用中醫(yī)藥治療中晚期肺癌已經(jīng)得到了廣泛認(rèn)同。

圖3 欣力康抑制STAT3和NFκB信號(hào)通路激活

肺癌于中醫(yī)的病機(jī)有虛實(shí)而分，全身多“虛”，局部屬“實(shí)”，屬本虛標(biāo)實(shí)之病，即正氣不足為肺癌發(fā)生發(fā)展的根本原因，邪毒則是其致病重要的條件[15]。因此，扶正祛邪為中晚期肺癌的基本治療原則。研究顯示，扶正祛邪類中藥如扶正消癌方[16]、參芪扶正注射液[17]、抗癌扶正協(xié)定方[18]等，在小鼠肺癌模型中均顯示出較好的效果。欣力康膠囊是由半枝蓮、黃芪、當(dāng)歸、龍葵、郁金、紅參、蛇莓、雪蓮花、輪環(huán)藤根和丹參十味中藥組成的苗族經(jīng)驗(yàn)方，從組方上分析，以扶正成分為主，其中黃芪、當(dāng)歸、郁金、紅參、雪蓮花、丹參均為扶正類藥材，具有補(bǔ)氣養(yǎng)血的功效。同時(shí)又兼具祛邪成分，像半枝蓮，龍葵是經(jīng)典的抗癌藥，兩者和蛇莓，輪環(huán)藤根均具有化瘀解毒的功效。因此，欣力康作為扶正祛邪類中藥，針對(duì)中晚期肺癌的病因病機(jī)屬于對(duì)癥治療。

為了研究欣力康膠囊對(duì)肺癌在體內(nèi)的藥效，我們構(gòu)建了肺癌肺轉(zhuǎn)移模型小鼠，觀察了欣力康膠囊對(duì)肺癌模型小鼠的影響。研究結(jié)果表明，適當(dāng)濃度的欣力康膠囊能夠明顯改善模型小鼠的精神狀態(tài)，提高其活動(dòng)性，增加攝食和飲水量，明顯改善小鼠的生存狀態(tài)。同時(shí)可延長(zhǎng)肺轉(zhuǎn)移模型小鼠的生存期。提示我們?cè)谂R床上對(duì)于一些年邁體弱，或由于種種原因不適合手術(shù)治療而放化療效果不佳的中晚期癌癥患者，可選用欣力康輔助治療，延長(zhǎng)生存期，減輕臨床癥狀，以改善生活質(zhì)量。

為了更進(jìn)一步研究欣力康膠囊的作用機(jī)制，我們體外分別構(gòu)建了轉(zhuǎn)染了STAT3-luciferase報(bào)告基因質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染了NFκB-luciferase報(bào)告基因質(zhì)粒的腫瘤細(xì)胞。Luciferase活性測(cè)定結(jié)果顯示，欣力康膠囊能夠呈濃度依賴性的抑制STAT3和NFκB通路激活，且在低濃度時(shí)仍有抑制作用。STAT3與NFκB信號(hào)通路是經(jīng)典的與腫瘤相關(guān)的信號(hào)通路，因此我們推測(cè)，欣力康膠囊改善小鼠生存狀態(tài)，延長(zhǎng)模型小鼠生存期的潛在作用機(jī)制與欣力康抑制STAT3和NFκB信號(hào)通路激活有關(guān)。

本研究通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，揭示了欣力康膠囊對(duì)肺癌的體內(nèi)藥效。進(jìn)一步通過構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了相關(guān)作用機(jī)制的初步分析，為欣力康在臨床上用于治療中晚期肺癌患者提供了重要依據(jù)。但是，欣力康是否通過其他途徑影響肺癌肺轉(zhuǎn)移模型小鼠腫瘤轉(zhuǎn)移，增強(qiáng)免疫力，抑制腫瘤生長(zhǎng)，亦或其他作用，目前尚不完全清楚。我們將進(jìn)行更深入的研究，為欣力康的臨床用藥提供更多依據(jù)。