液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在慕薩萊思葡萄酒非揮發(fā)性成分檢測(cè)中的應(yīng)用

王子坤，韓愛芝，張璐，奚倩，3，黃英，3，李雅雯，馬國才，賈清華，李磊，侯旭杰，3，*

（1.塔里木大學(xué)分析測(cè)試中心，新疆阿拉爾843300；2.塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾843300；3.南疆特色農(nóng)產(chǎn)品深加工兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆阿拉爾843300）

慕薩萊思始于東漢末年，是西域最古老的葡萄酒，被譽(yù)為古老葡萄酒釀制工藝的“活化石”。慕薩萊思是古代西域葡萄酒釀造技術(shù)的創(chuàng)新和發(fā)展，距今已經(jīng)有幾千年的歷史，它是新疆民族特色傳統(tǒng)葡萄酒，傳承著刀郎文化的精髓與靈魂。它用葡萄汁自然發(fā)酵而成，不添加任何防腐劑和香精佐料，這種傳統(tǒng)的工藝加入了新疆第一批非物質(zhì)文化遺產(chǎn)。慕薩萊思葡萄酒在釀造過程中需要將葡萄皮渣加清水熬煮后加入到葡萄汁中混合發(fā)酵。從慕薩萊思葡萄酒和現(xiàn)代化生產(chǎn)葡萄酒的制作工藝中不難看出兩者的差別，慕薩萊思葡萄酒特有的熬煮葡萄皮過濾后加入到葡萄汁里，使慕薩萊思葡萄酒具有其獨(dú)有的風(fēng)味。采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分析慕薩萊思葡萄酒，對(duì)其中的非揮發(fā)性成分進(jìn)行分析[1-7]。同時(shí)對(duì)比自釀葡萄酒、進(jìn)口葡萄酒、工廠生產(chǎn)慕薩萊思三者的區(qū)別，同時(shí)對(duì)比自釀葡萄酒不同釀造階段成分、以及含量區(qū)別。通過分析慕薩萊思葡萄酒中的成分，可以了解其中是否有有害成分，后期可進(jìn)一步指導(dǎo)生產(chǎn)[8-10]。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

1.1.1 材料

葡萄原汁、濃縮汁、慕薩萊思（自釀）均是自釀過程中采集樣品，釀酒葡萄原料是和田紅葡萄；非自釀成品酒有3 種分別是：葡萄酒（食品系釀）：塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院食品科學(xué)系自釀葡萄酒，原料是葡萄、玫瑰花、紅棗、枸杞；葡萄酒（進(jìn)口）：市購；慕薩萊思（阿瓦提）：新疆阿瓦提刀郎慕薩萊思有限公司購買。乙腈（色譜級(jí)）：德國默克Merck；甲酸（色譜級(jí)）：上海安普科技公司。

1.1.2 儀器

Agilent 6410B 三重四級(jí)桿液質(zhì)聯(lián)用儀配二極管陣列（DAD）檢測(cè)器：美國Agilent 公司；GL-20G-2 高速冷凍離心機(jī)：上海安亭公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理方法

取準(zhǔn)備好的樣品20 mL，4 000 r/min 離心10 min。取上清液過0.22 μm 濾膜，備用。

1.2.3 高效液相色譜條件

色譜柱：安捷倫ZORBAX-SB C18（100 mm×2.1 mm i.d.，3.5 μm）；流速：0.3 mL/min；檢測(cè)波長：280 nm；進(jìn)樣量：5 μL；柱溫箱：30 ℃；流動(dòng)相A：水（0.1%甲酸），流動(dòng)相B：乙腈（0.1%甲酸）。

1.2.4 質(zhì)譜條件

掃描模式：負(fù)離子和正離子模式；掃描范圍：m/z 100～1 500；霧化氣：50 psi；離子源溫度（TEM）：330 ℃；離子源電壓（IS）：+4 500 V 或-4 500 V。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)的處理是參考文獻(xiàn)[11-13]分析物質(zhì)類型和物質(zhì)的名稱，通過光譜圖分析物質(zhì)含量變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 慕薩萊思釀造過程中物質(zhì)種類及含量變化

2.1.1 葡萄原汁與濃縮汁

葡萄原汁與濃縮汁色譜圖見圖1。

圖1 葡萄原汁和濃縮葡萄汁在UPLC-UV-280nm下的色譜圖Fig.1 Chromatogram of grape juice and concentrated grape juice at uplc-uv-280 nm

分析圖1中的色譜峰可以得出，葡萄原汁的物質(zhì)分析結(jié)果按照保留時(shí)間排序，2.827 min 處沒食子酸、8.360 min 處為咖啡酸、9.560 min 處為原花色素B1、10.107 min 處為酒石酸、10.753 min 處為兒茶素、12.460 min 處為原花色素B2、13.613 min 處為表兒茶素、14.473 min 處為黃諾馬苷、17.878 min 處為蘆丁、18.513 min 處為槲皮素-3-氧-葡萄糖苷[14-15]。濃縮汁的物質(zhì)分析結(jié)果按照保留時(shí)間排序，2.413 min 處為沒食子酸[16-17]、8.013 min 處為咖啡酸、9.347 min 處原花色素B1、9.893 min 處為酒石酸、10.587 min 處為兒茶素、11.053 min 處為香豆酸、12.373 min 處為原花色素B2、13.587 min 處為表兒茶素、14.473 min 處為黃諾馬苷、17.820 min 處為蘆丁、18.187 min 處為槲皮素-3-氧-葡萄糖苷[18-20]。

2.1.2 葡萄原汁與慕薩萊思（自釀）

圖2是葡萄原汁和慕薩萊思（自釀）色譜圖。

圖2 葡萄原汁和慕薩萊思（自釀）在UPLC-UV-280nm下的色譜圖Fig.2 The chromatogram of grape juice and mousselas at uplc-uv-280 nm

慕薩萊思成品酒物質(zhì)分析按照保留時(shí)間排序，2.060 min 處為肉桂酸、2.727 min 處為沒食子酸、8.113 min 處為咖啡酸、9.573 min 處為原花色素B1、9.747 min 處為4-脫氧-奎寧酸、10.760 min 處為兒茶素、11.233 min 處為香豆酸、12.507 min 處為原花色素B2、13.707 min 處為表兒茶素、14.500 min 處為黃諾馬苷、17.877 min 處蘆丁、18.627 min 處為槲皮素-3-氧-葡萄糖苷。

2.2 葡萄酒（食品系釀）與葡萄酒（進(jìn)口）、慕薩萊思（阿瓦提）物質(zhì)種類及含量差異

2.2.1 慕薩萊思（阿瓦提）與葡萄酒（進(jìn)口）

慕薩萊思（阿瓦提）與葡萄酒（進(jìn)口）色譜圖如圖3所示。

圖3 阿瓦提慕薩萊思葡萄酒和進(jìn)口葡萄酒在UPLC-UV-280nm下的色譜圖Fig.3 The chromatogram of moussa and imported wine at uplc-uv-280 nm

分析圖3中的色譜峰，慕薩萊思（阿瓦提）物質(zhì)分析按照保留時(shí)間排序，2.233 min 處為肉桂酸、2.900 min 處為沒食子酸、6.187 min 處為原兒茶酸、8.660 min 處為咖啡酸、9.567 min 處為香豆酸、9.980 min 處為4-脫氧-奎寧酸、11.027 min 處為兒茶素、13.953 min 處為表兒茶素、18.860 min 處為槲皮素-3-氧-葡萄糖苷。

葡萄酒（進(jìn)口）物質(zhì)分析按照保留時(shí)間排序，1.420 min 處為酒石酸、1.940 min 處為蘋果酸、2.147 分鐘處為肉桂酸、2.853 min 處為沒食子酸、6.073 min 處為原兒茶酸、9.840 min 處為4-脫氧-奎寧酸、10.640 min 處為白皮杉醇、15.793 min 處為紫丁香酸、17.313 min 處為香豆酸、18.727 min 處為槲皮素-3-氧-葡萄糖苷、19.240 min 處為黃諾馬苷。

2.2.2 慕薩萊思（阿瓦提）與葡萄酒（食品系釀）

慕薩萊思（阿瓦提）與葡萄酒（食品系釀）見圖4。

圖4 阿瓦提慕薩萊思葡萄酒和自釀葡萄酒在UPLC-UV-280nm下的色譜圖Fig.4 The chromatogram of muthalaisi and self-brewed wine at uplc-uv-280 nm

分析圖4色譜圖得出，自釀葡萄酒的物質(zhì)分析按照保留時(shí)間排序，1.327 min 處為酒石酸、2.367 min 處為肉桂酸、3.100 min 處為沒食子酸、5.747 min 處為原兒茶酸、9.180 min 處為香豆酸、9.920 min 處為4-脫氧-奎寧酸、13.653 min 處為白藜蘆醇-3-氧-葡萄糖苷、16.560 min 處為紫丁香酸、19.520 min 處為槲皮素-3-氧-葡萄糖苷、19.793 min 處為黃諾馬苷。

2.2.3 慕薩萊思釀造過程中及幾種成品酒物質(zhì)含量的變化

對(duì)慕薩萊思釀造過程中物質(zhì)的變化做相對(duì)定量分析（UV-280 nm 下色譜圖的峰面積）。主要涉及樣品：原汁、濃縮汁、慕薩萊思（自釀）、慕薩萊思（阿瓦提）、葡萄酒（進(jìn)口）、葡萄酒（食品系釀）。成分含量變化見表1。

表1 慕薩萊思釀造過程中成分含量的變化（峰面積）Table 1 Changes in composition content of moussa's brewing process（peak area）

慕薩萊思釀造過程中咖啡酸、兒茶素含量在濃縮階段陡然升高，考慮到濃縮液體并未成倍減少，判斷是在濃縮過程中復(fù)雜的原汁成分發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致咖啡酸、兒茶素含量在濃縮階段突然升高。槲皮素-3-氧-葡萄糖苷的最高含量出現(xiàn)在釀造結(jié)束階段，對(duì)比成品酒中的含量，初步可以判斷槲皮素-3-氧-葡萄糖苷會(huì)隨著釀造階段的完成，在陳釀階段含量會(huì)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。沒食子酸的含量在慕薩萊思成品酒2 中比原汁中增加了8 倍。在慕薩萊思成品酒中的原花色素B2 的含量大于原花色素B1。表兒茶素的含量增加了大約一倍，槲皮素-3-氧-葡萄糖苷的含量增加了1.3 倍，蘆丁的含量增加了1.7 倍。香豆酸、肉桂酸和4-脫氧-奎寧酸的含量在基本保持在一個(gè)水平上。

對(duì)不同葡萄酒中的物質(zhì)種類及含量進(jìn)行分析，沒食子酸的含量在葡萄酒（進(jìn)口）和葡萄酒（食品系釀）樣品中的含量很高，在慕薩萊思（阿瓦提）樣品中含量偏低。4-脫氧-奎寧酸在葡萄酒（進(jìn)口）和葡萄酒（食品系釀）樣品中含量較高，根據(jù)樣品的保存時(shí)間，由此可知樣品存放時(shí)間越久，4-脫氧-奎寧酸有升高的趨勢(shì)。

酒石酸在葡萄酒（進(jìn)口）樣品中含量較高，而在慕薩萊思（阿瓦提）和葡萄酒（食品系釀）樣品中含量相差不大。肉桂酸在3 種葡萄酒中含量均較低。慕薩思（阿瓦提）中香豆酸和槲皮素-3-氧-葡萄糖苷的含量高于葡萄酒（進(jìn)口）和葡萄酒（食品系釀），后兩者酒中香豆酸和平共處槲皮素-3-氧-葡萄糖苷的含量均較低。咖啡酸和兒茶素在慕薩萊思（阿瓦提）中含量較高，且另外兩種成品葡萄酒中未檢測(cè)出。表兒茶素只在慕薩萊思（阿瓦提）中檢出，蘋果酸和白皮杉醇僅在葡萄酒（進(jìn)口）中檢出，并且三者含量均較低。由于生產(chǎn)工藝的不同、生產(chǎn)原料的不同以及生產(chǎn)時(shí)生產(chǎn)條件不同，致使每種葡萄酒中的成分也不相同。

對(duì)樣品的成分進(jìn)行分析，并且參考相關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)樣品中的成分進(jìn)行鑒定確定分子量、一級(jí)碎片、二級(jí)碎片[21-23]。在負(fù)離子模式下得到23 種成分，其中5 種成分目前不能確定屬性，相關(guān)文獻(xiàn)也并未進(jìn)行報(bào)道。具體內(nèi)容如表2所示。

表2 慕薩萊思的不同釀造時(shí)期以及進(jìn)口葡萄酒、自釀葡萄酒的成分分析Table 2 The analysis of the ingredients of the different brewing period and the imported wine and the wine

通過表2可知，葡萄酒中含有較多種類的酚類物質(zhì)，酚類物質(zhì)有抗氧化活性，此成分對(duì)人體有益，可以進(jìn)行相關(guān)的研究。同時(shí)我們可以發(fā)現(xiàn)有一些未知成分并未鑒定出來，這在未來的研究中可以作為一個(gè)重點(diǎn)來進(jìn)行探索。

3 結(jié)論與討論

3.1 慕薩萊思釀造過程中物質(zhì)種類及含量變化

本研究中，對(duì)慕薩萊思的釀造過程中的原汁、濃縮汁、慕薩萊思的成品酒分別采樣，檢測(cè)出了慕薩萊思釀造過程中13 種物質(zhì)（沒食子酸、咖啡酸、原花色素B1、酒石酸、兒茶素、原花色素B2、表兒茶素、黃諾馬苷、槲皮素-3-氧-葡萄糖苷、蘆丁、香豆酸、肉桂酸、4-脫氧-奎寧酸）的含量。結(jié)果表明，檢測(cè)出的物質(zhì)大部分為酚類，咖啡酸、兒茶素和槲皮素-3-氧-葡萄糖苷的含量較高。

本研究在對(duì)慕薩萊思釀造過程檢測(cè)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，酚類物質(zhì)占檢測(cè)出物質(zhì)總數(shù)量的大多數(shù)。葡萄酒中的酚類物質(zhì)決定了酒的顏色、口感，使葡萄酒呈現(xiàn)出特殊的味道。發(fā)酵的條件、陳釀方式對(duì)葡萄酒中的酚類物質(zhì)也有很大的影響。酚類物質(zhì)的浸漬情況決定了葡萄酒浸漬的時(shí)間的長短[11]。如果浸漬的時(shí)間過長，單寧的含量過高，會(huì)使葡萄酒變得過于苦澀，并且單寧對(duì)發(fā)酵過程中的菌和酶有抑制作用，降低酵母菌的活力，嚴(yán)重的能夠使酵母菌發(fā)酵停止。如果浸漬時(shí)間不足，單寧的含量太低就會(huì)使葡萄酒的口味變?nèi)?。在慕薩萊思的釀造過程中兒茶素的含量較高，但發(fā)酵過程中兒茶素的含量變化不大；原花色素B1、B2 的含量較低但變化較大，致使單寧的含量不容易控制。酚類物質(zhì)在葡萄酒的釀造、儲(chǔ)存過程中，對(duì)酒的色澤、口感的變化起到重要的作用[12]。比如，紅葡萄酒中的花色素和單寧兩類物質(zhì)構(gòu)成酒的色澤。

兒茶素在慕薩萊思釀造過程中先增加再減少，可能是因?yàn)樵ㄉ卦谒嵝缘臈l件下c-c 鍵裂開，從而產(chǎn)生了少量的兒茶素，之后單體酚間發(fā)生氧化反應(yīng)或聚合反應(yīng)，使兒茶素的含量減少[13]。酚類物質(zhì)中兒茶素及其縮合單寧對(duì)葡萄酒風(fēng)味的作用最大，是紅葡萄酒中苦澀味道的主要來源[14]。

慕薩萊思的釀造過程中咖啡酸含量的變化較大，在濃縮汁和慕薩萊思新酒中含量均較高。酚類物質(zhì)中咖啡酸可以使葡萄酒在儲(chǔ)藏期間的花葵素-3-葡萄糖苷的色度增加[15]，在葡萄酒發(fā)酵前加入咖啡酸有利于穩(wěn)定葡萄酒的顏色，還能夠防止葡萄酒氧化。Darias～Martin 等[16]的試驗(yàn)表明，咖啡酸對(duì)紅葡萄酒顏色的穩(wěn)定和防止氧化有重要作用。增加有機(jī)酸的含量可以增加紅葡萄酒顏色的穩(wěn)定性[17]。

3.2 慕薩萊思（阿瓦提）與葡萄酒（進(jìn)口）、葡萄酒（食品系）物質(zhì)種類及含量

本研究對(duì)慕薩萊思（阿瓦提）、葡萄酒（進(jìn)口）以及葡萄酒（食品系釀）分別采樣，檢測(cè)出了15 種物質(zhì)（肉桂酸、沒食子酸、原兒茶酸、咖啡酸、香豆酸、4-脫氧-奎寧酸、兒茶素、表兒茶素、槲皮素-3-氧-葡萄糖苷、蘋果酸、白皮杉醇、紫丁香酸、酒石酸、黃諾馬苷、白藜蘆醇-3-氧-葡萄糖苷）的含量。結(jié)果表明，3 種葡萄酒中大部分物質(zhì)為酚類物質(zhì)并且某些酚類物質(zhì)（沒食子酸、酒石酸、奎寧酸）的含量較高。慕薩萊思中的肉桂酸、香豆酸含量均高于進(jìn)口葡萄酒和自釀葡萄酒?？Х人醿H在慕薩萊思檢出并含量較高，蘋果酸只在進(jìn)口葡萄酒中檢出。

本研究?jī)H在進(jìn)口葡萄酒中檢測(cè)到了蘋果酸，葡萄酒中的蘋果酸是葡萄酒釀造過程中蘋果酸-乳酸發(fā)酵（Malolactic Fermentation，MLF）重要的反應(yīng)物，MLF 是葡萄酒發(fā)酵過程中改善酒的口感的重要反應(yīng)[18]。經(jīng)MLF之后，葡萄酒中的單體化合物減少，結(jié)合態(tài)的花色苷和單寧的比例增加，在口感質(zhì)量、深度以及單寧和整體質(zhì)量上均有改善。正常葡萄酒發(fā)酵經(jīng)過MLF 之后蘋果酸應(yīng)該幾乎全部消失，轉(zhuǎn)化為乳酸[19]。慕薩萊思和自釀葡萄酒中未檢測(cè)出蘋果酸，可以表明這兩種葡萄酒的MLF過程進(jìn)行的比較完全，而進(jìn)口葡萄酒樣品中檢測(cè)出少量的蘋果酸，可能是MLF 過程中蘋果酸轉(zhuǎn)化不徹底[20]。

慕薩萊思中的咖啡酸和香豆酸含量較另外兩種葡萄酒要高，咖啡酸、香豆酸都屬于酚酸類物質(zhì)，呂海濤等[22]的研究表明葡萄酒中的咖啡酸、香豆酸在光照、溫度、酸度等變化的條件下含量的變化很大。慕薩萊思中咖啡酸和香豆酸的含量相比于葡萄酒（進(jìn)口）和葡萄酒（食品系釀）高，有可能是上述條件引起的葡萄酒（進(jìn)口）和葡萄酒（食品系釀）中兩種物質(zhì)的含量下降[22]，或者是3 種葡萄原料本身咖啡酸、香豆酸的含量差別就很大。

3.3 結(jié)論

3.3.1 慕薩萊思釀造過程中物質(zhì)含量的變化

在慕薩萊思的釀造過程中，檢測(cè)出的物質(zhì)大部分為酚類。含量最高的物質(zhì)是咖啡酸、兒茶素、槲皮素-3-氧-葡萄糖苷。沒食子酸、咖啡酸、原花色素B1、兒茶素、表兒茶素、蘆丁的含量先增加再減少，原花青素B2 的含量呈先增大后減小再增大再減小的變化規(guī)律，成品酒中原花色素B2 的含量大于原花色素B1 的含量，這與李蕊蕊[23]的研究結(jié)果一致。槲皮素-3-氧-葡萄糖苷、香豆酸、肉桂酸、酒石酸的含量升高，4-脫氧-奎寧酸、黃諾馬苷的含量基本保持不變。肉桂酸和4-脫氧-奎寧酸在原汁和濃縮汁均未檢測(cè)出，香豆酸在原汁中未檢測(cè)出。

3.3.2 慕薩萊思（阿瓦提）、葡萄酒（進(jìn)口）和葡萄酒（食品系）3 種成品酒的差別

對(duì)慕薩萊思（阿瓦提）、葡萄酒（進(jìn)口）以及葡萄酒（食品系釀）分別分析，3 種葡萄酒中沒食子酸的含量均較高，4-脫氧-奎寧酸在葡萄酒（進(jìn)口）和葡萄酒（食品系釀）中含量較高，酒石酸在葡萄酒（進(jìn)口）和葡萄酒（食品系釀）中含量較高但在慕薩萊思（阿瓦提）中未檢測(cè)出，肉桂酸在3 種葡萄酒中含量均較低。慕薩萊思（阿瓦提）中的原兒茶酸的含量要低于葡萄酒（進(jìn)口）和葡萄酒（食品系釀），原兒茶酸在葡萄酒（進(jìn)口）和葡萄酒（食品系釀）中的含量相差不大。慕薩萊思（阿瓦提）中香豆酸和槲皮素-3-氧-葡萄糖苷的含量高于葡萄酒（進(jìn)口）和葡萄酒（食品系釀），香豆酸和槲皮素-3-氧-葡萄糖苷的含量在葡萄酒（進(jìn)口）和葡萄酒（食品系釀）中的含量均較低。葡萄酒（進(jìn)口）和葡萄酒（食品系釀）中未檢測(cè)出咖啡酸和兒茶素，但咖啡酸和兒茶素在慕薩萊思（阿瓦提）中有較高的含量。表兒茶素只在慕薩萊思中檢出，蘋果酸和白皮杉醇僅在葡萄酒（進(jìn)口）中檢出，并且3 者含量均較低。紫丁香酸和黃諾馬苷在葡萄酒（進(jìn)口）和葡萄酒（食品系釀）含量差別不大，但在慕薩萊思（阿瓦提）中未檢測(cè)出，白藜蘆醇-3-氧-葡萄糖苷只在葡萄酒（食品系釀）中有檢出。