菌草綠洲一號內(nèi)生菌的分離鑒定及其生物學特性研究

葉文雨 謝序澤 連加淳

摘 要 菌草（JUNCAO）是用于栽培食用菌、藥用菌的草本植物。以菌草綠洲一號為研究材料，通過植物組織表面消毒、研磨組織、培養(yǎng)基培養(yǎng)等方法分離純化內(nèi)生菌，并進一步通過分子手段鑒定菌株，通過平板對峙法等方法對其生物學特性進行研究。16S rDNA序列同源性分析結(jié)果表明，該菌株為Enterobacter ludwigii；平板對峙等生物學特性試驗結(jié)果表明，該菌株對馬鈴薯早疫病菌具有拮抗作用。該菌株具有溶磷性、接觸酶反應(yīng)呈陽性、能使明膠液化、水解淀粉等生物學特性。根據(jù)菌株的拮抗特性和其他生物學特性結(jié)果可以推測，該菌株可作為生防菌防治植物病原菌及作為促生菌促進植物的生長，提高產(chǎn)量。

關(guān)鍵詞 綠洲一號內(nèi)生菌 ；分子鑒定 ；生物學特性

中圖分類號 S54 文獻標識碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2019.01.011

Abstract JUNCAO are herbaceous plants that can be used as the substrate for edible and medicinal fungi cultivation. In this study， the stem of LVZHOU No. 1 was used as the research material， and the DLJ2 strain were isolated and purified by the surface disinfection of the plant tissue and the culture of the culture medium， and the DLJ2 strain was identified as Enterobacter ludwigii by 16S rDNA sequence. The biological characteristics of the DLJ2 strain were studied. The strain DLJ2 has antifungi activity against Alternaria solani. It was found that the strain fjg112 has phosphorus solubilization， catalase-positive and gelatin liquefaction positive and hydrolyze starch positive. This study provided a new insighe into the development of endophytes resources from JUNCAO.

Keywords endophytic bacteria ； molecular identification ； biological characteristics

內(nèi)生菌（Endophyte）是指那些在其生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物的組織或器官內(nèi)部的微生物，包括植物內(nèi)生真菌、內(nèi)生細菌和內(nèi)生放線菌[1-4]。發(fā)掘植物內(nèi)生菌資源多樣性已成為研究植物與微生物的主攻方向之一。內(nèi)生菌可以提高植物產(chǎn)量、提高植物的抗逆性、降低化肥使用量、減少水土污染、保持農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展、改善生態(tài)環(huán)境。內(nèi)生菌具有可促進植物生長、抑制植物病害等作用[5-10]。Sessitsch等[11]和黎起秦等[12]從馬鈴薯組織中獲得的內(nèi)生菌對馬鈴薯環(huán)腐病有抑制作用。楊海蓮等[13]從水稻根中分離得到一株陰溝腸桿菌，用該菌發(fā)酵液對種子進行浸泡處理或噴霧處理后，該菌對水稻白葉枯病生防效果顯著。Kajula等[14]的研究表明，茶葉內(nèi)生菌可產(chǎn)生鐵菌素類物質(zhì)，對茶樹的營養(yǎng)生長具有促進作用。

柑橘根部中的內(nèi)生細菌類芽孢桿菌（Paenibacillus validus）對葉片中黃龍病病菌的生長有明顯的抑制作用[15]。菌草（JUNCAO）是可作為栽培食用菌、藥用菌的草本植物。菌草營養(yǎng)豐富、植株高大、單位面積產(chǎn)量高、適應(yīng)性強、資源豐富、易于人工栽培、資源可持續(xù)利用等，隸屬被子植物門、單子葉植物綱、禾本科、蘆竹屬，是栽培香菇、木耳、靈芝等多種食（藥）用菌的優(yōu)質(zhì)培養(yǎng)基，還是優(yōu)良的護堤植物，并可用于制造紙等，是荒漠化地區(qū)恢復(fù)植被的優(yōu)良草種[16]。 綠洲一號是其中重要菌草之一。植物內(nèi)生菌已經(jīng)成為當前微生物學研究的熱點之一，是有待深入開發(fā)的資源寶庫[17-18]。挖掘菌草本身的內(nèi)生菌潛能是解決農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的有效途徑。為了探明菌草綠洲一號體內(nèi)是否存在具有拮抗和促生作用的內(nèi)生菌，本研究以福建菌草綠洲一號為試驗材料，通過植物組織表面消毒和培養(yǎng)基培養(yǎng)法分離篩選和鑒定其體內(nèi)的內(nèi)生菌資源并研究其生物學特性，為開發(fā)菌草內(nèi)生菌資源和篩選新型抑菌活性化合物奠定了良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料及培養(yǎng)基

綠洲一號菌草樣本采自福建農(nóng)林大學城菌草種植基地，選取無病蟲害侵染且生長旺盛的綠洲一號菌草植株。

禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）保存于本實驗室、馬鈴薯早疫病菌（Alternaria solani）由詹家綏博士贈與。

內(nèi)生細菌分離采用NA培養(yǎng)基：胰蛋白胨5 g/L，葡萄糖2.5 g/L，牛肉膏3 g/L，瓊脂15 g/L pH 7.20。病原真菌培養(yǎng)用 PDA 培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂40.1 g/L。加碘反應(yīng)和觸酶反應(yīng)用LB 固體培養(yǎng)基：LB 液體培養(yǎng)基加瓊脂15 g/L 。

內(nèi)生細菌的運動作用用LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g/L，酵母提取物5.0 g/L，氯化鈉10.0 g/L 。

無機磷溶解PKO培養(yǎng)基：FeSO4 0.003 g/L，葡萄糖10 g/L，Ca3（PO4）2 5.0 g/L，（NH4）2SO4 0.5 g/L，MnSO4 0.03 g/L，MgSO4·7H2O 0.03 g/L，NaCl 0.2 g/L，KCl 0.2 g/L，瓊脂20 g/L，pH 6.8～7.0。其中，Ca3（PO4）2過篩并單獨滅菌后與培養(yǎng)基混合。

淀粉水解用培養(yǎng)基：可溶性淀粉2 g/L，NaCl g/L，蛋白胨10 g/L，牛肉膏5 g/L，瓊脂18 g/L，配好后調(diào)pH至7.0。

明膠液化培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基1 000 mL/L，明膠12 g/L，把它們在水浴鍋中熔化混勻，調(diào)pH至7.2～7.4，于121℃高壓滅菌30 min。

病原菌拮抗試驗用PDA 固體培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂40.1 g/L。

1.1.2 試劑和儀器

蛋白胨，葡萄糖，牛肉膏，瓊脂，葡萄糖，（NH4）2SO4，NaCl，KCl，MgSO4·H2O，MnSO4，F(xiàn)eSO4·7H2O，酵母粉，Ca3（PO4）2，馬鈴薯葡萄糖瓊脂，明膠，可溶性淀粉等常規(guī)藥品均為國產(chǎn)分析純。2×Taq PCR Master Mix，TPS溶液，液氮，次氯酸，酚氯仿，乙醇，無菌水。恒溫搖床，高壓滅菌鍋，超凈工作臺，分析天平，恒溫培養(yǎng)箱，PCR儀，冰箱。

1.2 方法

1.2.1 綠洲一號菌草內(nèi)生菌的分離純化

取采集回來的綠洲一號，剪取健康的部位對其進行表面消毒，先用自來水沖洗干凈，晾干水分后，轉(zhuǎn)入超凈工作臺中用70%酒精漂洗5 min，再用2%的次氯酸鈉漂洗3 min，最后用無菌水沖洗5～7次，將最后一次洗滌的無菌水涂板到NA培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)3 d，若對照培養(yǎng)基中無菌落出現(xiàn)表明消毒完全。若消毒不完全，則須重新進行消毒。在無菌條件下，分別切取植株的莖，剪成0.5 cm的小段或小塊，將組織塊分別放入無菌研缽中，充分研磨成勻漿；取50～100 μL組織研磨汁液接種到NA培養(yǎng)基上進行涂板，每處理重復(fù)3次， 置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d，觀察培養(yǎng)出的菌落形態(tài)，然后根據(jù)菌落特征的不同，挑取平板中不同形態(tài)、顏色的單菌落，進行平板劃線分離、純化，保存?zhèn)溆肹19-21]。

1.2.2 內(nèi)生菌的分子鑒定及同源性比對

DNA的提取根據(jù)細菌基因組DNA[22]試劑盒（天根生化科技有限公司）說明進行提取。采用細菌的通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'）和1492R（5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'）進行16S rDNA擴增。PCR反應(yīng)體系總體積為25 μL，其中Taq Mix DNA聚合酶12.5 μL，上游引物1 μL， 下游引物1 μL，模板DNA 1 μL，去離子水9.5 μL。PCR反應(yīng)程序為94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，56℃退火90 s，72℃延伸2 min，30個循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物送博尚生物公司進行測序。將測定的序列與Genbank 中已知序列進行Blast同源性比對分析，可初步鑒定其為Enterobacter ludwigii。登陸NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）利用BLAST將測序結(jié)果與GenBank中的已知序列進行比對，查找相似性最高的菌株，并根據(jù)16S rDNA序列相似性進行分子鑒定，用MEGA 5.2軟件構(gòu)建出系統(tǒng)發(fā)育樹[23-24]。

1.2.3 淀粉水解反應(yīng)

在淀粉培養(yǎng)基基上接種內(nèi)生菌，一皿不接種做空白對照，置28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2～3 d后，在平板上滴加碘液，觀察其菌落處，若菌落處呈透亮的菌落色澤則記為淀粉試驗陽性（+），若菌落處呈藍黑色記為淀粉試驗陰性（-）[25]。

1.2.4 觸酶反應(yīng)

用滅菌槍頭挑取少許內(nèi)生菌于干凈的載玻片上，用移液槍滴10 μL過氧化氫溶液于菌落上，觀察反應(yīng)，并拍照記錄[25]。

1.2.5 溶磷作用

在溶磷培養(yǎng)基上接種內(nèi)生菌，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d，11 d后測量內(nèi)生菌菌落直徑（d）和溶磷透明圈直徑（D），并計算D/d數(shù)值，有透明圈的菌株即代表具有溶磷能力[26]。

1.2.6 拮抗作用

采用平板對峙法，在PDA平板中央接種內(nèi)生菌，在距內(nèi)生菌左右2.0 cm處 接種供試病原真菌，以不接種內(nèi)生菌作為對照，每個處理3個重復(fù)，置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7 d[27]。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生菌的分離純化

利用組織表面消毒和培養(yǎng)基培養(yǎng)法對菌草綠洲一號莖（圖1）的內(nèi)生菌進行分離并純化，共得到內(nèi)生菌株4株，經(jīng)過鑒定，其中一株內(nèi)生菌DLJ2對病原菌抑菌效果明顯，因此選擇DLJ2做后續(xù)試驗。

2.2 菌株的分子鑒定及同源性比對

以分離自綠洲一號的菌株DLJ2的基因組DNA為模板，用 16S rDNA基因通用引物27F和1492R進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物用1.0% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測。將擴增產(chǎn)物送博尚生物科技有限公司測序。將所獲得序列用BLAST軟件與GenBank中已報道的菌株16S rDNA序列進行比對，用Mega 5.2軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹（Bootstrap=1 000），結(jié)果顯示，內(nèi)生菌DLJ2與Enterobacter ludwigii親緣關(guān)系最近，確定其為腸桿菌屬內(nèi)生菌（Enterobacter ludwigii）（圖2），命名為Enterobacter ludwigii DLJ2。

2.3 淀粉水解

某些細菌可以產(chǎn)生分解淀粉的酶，把淀粉水解為麥芽糖或葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不再變藍色。結(jié)果表明，DLJ2菌株可以產(chǎn)生分解淀粉的酶，把淀粉水解為麥芽糖或葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不再變藍色（圖3）。

2.4 觸酶試驗

觸酶又稱過氧化氫酶，具有過氧化氫酶的細菌，能催化過氧化氫成為水和原子態(tài)氧，繼而形成氧分子，出現(xiàn)氣泡。試驗結(jié)果表明，菌株DLJ2有產(chǎn)生過氧化物酶，當加入過氧化物時，菌株中形成氧分子，由此而產(chǎn)生氣泡（圖4）。

2.5 溶磷作用

采用溶磷圈法對細菌的溶磷特性進行測定。用槍頭將供試菌株分別點接種于溶磷培養(yǎng)基上，置于 30℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d，觀察到有透明溶磷圈產(chǎn)生（圖5），其所產(chǎn)生的解磷圈外徑與菌落生長的直徑比值（D/d）為1.353，具有一定的溶磷作用。

2.6 抑菌作用

以馬鈴薯早疫病菌和小麥赤霉病菌2種植物病原真菌作為指示菌，對分離到的DLJ2內(nèi)生菌進行抑菌活性篩選，用平板對峙的方法測定菌株DLJ2的拮抗效果，試驗結(jié)果見圖2。DLJ2對馬鈴薯早疫病菌具有較強的抑制活性，顯示出明顯的抑菌帶（圖5） 。

2.7 明膠液化試驗

某些細菌可產(chǎn)生一種胞外酶-明膠酶，能使明膠分解為氨基酸，從而失去凝固力，半固體的明膠培養(yǎng)基成為流動的液體。試驗結(jié)果表明，菌株DLJ2具有膠原酶，使明膠分解，失去凝固能力，呈現(xiàn)液體狀態(tài)，可用于腸桿菌科的鑒別（圖6）。

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

本研究從菌草綠洲一號健康植株的莖中分離篩選獲得一株對馬鈴薯早疫病菌有顯著拮抗作用，且具溶磷作用、接觸酶反應(yīng)呈陽性、能使明膠液化、水解淀粉等生物學特性的內(nèi)生細菌菌株。基于該菌株的形態(tài)、生理生化及分子生物學特征，將其鑒定為路德維希腸桿菌（Enterobacter ludwigii），命名為Enterobacter ludwigii DLJ2。DLJ2 菌株對2種常見植物病原菌具有不同程度的抑制作用。 王舒等[28]于2016年從油茶根際分離出了路德維希腸桿菌（Enterobacter ludwigii），該菌株具有溶磷作用?，F(xiàn)有的研究表明，路德維希腸桿菌可產(chǎn)生產(chǎn)1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（ACC）、IAA、抑菌活性物質(zhì)，并有促進宿主植物生長等功能[29]。本研究結(jié)果表明，路德維希腸桿菌作為內(nèi)生菌存在于健康菌草綠洲一號組織中，理論上不僅可以促進植物的生長，且可產(chǎn)生對馬鈴薯早疫病菌有抑菌作用的物質(zhì)，增強對馬鈴薯早疫病害的抵抗能力。馬鈴薯早疫病是馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)重要病害之一，普遍大面積連片發(fā)生，病株率達到80%以上，很多田塊達到100%，造成嚴重損失。馬鈴薯早疫病已經(jīng)成為威脅馬鈴薯生產(chǎn)的重大障礙。本研究結(jié)果初步表明，從菌草綠洲一號中分離的內(nèi)生拮抗和促生細菌路德維希腸桿菌（Enterobacter ludwigii） 菌株具有進一步開發(fā)為作物病菌生防菌的潛力。后續(xù)研究將分離純化 Enterobacter ludwigii DLJ2菌株的主要抑菌活性成分，深入研究其對馬鈴薯早疫病和其他病原真菌的拮抗作用機制以及對植物的促生作用機制等。此外，該菌株的使用是否存在生物殘留，是否會影響馬鈴薯的食用品質(zhì)等問題也尚待進一步研究。溶磷菌具提高土壤磷素的利用效率和促進作物苗期生長的作用，菌株DLJ2作為拮抗菌株和溶磷菌株，有待通過大田試驗以確定DLJ2菌株的大田應(yīng)用效果，田間防效試驗也需要進一步的研究。由于田間試驗常受天氣等因素影響，故后續(xù)將連續(xù)幾年進行田間重復(fù)試驗，探究Enterobacter ludwigii DLJ2菌株對馬鈴薯早疫病的田間防效及促進植物生長的作用，以期為該菌株在生產(chǎn)中應(yīng)用于防治馬鈴薯早疫病和促進植物生長提供更為可靠的技術(shù)支持。另外，該菌株是否還對其他病原菌具有拮抗作用和對哪種植物具有明顯的促生作用，以及在大田條件下的抗病原菌及促進植物生長情況等等均有待進一步探究。

3.2 結(jié)論

本研究從福建農(nóng)林大學菌草基地選取生長良好的菌草綠洲一號，從其莖中分離得到一株具有拮抗和溶磷作用的菌株DLJ2，該菌株還具有接觸酶反應(yīng)呈陽性、能使明膠液化、水解淀粉等生物學特性，從生理生化特性和16S rDNA擴增鑒定其為腸桿菌屬（Enterobacter ludwigii），該菌具有作為生防菌及促生菌應(yīng)用于植物病原菌防治、促進植物生長及植被恢復(fù)等方面潛力。

參考文獻

[1] Stone J K， Bacon C E， White J F Jr. An overview of endophytic microbes： endophytism defined microbial endophytes[M]. New York： Marcel Dekker， 2000： 3-29.

[2] Ambrose C，Varghesec C，Subhash J B，et al. Endophytic bacteria as a source of novel antibiotics：An overview[J]. Pharma-cognosy Rev， 2013， 7（13）： 11-16.

[3] Singh R， Dubey A.Endophytie actinomyeetes as emerging source for therapeutic compounds[J].Indo Global Journal of Pharmaceutical Sciences，2015，5（2）：106-116.

[4] Pimentel M R，Molina G，Dionisio A P，et al. The use of endophytes to obtain bioacfive compounds and their ap-plication in biotransformation process[J].Bioteclmol Res Int，2011，2011（5）：576-286.

[5] Puri A， Padda K P， Chanway C P. Evidence of nitrogen fixation and growth promotion in canola （Brassica napus L.） by an endophytic diazotrophPaenibacillus polymyxaP2b-2R[J]. Biology and Fertility of Soils， 2016， 52（1）： 119-125.

[6] Yaish M W， Antony I， Glick B R. Isolation and charac-terization of endophytic plant growth-promoting bacteria from date palm tree （Phoenix dactylifera L.） and their potential role in salinity tolerance[J]. Antonie Van Leeu-wenhoek， 2015， 107（6）： 1 519-1 532.

[7] Mehta P， Walia A， Kulshrestha S， et al. Efficiency of plant growth- promoting P-solubilizing Bacillus circulans CB7 for enhancement of tomato growth under net house conditions[J]. Journal of Basic Microbiology， 2015， 55（1）： 33-44.

[8] Wei C Y，Lin L， Luo L J， et al. Endophytic nitrogen-fixing Klebsiella variicola strain DX120E promotes sugarcane growth[J]. Biology and Fertility of Soils， 2014， 50（4）： 657-666.

[9] Ji S H， Gururani M A， Chun S C. Isolation and character-ization of plant growth promoting endophytic diazotrophic bacteria from Korean rice cultivars[J]. Microbiological Research， 2014， 169（1）： 83-98.

[10] Tariq M ， Hameed S ， Yasmeen T ， et al. Molecular characterization and identification of plant growth promoting endophytic bacteria isolated from the root nodules of pea （Pisum sativum L.）[J]. World Journal of Microbiology & Biotechnology， 2014， 30（2）： 719.

[11] Sessitsch A，Puschenreiter M.Endophytes and rhizosphere bacteria of plants growing in heavy met-al-containing soils. 2008： 317-332.

[12] 黎起秦，羅 寬，林 緯，等.內(nèi)生菌b47的定殖能力及其對番茄青枯病的防治作用[J].植物保護學報，2006，33（4）：363-368.

[13] 楊海蓮，孫曉璐，宋 未，等.水稻內(nèi)生陰溝腸桿菌mrl2的鑒定及其固氮和防病作用研究[J].植物病理學報，2001，31（1）：92-93.

[14] Kajula M， Tejesvi M V， Kolehmainen S， et al. The siderophore ferricrocin produced by specific foliar endophytic fungi in vitro[J]. Fungal Biology， 2010， 114（2/3）： 248-254.

[15] Trivedi P，Spann T，Wang N. Isolation and charac-terization of beneficial bacteria associated with citrus roots in Florida[J].Microbial Ecology，2011，62（2）： 324-336.

[16] 林占熺. 菌草學[M]. 北京：國家行政學院出版社，2013.

[17] Hardoim P R， van Overbeek L S， Berg G， et al. The hid-den world within plants： ecological and evolutionary considerations for defining functioning of microbial endophytes[J]. Microbiology and Molecular Biology Re-views， 2015， 79（3）： 293-320.

[18] Qin S， Xing K， Jiang J H， et al. Biodiversity， bioactive natural products and biotechnological potential of plantassociated endophytic actinobacteria[J]. Applied Microbiology and Biotechnology， 2011， 89（3）： 457-473.

[19] 李樂溪，嵇靜靜，周亮吟，等. 大蒜產(chǎn)香內(nèi)生真菌的分離及揮發(fā)性成分分析[J]. 生物資源，2017，1（39）：70-73.

[20] 韋智鐘，劉夢雅，李 真，等. 大蒜內(nèi)生菌的分離及其抑菌作用的研究[J]. 黑龍江農(nóng)業(yè)科學，2013（12）：5-9.

[21] 何 紅，蔡學清，洪永聰，等. 辣椒內(nèi)生細菌的分離及拮抗菌的篩選[J]. 中國生物防治，2002，18（4）：171-178.

[22] 鄒家興，李國基，耿予歡. 腐乳發(fā)酵過程中細菌種群變化的鑒定與分析[J]. 現(xiàn)代食品科技，2008，24（5）：424-438.

[23] Julie D Thompson， Toby J Gibson， Frederic Plewniak， et al. The CLUSTAL X windows interface： flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools [J]. Nucleic Acids Research， 1997， 25（24）： 4 876-4 882.

[24] Li X X，Zhang M L，F(xiàn)u Y Y，et al. Analysis of rhizobia isolated from melilotus by 16S rDNA-RF LP[J]. Acta Bot Boreal（Occident Sin），2008，28（3）：1 569-1 573.

[25] 趙 斌，何紹江. 微生物學實驗[M]. 北京：科學技術(shù)出版社，2002.

[26] 張國壯，李海超，孫永林，等. 5株產(chǎn)ACC脫氨酶細菌的篩選與鑒定[J]. 西北農(nóng)林科技大學學報（自然科學版） ，2014，42（6）：189-196.

[27] 歐雄常，柳 鳳，何 紅，等. 紅樹內(nèi)生細菌AmS2對多種植物病原真菌的抑制作用[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學，2013，40（5）：73-75.

[28] 王 舒，張林平，張 揚，等. 紅壤區(qū)油茶根際解磷細菌的篩選、鑒定及其解磷能力[J]. 林業(yè)科學研究，2016，3：409-416.

[29] 黃 蓋，高 焓，王 琛，等. ACC脫氨酶活性菌株 ACC30的分離、鑒定及其促生作用[J]. 微生物學通報， 2013，40（5）：812-821.