響應(yīng)面優(yōu)化超聲輔助提取胭脂果色素工藝研究

張言，高定烽，李思敏，熊華斌，2，3，*，高云濤，楊志

（1.云南民族大學(xué)化學(xué)與環(huán)境學(xué)院，云南昆明650500；2.云南省跨境民族地區(qū)生物質(zhì)資源清潔利用國際聯(lián)合研究中心，云南昆明650500；3.民族地區(qū)礦產(chǎn)資源綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明650500）

胭脂果又名鬼眼睛果、狗眼睛果等。胭脂果樹木分布并不是非常廣泛，主要生長在云南省的德宏州，8月生長最為茂盛，富含黃酮類、內(nèi)酯、蛋白質(zhì)、脂肪和微量礦物質(zhì)，是補(bǔ)氣血的佳果。此外含有大量胡蘿卜素、黃酮和維生素C，可以增加人體的免疫力，滋潤皮膚，具有延緩衰老、抗癌等作用。采摘后的新鮮水果，可以直接食用，也可以用鹽和辣椒腌制，或者用白糖燉煮。它具有強(qiáng)化脾臟開胃的作用，對(duì)消化不良有很大幫助。

近幾年國內(nèi)對(duì)植物天然色素的提取[1-3]有很大的進(jìn)展研究，但對(duì)胭脂果的研究鮮有報(bào)道，為了更好的、更科學(xué)的開發(fā)利用胭脂果資源，本試驗(yàn)以胭脂果為原材料，采用超聲輔助提取胭脂果色素，通過單因素[4-5]和響應(yīng)面試驗(yàn)[6-7]進(jìn)行優(yōu)化得到最佳提取條件，實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，旨在為胭脂果色素的綜合開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

胭脂果果實(shí)采自于德宏盈江；95%乙醇、乙酸乙酯、乙二醇、石油醚（均為分析純）：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

SJIA-2012 超聲波細(xì)胞破碎機(jī)、DC-2006 低溫恒溫槽：寧波雙嘉儀器有限公司；8453 型紫外可見分光光度計(jì)：美國安捷倫公司；FA2004 電子分析天平：上海上平儀器公司；HH-6 雙列六孔水浴鍋：力辰科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色素最佳溶劑的選擇及最大吸收峰的測定

稱取2.0 g 胭脂果干燥果實(shí)7 份，放置于7 個(gè)50 mL燒杯內(nèi)，分別加入50 mL 超純水、30%乙醇、50%乙醇、95%乙醇、石油醚、乙酸乙酯、乙二醇，然后在室溫下振蕩萃取12 h，過濾，濾液做光譜掃描測定。

取2.0g 胭脂果干燥果實(shí)樣本，按液固比10∶1（mL/g）加入上述最佳的提取溶劑，分置于50、60、70 ℃水浴中萃取2 h，以4 000 r/min 離心10 min，取上清液，備測。備測樣品用對(duì)應(yīng)溶劑稀釋25 倍，再進(jìn)行200 nm～700 nm 的光譜掃描，得到色素溶液的吸收光譜和最大吸收峰。

1.3.2 考察提取液固比

準(zhǔn)確稱取2.0 g 胭脂果干粉共6 份，分別置于6 個(gè)200 mL 燒杯中，以保鮮膜封口，按液固比5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1（mL/g）加入最佳的溶劑開展平行色素提取試驗(yàn)，每個(gè)平行組均置60 ℃水浴中浸提2 h，然后取濾液離心，稀釋相同的倍數(shù)，備測。

1.3.3 考察超聲功率

精確稱取2.0 g 胭脂果胭脂果干粉共7 份，置于200 mL 燒杯中，以保鮮膜封口并置60 ℃水浴中浸提2 h，然后取出各燒杯，設(shè)置液固比為15∶1（mL/g），超聲時(shí)間為40 min，分別以100、200、300、400、500、600、700 W 進(jìn)行超聲輔助提取，然后取濾液離心，稀釋相同的倍數(shù)，備測。

1.3.4 考察超聲時(shí)間

準(zhǔn)確稱取7 份2.0 g 胭脂果干粉，置于200 mL 燒杯中，將瓶口以保鮮膜封口并置60 ℃水浴中浸提2 h，然后取出各燒杯，設(shè)置液固比為15∶1（mL/g），超聲功率為500W，分別超聲輔助提取10、20、30、40、50、60min，然后取濾液離心，稀釋相同的倍數(shù)，備測。

1.3.5 色素超聲輔助提取的響應(yīng)面法優(yōu)化

選取色素提取試驗(yàn)中的液固比、超聲功率和超聲時(shí)間3 個(gè)因素為自變量，以提取色素的吸光度值為響應(yīng)值，采用Design Expert 軟件進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)[8]，然后根據(jù)所得設(shè)計(jì)結(jié)果進(jìn)行試驗(yàn)，最終采用所得試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面分析，獲取所需試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 色素最佳溶劑的選擇及最大吸收峰的測定

不同種類溶劑對(duì)胭脂果果實(shí)色素的溶解性見表1。

表1 不同種類溶劑對(duì)胭脂果果實(shí)色素的溶解性Table 1 Solubility of different kinds of solvent to pigment of carmine fruit

由表1可知，在胭脂果色素振蕩萃取的試驗(yàn)中，對(duì)比7 種溶劑，50%乙醇是色素溶出的最佳的溶劑，故均用50%乙醇作為溶劑進(jìn)行以下試驗(yàn)。

50、60 ℃和70 ℃水浴萃取的上層清液在200 nm～700 nm 范圍光譜吸收?qǐng)D見圖1。

如圖1所示三者都有相似的光譜圖，都顯示277 nm是色素溶液的最大光吸收波長。并在277 nm 波長處的吸光度分別是：0.614、0.831 和0.824。說明60 ℃是50%乙醇萃取胭脂果色素的最佳溫度，50 ℃時(shí)吸光度是最低的，70 ℃時(shí)吸光度略低于60 ℃，但是由于乙醇的沸點(diǎn)為78.15℃，所以在70 ℃下已經(jīng)接近揮發(fā)，損耗太大[9]，所以為了后續(xù)試驗(yàn)故使用60 ℃作為提取溫度。

圖1 胭脂果果實(shí)色素溶液的吸收光譜Fig.1 Absorption spectrum of pigment solution of carmine fruit

2.2 液固比對(duì)色素提取的影響

不同液固比條件下提取的胭脂果色素溶液的吸光度見圖2。

圖2 不同液固比條件下提取的胭脂果色素溶液的吸光度Fig.2 Absorbance of carmine fruit pigment solution extracted under different liquid ratios

由圖2可知，在液固比5∶1（mL/g）～30∶1（mL/g），提取率隨液固比增大呈上升趨勢，液固比增加到15∶1（mL/g）時(shí)，色素提取的吸光度達(dá)到最大，液固比大于15∶1（mL/g）時(shí)，色素提取的吸光度隨著液固比增加而緩慢減少，這是由于隨著胭脂果干粉質(zhì)量增加，溶解的色素也在增加，但是乙醇體積有限，溶解能力有限，無法將胭脂果干粉全部溶解，故色素提取的吸光度值反而降低，因此出現(xiàn)提取吸光度隨著液固比增加，而提取率下降的現(xiàn)象。所以本試驗(yàn)選擇了液固比為15∶1（mL/g）。

2.3 超聲功率對(duì)色素提取的影響

不同超聲功率條件下提取的胭脂果色素溶液的吸光度見圖3。

圖3 不同超聲功率條件下提取的胭脂果色素溶液的吸光度Fig.3 Absorbance of carmine fruit pigment solution extracted under different ultrasonic power

由圖3可知，超聲輸出100 W 到200 W 時(shí)吸光度幾乎沒有變化。但從200 W 開始，隨著輸出功率的增加，色素的吸光度也開始開始增加，至超聲功率為500 W 時(shí)，色素的吸光度值達(dá)到了最大為0.874；繼續(xù)增大超聲功率，提取果實(shí)色素的溶液吸光度反而下降。對(duì)胭脂果果實(shí)色素提取的這種影響，可能是由于超聲功率過高，超聲波對(duì)胭脂果的組織結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了破壞作用[10-11]，體系中有微小的淀粉顆粒析出并吸附了部分色素分子，這一部分色素在離心過程中被沉淀，從而造成提取液的吸光度降低[12]。所以本試驗(yàn)選擇了超聲功率為500 W。

2.4 超聲時(shí)間對(duì)色素提取的影響

不同超聲時(shí)間條件下提取的胭脂果色素溶液的吸光度見圖4。

圖4 不同超聲時(shí)間條件下提取的胭脂果色素溶液的吸光度Fig.4 Absorbance of carmine fruit pigment solution extracted under different ultrasonic time conditions

由圖4可以看出，在0 min～20 min 時(shí)，隨著超聲時(shí)間的延長，提取液的吸光度值呈直線上升趨勢；與0min～20 min 時(shí)相比，隨著超聲時(shí)間的延長，20 min～50 min時(shí)提取液的吸光度值較平緩，這可能是由于隨著超聲時(shí)間的延長，溶劑體系的滲透壓接近平衡，色素隨著溶劑向細(xì)胞外緩慢擴(kuò)散[13]，從而表現(xiàn)為提取液的吸光度增加緩慢。所以本試驗(yàn)選擇了超聲時(shí)間為60 min。

2.5 色素超聲輔助提取的響應(yīng)面法優(yōu)化

2.5.1 中心復(fù)合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（central composite design，CCD）設(shè)計(jì)及其試驗(yàn)結(jié)果

在超聲輔助提取胭脂果色素工藝的過程中，單因素試驗(yàn)可以考察不同條件對(duì)胭脂果素色提取的影響，而響應(yīng)面分析法則可以同時(shí)考察多因素相互作用下胭脂果素色的提取效果，更直觀的反應(yīng)各因素的影響情況和程度[14]。在探究胭脂果素色提取的過程中，適當(dāng)超聲的引入有利于提高胭脂果色素的提取率，但大功率的超聲的使用則產(chǎn)生反作用，由此可見，超聲功率是構(gòu)建胭脂果色素的提取的關(guān)鍵性因素，故選取超聲功率作為響應(yīng)面分析的影響因素。此外，在單因素試驗(yàn)中，一定范圍內(nèi)的液固比和超聲時(shí)間對(duì)胭脂果素色的提取的影響較為顯著，故將其作為響應(yīng)面分析的影響因素。因此，采用Design-Expert 8.05 軟件[15]中的中心復(fù)合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（central composite design，CCD）法對(duì)色素提取體系中液固比、超聲時(shí)間和超聲功率對(duì)色素提取的影響進(jìn)行探究。根據(jù)CCD 設(shè)計(jì)原理，液固比、超聲時(shí)間和超聲功率各設(shè)置3 個(gè)水平，因素水平表見表2。

表2 響應(yīng)面優(yōu)化超聲輔助提取試驗(yàn)的因素與水平值Table 2 Factors and levels of response surface optimization for ultrasonic assisted extraction test

通過Design-Expert 8.05 分析軟件獲得的試驗(yàn)方案及其采用該方案獲得的試驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

表3 CCD試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果Table 3 CCD test design and experimental results

續(xù)表3 CCD試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果Continue table 3 CCD test design and experimental results

2.5.2 回歸和方差分析

以胭脂果色素的提取為響應(yīng)值，在響應(yīng)面分析軟件中對(duì)液固比、超聲時(shí)間和超聲功率進(jìn)行回歸擬合，響應(yīng)值R（吸光度）與各影響因子間的回歸方程為：

R=0.81+0.14A+0.020B+0.052C-6.000×10-3AB+0.010AC+0.036BC-0.027A2-0.045B2-0.054C2所得模擬方程具有較好的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為R2=0.988 4。此外，對(duì)回歸模型進(jìn)行了方差分析，結(jié)果如表4所示。

表4 色素提取回歸方差分析結(jié)果Table 4 Regression variance analysis results of pigment extraction

建立模型的P＜0.000 1，具有高度顯著性，失擬項(xiàng)的P＞0.1，無顯著性，由此可見，所建模型可用于色素提取的響應(yīng)面分析。此外，A、B、C、A2、B2、C2項(xiàng)的P值均小于0.05，表現(xiàn)出顯著性，這表明液固比、超聲時(shí)間和超聲功率均為提取過程中影響色素提取的主要因素，其中，A、A2、C2項(xiàng)的P＜0.000 1，即液固比對(duì)色素提取的影響高度顯著。AB、AC、BC項(xiàng)中，僅有AC的P＜0.05，這表明液固比和超聲功率對(duì)色素提取的影響在一定程度上表現(xiàn)出交互作用，而其他因素間則無此效應(yīng)。

2.5.3 響應(yīng)面分析

各因素及其交互作用對(duì)超聲輔助提取影響的響應(yīng)面圖見5。

圖5顯示了液固比（A）、液固比超聲時(shí)間（B）和超聲功率（C）3 個(gè)因素對(duì)胭脂果色素提取的等高線圖（a、c、e）和3D 響應(yīng)面圖（b、d、f）。由圖5a 可以看出，沿著B因素（超聲時(shí)間）向峰值方向移動(dòng)，其等高線的密度明顯低于沿A因素（液固比）方向，由此可見，相對(duì)于超聲時(shí)間，液固比對(duì)胭脂果色素提取的影響更為顯著。由對(duì)應(yīng)的3D 響應(yīng)面圖（5b）也能獲取相同的結(jié)果，在B因素方向，響應(yīng)面曲線較為平緩，說明超聲功率對(duì)色素提取的影響較小，隨超聲時(shí)間的增加，色素提取有增加的趨勢，但增加的程度并不大，影響并不十分顯著，而沿A因素方向則出現(xiàn)了較為明顯的變化，響應(yīng)面曲線較陡，液固比引起色素提取的變化較大，說明液固比色素提取的影響大于超聲時(shí)間。

圖5c和圖5d則顯示了A 因素（液固比）和C 因素（超聲功率）對(duì)色素提取的影響。由等高線圖可以看出，沿著C 因素（超聲功率）向峰值方向移動(dòng)的等高線密度也要相對(duì)低于沿A 因素（液固比）方向。由3D 響應(yīng)面圖則可以看出，在A 因素方向響應(yīng)面曲線有一定的坡度，但是，在C 因素方向，響應(yīng)面曲線較為平緩，說明超聲功率對(duì)色素提取的影響較小，隨超聲功率的增加，色素提取有增加的趨勢，但增加的程度并不大，影響并不十分顯著。由此可見，A 因素變化對(duì)結(jié)果的影響要高于C 因素，即相對(duì)于超聲功率，液固比的影響更大。

圖5 各因素及其交互作用對(duì)超聲輔助提取影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface diagram of each factor and its interaction effect on ultrasonic assisted extraction

由圖5e和圖5f可以比較B 因素（超聲時(shí)間）和C因素（超聲功率）對(duì)色素提取的影響。由兩因素沿峰值方向的等高線密度及其3D 響應(yīng)面圖中響應(yīng)面曲線的陡峭程度可以看出，B、C 兩因素的影響也存在較大差異，相對(duì)于超聲功率，超聲時(shí)間的影響較弱一些。響應(yīng)面分析直觀反映了各因素的影響情況，其效果優(yōu)于單因素試驗(yàn)，綜合分析可以發(fā)現(xiàn)，3 個(gè)因素對(duì)色素提取的影響有所不同，其程度大小為：液固比＞超聲功率＞超聲時(shí)間。

通過響應(yīng)面分析模型對(duì)色素提取條件進(jìn)行了優(yōu)化分析，預(yù)測的最優(yōu)條件為：液固比16.82∶1（mL/g）、超聲時(shí)間45.96 min、超聲功率475.85 W，預(yù)測的最優(yōu)色素提取吸光度值為0.959。為了提取色素試驗(yàn)的可控性和可行性，對(duì)預(yù)測條件進(jìn)行了修正：液固比17∶1（mL/g）、超聲時(shí)間46 min、超聲功率480 W。通過試驗(yàn)檢驗(yàn)最優(yōu)預(yù)測條件下的提取效果，色素提取吸光度值與預(yù)測值相接近，達(dá)到0.94，相差0.019。

3 結(jié)論

以胭脂果為研究對(duì)象，采用超聲輔助手段對(duì)胭脂果的色素進(jìn)行提取。通過單因素試驗(yàn)可知液固比、超聲功率和超聲時(shí)間對(duì)色素提取均有顯著影響作用。通過響應(yīng)面分析模型對(duì)色素提取條件進(jìn)行了優(yōu)化分析，預(yù)測的最優(yōu)條件為0.959。通過試驗(yàn)檢驗(yàn)最優(yōu)預(yù)測條件下的提取效果，色素提取吸光度值與預(yù)測值相接近，達(dá)到0.94，相差0.019。