鮑曼不動(dòng)桿菌莢膜厚度對(duì)鼠巨噬細(xì)胞炎癥復(fù)合體活化的影響

吳亮，陸娟，2，王廷廷，萬(wàn)晟霞，鄒治情，戴曉玥，夏雯，陰晴，陳盛霞，許化溪

（1.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江212013；2.江南大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇 無(wú)錫214062；3.江蘇大學(xué)第四附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，江蘇 鎮(zhèn)江212001；4.江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇 鎮(zhèn)江212001）

鮑曼不動(dòng)桿菌（Acinetobacter baumannii，A.baumannii）是重要的機(jī)會(huì)致病菌，廣泛定植于人類皮膚、胃腸道、上呼吸道中，可引起各種醫(yī)院內(nèi)獲得性感染，如肺炎、尿路感染、菌血癥和腦膜炎等。近年來(lái)鮑曼不動(dòng)桿菌臨床分離率逐年升高，已成為主要的醫(yī)院內(nèi)感染病原體［1］。鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)氨基糖苷類、喹諾酮類和β-內(nèi)酰胺類抗生素的大范圍耐藥，特別是對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥，給臨床治療提出了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)［2］。

鮑曼不動(dòng)桿菌侵襲宿主細(xì)胞過(guò)程中可以導(dǎo)致細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷，但其確切機(jī)制仍不清楚。目前的研究多集中于其較強(qiáng)耐藥性和頑強(qiáng)生存能力，卻較少涉及致病機(jī)制及毒力因子［3］。鮑曼不動(dòng)桿菌有多種毒力因子，包括外膜蛋白、內(nèi)毒素、磷脂酶和莢膜等。莢膜是細(xì)菌經(jīng)典毒力因子，在細(xì)菌致病過(guò)程中發(fā)揮重要作用［4］。研究表明，細(xì)菌莢膜成分可以激活人體固有免疫細(xì)胞內(nèi)重要的多蛋白復(fù)合物——炎癥復(fù)合體，使細(xì)胞感知病原微生物的侵入并啟動(dòng)免疫防御功能，殺傷、清除病原微生物或產(chǎn)生免疫損傷反應(yīng)。但目前尚缺乏鮑曼不動(dòng)桿菌激活炎癥復(fù)合體的研究［5］。本研究通過(guò)比較兩株莢膜厚度顯著不同的鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)鼠巨噬細(xì)胞炎癥復(fù)合體激活能力的差異，探討鮑曼不動(dòng)桿菌莢膜在細(xì)菌激活固有免疫細(xì)胞及其致病中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

鮑曼不動(dòng)桿菌分離于江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院的患者痰液中，純化后凍存于15%脫脂牛奶中備用；鼠巨噬細(xì)胞（Raw 264.7）購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù)；哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；羊血購(gòu)自貝瑞特生物公司；剛果紅染料購(gòu)自上海生工生物有限公司；結(jié)晶紫染液購(gòu)自北京索萊寶生物公司；RPMI 1640培養(yǎng)基為HyClone（北京）有限公司產(chǎn)品；胎牛血清和胰蛋白酶（1∶250）為美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品；細(xì)胞總RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒（SYBR Green染料法）均購(gòu)自南京Vazyme公司；活性氧檢測(cè)試劑盒（DCFHDA熒光探針?lè)ǎ┵?gòu)自碧云天公司。

PCR引物由蘇州泓迅生物公司合成，各引物序列如下，NLRP3上游：5′-AACAGCCACCTCACTTCCAG-3′，下游：5′-CCAACCACAATCTCCGAATG-3′；Caspase-1上游：5′-GCACAAGACCTCTGACAGCA-3′，下游：5′-TTGGGCAGTTCTTGGTATTC-3′；IL-1β 上游：5′-CCTGTCCTGCGTGTTGAAAGA-3′，下游：5′-GGGAACTGGGCAGACTCAAA-3′；GAPDH 上游：5′-TCAACGGCACAGTCAAGG-3′，下游：5′-ACTCCACGACATACTCAGC-3′。

1.2 細(xì)菌莢膜的剛果紅法染色

細(xì)菌莢膜的染色根據(jù)王懷兵等［6］報(bào)道的剛果紅染色方法并加以改進(jìn)。將4%的剛果紅染液與胎牛血清按4∶1混勻，取1滴滴加于玻片上，挑取適量對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的鮑曼不動(dòng)桿菌落與此充分混合，按推制血片的方法制成推片，自然干燥后用5% HCl室溫下脫色1 min，細(xì)流水沖洗，再加結(jié)晶紫染液染色1 min，細(xì)流水沖洗，自然干燥后鏡檢。挑取兩株莢膜厚度差異顯著的細(xì)菌用于后續(xù)研究。

1.3 Raw 264.7細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)菌感染

按常規(guī)方法培養(yǎng)Raw 264.7細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%時(shí)，用0.25%胰酶溶液消化細(xì)胞，洗滌后計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)5×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于37℃、5%CO2環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。取鮑曼不動(dòng)桿菌的新鮮振搖培養(yǎng)物，以無(wú)菌PBS緩沖液洗滌并調(diào)整細(xì)菌密度為1×109／mL［D（600 nm）＝1］。在生長(zhǎng)融合至70%的Raw 264.7細(xì)胞（此時(shí)各孔細(xì)胞數(shù)量為1×106個(gè)）中分別加入兩株不同莢膜厚度的鮑曼不動(dòng)桿菌（細(xì)菌數(shù)量∶細(xì)胞數(shù)量＝10∶1），置于37℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)，于感染后1 h、3 h和6 h收集細(xì)胞樣本。

1.4 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)細(xì)胞NOD樣受體家族3（NLRP3）、Caspase-1和IL-1βmRNA的表達(dá)

嚴(yán)格按照Vazyme公司總RNA提取試劑盒說(shuō)明書提取細(xì)胞總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)條件是95℃預(yù)變性1 min，95℃變性15 s，60℃退火1 min，72℃延伸45 s，共35個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，NLRP3、Caspase-1和IL-1β的基因表達(dá)量結(jié)果用2-△△Ct法表示，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞活性氧

以無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA熒光探針至終濃度為10μmol／L的工作液，并將上述收集的細(xì)胞重懸于DCFH-DA工作液中，于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min，間隔5 min顛倒混勻使探針和細(xì)胞充分接觸。孵育結(jié)束后使用無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)液反復(fù)洗滌細(xì)胞3次以完全除去未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA熒光探針，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞熒光強(qiáng)度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，采用t檢驗(yàn)分析感染組和對(duì)照組細(xì)胞基因和活性氧表達(dá)差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌莢膜染色結(jié)果

經(jīng)剛果紅染色后，鮑曼不動(dòng)桿菌莢膜不著色，菌體被染成紫黑色，背景染成橘紅色。經(jīng)多次染色鑒定，我們選擇出兩株莢膜厚度不同的鮑曼不動(dòng)桿菌用于后續(xù)研究，分別命名為Ab-B（薄莢膜菌株）和Ab-H（厚莢膜菌株）。從圖1可見，Ab-H菌株周圍有一個(gè)明顯白圈，不被染料著色；而Ab-B菌株周圍無(wú)明顯白圈。

圖1 鮑曼不動(dòng)桿菌剛果紅染色結(jié)果

2.2 鮑曼不動(dòng)桿菌感染后Raw 264.7細(xì)胞NLRP3、Caspase-1和IL-1β的mRNA表達(dá)

實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，Ab-B菌感染后，Raw 264.7細(xì)胞NLRP3 mRNA表達(dá)量較對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），Caspase-1和IL-1β表達(dá)量較對(duì)照組顯著升高（P＜0.05）；Ab-H菌感染后Raw 264.7細(xì)胞NLRP3、Caspase-1和IL-1βmRNA表達(dá)量較對(duì)照組均明顯上調(diào)（P＜0.05），且NLRP3和IL-1β表達(dá)量顯著高于Ab-B菌感染組（P＜0.05），但兩組Caspase-1表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2。

圖2 鮑曼不動(dòng)桿菌感染后Raw 264.7細(xì)胞NLRP3、Caspase-1和IL-1βmRNA表達(dá)量

2.3 鮑曼不動(dòng)桿菌感染后Raw 264.7細(xì)胞活性氧表達(dá)

兩株鮑曼不動(dòng)桿菌感染Raw 264.7細(xì)胞后，1 h時(shí)感染組細(xì)胞活性氧表達(dá)量與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；3 h時(shí)感染組細(xì)胞活性氧表達(dá)量較對(duì)照組顯著上升（P＜0.05），Ab-H株感染細(xì)胞活性氧表達(dá)量顯著高于Ab-B株感染細(xì)胞（P＜0.05）；6 h時(shí)感染組細(xì)胞活性氧表達(dá)量進(jìn)一步上升，Ab-H株感染細(xì)胞活性氧表達(dá)量顯著高于Ab-B株感染細(xì)胞（P＜0.05）。見圖3。

3 討論

鮑曼不動(dòng)桿菌是引起醫(yī)院內(nèi)感染的重要條件致病菌，隨著近年來(lái)鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥性愈加嚴(yán)重，可供臨床醫(yī)生選擇的抗生素種類有限。但臨床中并非所有的多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌都會(huì)引起患者感染癥狀［7］。鮑曼不動(dòng)桿菌易于在人體上呼吸道、泌尿生殖道和消化道等部位黏膜表面定植存在，其耐藥性強(qiáng)，但不會(huì)激活免疫反應(yīng)引起患者感染癥狀。因此患者呼吸道等部位檢出鮑曼不動(dòng)桿菌時(shí)，還需要鑒別其定植性或致病性，以便于臨床醫(yī)生選擇合適治療方案，避免抗生素的過(guò)度治療。但目前對(duì)于鮑曼不動(dòng)桿菌定植和致病的確切機(jī)制尚不完全清楚，嚴(yán)重阻礙了鮑曼不動(dòng)桿菌的防治［8］。開展鮑曼不動(dòng)桿菌激活宿主免疫系統(tǒng)機(jī)制的研究，可為鮑曼不動(dòng)桿菌的治療提供一條新思路［9］。

圖3 各組細(xì)胞活性氧表達(dá)量

目前鮑曼不動(dòng)桿菌毒力因子研究較少，現(xiàn)已明確的毒力因子有莢膜、外膜蛋白、脂多糖和外膜囊泡等［10］。莢膜是細(xì)菌經(jīng)典的毒力因子，在細(xì)菌致病過(guò)程中發(fā)揮重要作用。莢膜可以保護(hù)細(xì)菌，使細(xì)菌能夠在宿主吞噬細(xì)胞或腹腔積液中長(zhǎng)時(shí)間存活，避免被宿主免疫細(xì)胞吞噬清除，并對(duì)宿主造成嚴(yán)重?fù)p害［11］。臨床檢驗(yàn)人員通常會(huì)將痰液涂片中存在于白細(xì)胞或膿細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌判為致病菌，此類細(xì)菌通常具有較厚的莢膜，以利于細(xì)菌在白細(xì)胞中長(zhǎng)時(shí)間存活［12］。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，莢膜是細(xì)菌重要的病原體相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs），可以被宿主天然免疫系統(tǒng)識(shí)別并激活免疫反應(yīng)［13］。人體依靠一整套復(fù)雜的天然免疫機(jī)制和獲得性免疫機(jī)制識(shí)別和清除侵入的病原菌，保護(hù)機(jī)體免受病原菌的侵害。宿主細(xì)胞通過(guò)模式識(shí)別受體（patten recognition receptors，PRRs）來(lái)識(shí)別鮑曼不動(dòng)桿菌莢膜（即PAMPs）［14］。人類有多種不同功能的PRRs，其中存在于細(xì)胞質(zhì)中的NOD樣受體（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors，NLRs）是目前研究的熱點(diǎn)［15］。NLRs的N-端是在蛋白之間有相互作用的效應(yīng)結(jié)構(gòu)域，C-端是識(shí)別PAMPs的亮氨酸富集結(jié)構(gòu)域，中間部分為NOD結(jié)構(gòu)域。在人體中，由NLRs、凋亡相關(guān)點(diǎn)樣蛋白（ASC）和Caspase-1相互作用形成“炎癥復(fù)合體”，用于識(shí)別胞內(nèi)病原微生物及其代謝產(chǎn)物，通過(guò)激活Caspase-1，使IL-1β、IL-18和IL-33等促炎細(xì)胞因子成熟并釋放到胞外，從而調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答并引起炎癥反應(yīng)［16］。現(xiàn)已報(bào)道的炎癥復(fù)合體包括NLRP1、NLRP3、IPAF（the IL-1β-converting enzyme-protease activating factor）和AIM-2（absent in melanoma 2）4種，NLRP3是目前研究最多且最明確的一個(gè)，能夠被多種病原體所激活，包括金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌和流感病毒等，但目前缺乏鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)宿主NLRP3激活的研究［17］。

現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)鮑曼不動(dòng)桿菌誘發(fā)肺部感染的關(guān)鍵在于NLRP3炎癥復(fù)合體的活化，但其活化具體機(jī)制仍不完全清楚［18］。莢膜是鮑曼不動(dòng)桿菌重要毒力因子，通常情況下鮑曼不動(dòng)桿菌的莢膜不明顯，傳統(tǒng)墨汁負(fù)染法檢測(cè)效果較差。本研究中我們采用改良的剛果紅染色法檢測(cè)鮑曼不動(dòng)桿菌莢膜，該方法操作簡(jiǎn)單，可以清晰地觀察到鮑曼不動(dòng)桿菌莢膜的厚薄程度，涂片可以長(zhǎng)期保存，便于隨時(shí)復(fù)核。

我們的結(jié)果表明，鮑曼不動(dòng)桿菌感染Raw 264.7細(xì)胞后，可以激活細(xì)胞活性氧表達(dá)，以及NLRP3、Caspase-1和IL-1βmRNA表達(dá)量，進(jìn)而激活細(xì)胞炎癥復(fù)合體的形成。厚莢膜菌株激活Raw 264.7細(xì)胞活性氧表達(dá)能力顯著強(qiáng)于薄莢膜菌株，并且其活化Raw 264.7細(xì)胞NLRP3和IL-1β表達(dá)能力也明顯強(qiáng)于薄莢膜菌株。該結(jié)果與肺炎克雷伯菌莢膜活化炎癥小體能力相同［19］，表明鮑曼不動(dòng)桿菌莢膜是潛在活化炎癥復(fù)合體的重要因子，可以通過(guò)上調(diào)細(xì)胞活性氧表達(dá)進(jìn)而激活炎癥小體，導(dǎo)致患者免疫系統(tǒng)識(shí)別并清除鮑曼不動(dòng)桿菌?；钚匝跏悄壳肮J(rèn)的炎癥復(fù)合體激活因子［20］，主要來(lái)源于細(xì)胞線粒體。大量細(xì)菌莢膜可以激活宿主免疫細(xì)胞的吞噬反應(yīng)，進(jìn)而引起細(xì)胞“呼吸爆發(fā)”，產(chǎn)生超量活性氧，使NLRP3活化，導(dǎo)致人體正常組織和器官的損傷［21］。由此推測(cè)，莢膜厚度是影響鮑曼不動(dòng)桿菌活化巨噬細(xì)胞炎癥復(fù)合物能力的重要因素，具有厚莢膜的鮑曼不動(dòng)桿菌可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)量活性氧，活化炎癥復(fù)合體，使宿主固有免疫系統(tǒng)識(shí)別并清除鮑曼不動(dòng)桿菌或進(jìn)一步引起正常組織和器官損傷。