信號分子在好氧顆粒污泥形成過程中的作用

王玉瑩,支麗玲,馬鑫欣,王 碩,2,李 激,2*

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信號分子在好氧顆粒污泥形成過程中的作用

王玉瑩1,支麗玲1,馬鑫欣1,王 碩1,2,李 激1,2*

(1.江南大學江蘇省厭氧生物技術重點實驗室,江蘇 無錫 214122；2.江南大學江蘇省高校水處理技術與材料協同創(chuàng)新中心,江蘇 蘇州 215009)

采用人工配水成功培養(yǎng)好氧顆粒污泥,針對絮狀污泥顆?；^程中污泥的理化性質、污染物去除效率、胞外聚合物和信號分子變化進行相關分析.結果發(fā)現,在好氧顆粒污泥的形成過程中,污泥對污染物去除能力明顯提高.與接種污泥相比,成熟的好氧顆粒污泥對COD、NH4+-N和PO43--P去除率分別提高20%、36%和57%.好氧顆粒污泥中胞外蛋白質和多糖含量分別增加了116和31mg/gMLVSS.采用激光共聚焦掃描顯微鏡對接種污泥和好氧顆粒污泥進行空間表征,發(fā)現后者蛋白質含量明顯增加,說明蛋白質在污泥顆?；^程中具有重要作用;磷酸二酯酶活性總體呈現上升趨勢,第二信使環(huán)二鳥苷酸(cyclic diguanylic, c-di-GMP)含量先增加后降低,與胞外聚合物中蛋白質和多糖的變化規(guī)律相似.通過SPSS軟件進一步分析得知,c-di-GMP與蛋白質相關系數2=0.92871,呈極顯著相關性;與緊密結合型胞外聚合物中蛋白質相關系數2=0.89025,呈顯著相關性,推測c-di-GMP可能是通過指導緊密結合型胞外聚合物中的蛋白質合成以促進好氧顆粒污泥的形成.

好氧顆粒污泥；胞外聚合物；蛋白質和多糖；信號分子；磷酸二酯酶

好氧顆粒污泥(AGS)是一種特殊的生物膜結構,可通過微生物間的自固定化形成橢球或球狀的顆粒[1-3].與傳統(tǒng)活性污泥相比,AGS的突出特點是生物量高、微生物種類豐富、生長速度快,優(yōu)異的沉降性能可提高污水處理效果[4-6].20世紀90年代,AGS首次在UASB反應器中被發(fā)現,后來被各國學者所研究和探討[7].2003年,荷蘭首次搭建了以AGS為主體處理廢水的中試裝置[1].2010年,AGS技術已經正式應用于實際污水處理廠[7].但是迄今為止,關于AGS的形成機理仍處于假說階段,有研究表明信號分子在污泥顆?；^程中發(fā)揮重要作用[1],本文主要從信號分子的角度來闡釋絮狀污泥的顆?；^程.

大部分微生物的生長代謝活動都與群體感應現象相關[2],即細菌會通過信號分子感知外界環(huán)境變化,從而精確調控生物體代謝、物質合成以及行為方式改變等[8].環(huán)二鳥苷酸(c-di-GMP)是微生物體內普遍存在的信號分子,它的合成與分解分別受到位于同一結構域的二鳥苷酸環(huán)化酶(DGC)和磷酸二酯酶的調節(jié)[9].其中,兩分子的三磷酸鳥苷(GTP)在二鳥苷酸環(huán)化酶作用下形成環(huán)二鳥苷酸;過量環(huán)二鳥苷酸會被含有EAL(Glu-Ala-Leu)或HD-GYP(His- Asp,Gly-Tyr-Pro)結構域的磷酸二酯酶水解成兩分子環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)而失活[10].c-di-GMP的存在會影響微生物運動方式、生物膜的形成以及細胞分化等[11]. Christen等[12]研究發(fā)現,高濃度的c-di- GMP會促進胞外聚合物(EPS)的分泌,影響污泥的顆?；M程.Karaolis等[13]證明,c-di-GMP與微生物運動狀態(tài)有關,可將細菌由單細胞游離型轉變?yōu)槎嗉毎酆闲?促進生物膜形成,抵抗抗生素攻擊.還有研究者認為,信號分子c-di-GMP可促進EPS中多糖的合成,從而改變細菌菌落形態(tài)[14].

本研究利用SBR培養(yǎng)AGS,對該過程中污染物去除效果和AGS特性進行相關分析,并深入研究了絮狀污泥顆?；^程中信號分子和EPS的變化特性,探討AGS的形成機理,以期為AGS的快速培養(yǎng)和穩(wěn)定運行提供思路.

1 材料與方法

1.1 試驗裝置

試驗反應裝置采用有機玻璃制成的圓柱形SBR,高100cm,內徑8cm,有效容積約為4L.反應器底部有曝氣系統(tǒng),曝氣量大小由轉子流量計控制,充氧期間控制曝氣量在2L/min,為污泥提供充足的溶解氧和剪切力.運行周期4h,其中進水60min、曝氣時間由145min逐漸增加到170min,沉降時間由30min逐漸降低到5min.污泥泥齡20d,排水比60%.

1.2 接種污泥與進水水質

接種污泥取自無錫市某污水處理廠好氧池活性污泥(AS),外表呈黑褐色,較為松散.反應器進水采用人工配水,以CH3COONa為碳源,NH4Cl為氮源, K2HPO4為磷源,進水中COD、NH4+-N、PO43--P濃度分別為600,60和16mg/L.此外,添加KH2PO4、KCl、MgSO4·7H2O和微量元素等物質,以保證細菌正常的生長代謝活動.

1.3 分析方法

1.3.1 常規(guī)指標分析 COD、NH4+-N、NO3--N、PO43--P、MLSS和MLVSS指標測定方法均參照《水與廢水監(jiān)測分析方法》(第四版)[15].污泥形態(tài)變化通過OLYMPUS CX41型(Olympus,Japan)顯微鏡觀察.

1.3.2 EPS的測定 EPS的提取采用NaOH法[16],首先將10mL待測樣品置于50mL離心管中,超聲解體,分別在2000,5000,10000r/min的轉速下離心15min,收集上清液,即為溶解型胞外聚合物(SMP- EPS)、附著型胞外聚合物(LB-EPS)和緊密結合型胞外聚合物(TB-EPS).用考馬斯亮藍法和蒽酮-硫酸比色法對每層EPS中的蛋白質和多糖含量進行測定.

1.3.3 磷酸二酯酶(PDE)活性的測定[17]由于PDE可分解對硝基苯磷酸鹽為對硝基苯酚,故PDE的活性采用對硝基苯磷酸鹽法測定.操作步驟如下:稱取1g抽濾后污泥于50mL三角瓶,加入0.2mL甲苯(C7H8)、4mL三(羥甲基)氨基甲烷緩沖液(THAM緩沖液,pH=8.0)和1mL對硝基苯磷酸鈉,在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1h,取出后加入1mL濃度為0.5mol/L 的CaCl2溶液和4mL三(羥甲基)氨基甲烷-NaOH浸提劑(THAM-NaOH),0.45μm濾紙過濾,在410nm處比色.根據標準曲線計算溶液中對硝基苯酚含量,再根據公式(1)計算對硝基苯酚的單位時間產量,根據其產量來估計PDE活性:

式中:為對硝基苯酚的單位時間產量, mg/(kg×h);1為樣品中產生的對硝基苯酚質量, mg;2為所取待測樣品質量, g;為待測樣品的含水率.

1.3.4 第二信使的測定[18]取凍干后的污泥0.2g溶于15mL超純水,加入15mL溶菌酶(1mg/mL)使細胞溶解,震蕩均勻后于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1h;取出置于4℃、轉速為9000r/min離心機中離心15min,上清液轉移至離心管中.然后加2倍無水乙醇,震蕩幾秒后置于4℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1h;再將樣品置于4℃、9000r/min離心機中離心15min,倒掉上清液,將沉淀物放置在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3h,加入3mL超純水均勻震蕩.將混合液移至5mL離心管中,在12000r/min轉速下離心10min,最后取1mL上清液,通過Waters 1525EF高效液相色譜(Waters,USA)進行定量分析.

1.3.5 激光共聚焦掃描顯微鏡(CLSM)分析[4]將相同濃度的接種污泥和AGS搗碎,分別用核酸染料Syto 63(20mol/L, Sigma)、核酸染料Sytox Blue (25mol/L, Sigma)、異硫氰酸熒光素FITC(10g/L, Sigma)和伴刀豆凝集素Con A (0.2g/L,Sigma)對污泥中的總細胞、死細胞、蛋白質和α-多糖染色,樣品置于TCS SP8激光共聚焦顯微鏡(Leica,Germany)下觀察各物質變化.

2 結果與討論

2.1 污泥形態(tài)變化和污染物去除特性

2.1.1 污泥形態(tài)和生物量變化 在AGS培養(yǎng)過程中,根據反應器運行情況和污泥特性不斷縮短沉降時間.運行前40d,沉降時間由最初的30min逐漸縮短到5min,最終在5min穩(wěn)定運行.絮狀污泥顆?；^程中,污泥形態(tài)變化如圖1所示,接種污泥(0d)為黑褐色,呈流質狀態(tài),微生物比較分散;40d時污泥中絲狀菌相互纏繞,形成菌膠團,構成了AGS骨架,為絮狀污泥顆?；於ɑA;運行到60d時,由于EPS的大量合成和污泥濃度提高,反應器中出現較小不規(guī)則的AGS;80d時顆粒污泥在高剪切力作用下進一步規(guī)則化,形成橢圓的成熟AGS.在此過程中,生物量變化如圖2所示.

圖1 顆粒化過程中污泥形態(tài)變化

圖2 顆?；^程中生物量的變化

接種污泥濃度為3865mg/L,反應器運行前40d,將沉降時間按照30,20,10和5min的順序每隔10d依次降低.從圖2中發(fā)現,前40d污泥濃度不斷降低,一方面原因在于微生物對接種環(huán)境適應性較差,另一方面則是由于較短的沉降時間使沉降性能較差的污泥被排除在SBR之外.在SBR運行至第40d時污泥濃度達到最低2943mg/L.反應器在5min穩(wěn)定運行后,污泥濃度開始增長,60d左右形成小顆粒污泥,此時污泥濃度為4021mg/L.80d時形成成熟的AGS,污泥濃度達到5400mg/L.之后AGS反應器穩(wěn)定運行,污泥濃度不再發(fā)生變化.

2.1.2 污染物去除特性 絮狀污泥顆粒化過程中反應器進出水COD變化如圖3a所示,進水COD濃度在600mg/L左右,反應器運行初期,大部分異養(yǎng)細菌對高C/N的環(huán)境不適應導致微生物活性降低,對COD的去除率只有72%.隨著環(huán)境適應性的提高和生物活性的恢復,COD去除率逐漸升高至80%.當AGS形成后,微生物對碳源的利用率可達到92%,與活性污泥相比提高20%,出水COD約40mg/L. NH4+-N變化如圖3b所示,進水NH4+-N的濃度在60mg/L左右,接種污泥對NH4+-N去除率約為57%,反應器在沉降時間為5min穩(wěn)定運行時,去除率升高到80%,推測是由于反應器內較高的溶解氧(DO: 7~9mg/L)提高了硝化細菌活性,對NH4+-N的去除率上升.成熟的AGS形成之后,污泥濃度增加到5400mg/L,對NH4+-N去除率達到93%,硝化速率為4.47mgN/(gVSS×h),與接種污泥的硝化速率相比,AGS的硝化能力提高了36%.NO3?-N和NO2?-N變化如圖3c所示,在AGS培養(yǎng)過程中, NO2?-N幾乎不存在,說明反應器中的污泥運行狀況較好,實現完全硝化.而初始階段反應器內NO3?-N含量較高,分析可能是由于反硝化細菌對環(huán)境敏感,且在污泥培養(yǎng)初期,污泥濃度降低,導致反硝化菌數量減少、活性下降,從而影響整體的反硝化能力.隨著AGS的形成和污泥濃度的提高,反硝化細菌大量生長,活性隨之提高,反硝化速率由接種污泥的4.11mgN/(gVSS×h)升高至AGS的6.73mgN/(gVSS×h),最終出水中NO3?-N含量在1mg/L左右. PO43--P變化如圖3d所示,接種污泥長期受到除磷藥劑的影響導致在反應器運行前期對PO43--P去除效率僅為28%,反應器運行60d左右出現較小的AGS,其中含有大量的聚磷菌,除磷效率得到一定提升.隨著AGS的成熟,微生物更加適應反應器運行環(huán)境,進一步促進了聚磷菌生長,PO43--P的去除率穩(wěn)定在85%,與活性污泥相比提高了57%,釋磷速率由接種污泥的2.69mgP/ (gVSS×h)升高到AGS的5.27mgP/(gVSS×h).

2.2 EPS的變化

EPS是一種特殊的高分子化合物,具有生物凝膠特性,為微生物聚集提供物質基礎,可促進微生物聚集體的構建,是絮狀污泥到AGS的過渡橋梁,在絮狀污泥顆?；^程中發(fā)揮重要作用[19-20].如圖4a所示,在顆?；^程中,EPS呈現明顯遞增趨勢,由接種污泥的90mg/gMLVSS增加到AGS的260mg/ gMLVSS,其中蛋白質的增長最為顯著,由77mg/ gMLVSS增加到193mg/gMLVSS.細胞的疏水性和表面電荷的降低是微生物固定化的關鍵[21],而蛋白質結構中的氨基酸具有疏水性,推測其會降低細胞表面的靜電斥力和吉普斯自由能,增強微生物間的粘附力,促進AGS的形成[20-22].如圖4b所示, TB- EPS中蛋白質增幅較大,由接種污泥的53mg/ gMLVSS增加到AGS的163mg/gMLVSS.有文獻[22-23]指出,TB-EPS中存在大量絡氨酸蛋白、天冬氨酸蛋白以及α螺旋和β折疊蛋白,這些蛋白質的存在是污泥顆?；年P鍵.SMP-EPS和LB-EPS中蛋白質增幅較小,因此TB-EPS中蛋白質含量的增加可能是AGS形成的重要因素.

EPS中多糖濃度增幅較小,由12mg/gMLVSS增加到43mg/gMLVSS.文獻指出[1],多糖中主要含有α和β兩種功能性多糖,其中β-多糖主要分布在污泥內部,為絮狀污泥顆?；峁┨脊羌芙Y構,促進菌膠團形成[1,24];α-多糖主要分布在污泥外部,多糖中的羧基是親水性物質,會吸附水中的微小顆粒和懸浮物,具有吸附架橋作用,可促進AGS的形成.總體而言,多糖總量變化較小,以TB-EPS層增加為主(圖4c).

PN/PS(蛋白質/多糖)是AGS結構穩(wěn)定的重要指標.Xie等[25]發(fā)現,PN/PS 值升高可減小細菌與水分子之間的結合力,促進菌膠團的形成,縮短污泥顆?；M程.接種污泥的PN/PS為6.2,在環(huán)境適應階段下降到4.7,主要與污泥濃度降低和曝氣量高、剪切力較大有關;隨著污泥濃度上升,大量蛋白質和多糖被合成,PN/PS值上升到6.1;60d左右AGS初步形成,多糖和蛋白質含量達到最大值, PN/PS也增加到7.6;隨著AGS的進一步成熟,蛋白質和多糖都出現小幅度下降,但PN/PS值變化較小,維持在7.4左右,略高于接種污泥,表明AGS結構已趨于穩(wěn)定.在絮狀污泥顆?；捌?胞外蛋白質和多糖含量都增加.在AGS進一步成熟階段, EPS含量略有降低,主要是因為AGS形成后,其骨架結構和粒徑已比較穩(wěn)定,EPS含量維持在240mg/g MLVSS左右,且AGS中PN/PS值略高于接種污泥.

2.3 AGS特征物質分布

通過CLSM手段對接種污泥和AGS中總細胞、死細胞和蛋白質、α-多糖進行空間表征.結果如圖5所示,在相同污泥濃度下,AGS中蛋白質含量明顯高于接種污泥,這與圖4中的結果相符.蛋白質可通過靜電作用與水中陽離子結合,降低細胞表面電荷,促進微生物聚集,為絮狀污泥顆粒化奠定基礎[21].同時,胞外蛋白質可作為碳源被AGS內部微生物利用,這對于維持AGS的穩(wěn)定結構具有重要意義[26].α-多糖量低于接種污泥,與廖青等[20]研究結果存在差異,推測可能是因為AGS粒徑較大,位于污泥內部的α-多糖沒有被完全染色.從細胞的角度比較發(fā)現,AGS中總細胞數量較高,死細胞數量較低,與2.1中AGS成熟后污泥濃度升高和污染物去除率上升具有良好對應關系.

圖5 接種污泥(a~c)和好氧顆粒污泥(d~f)中各組分分布變化

總細胞(紅色)、死細胞(藍色)、多糖(橙色)和蛋白質(綠色)、a和d:合成圖像

2.4 信號分子和PDE酶的變化

信號分子c-di-GMP和PDE酶的變化如圖6a所示,在反應器運行初期(前 40d),PDE的活性和c- di-GMP 含量整體呈上升趨勢,SBR運行至第40d, PDE活性上升到65mg/(kg×h),c-di-GMP含量達到341μg/gVSS,這可能是因為當時反應器中污泥濃度較低,為防止污泥因沉降性能較差而被沖出反應器,進一步使污泥濃度降低,大量第二信使被合成以指導EPS分泌,但為維持細胞滲透壓穩(wěn)定和胞內第二信使平衡,PDE酶活性逐步提高,用以分解過量合成的第二信使,保證顆?；M程穩(wěn)定有序進行[27-29].雖然第二信使被PDE酶部分分解,但與接種污泥相比c-di-GMP含量仍然是增加的.AGS形成以后,PDE酶的活性變化較小,維持在50mg/(kg×h),略高于接種污泥,說明AGS中第二信使的合成量比較高.c-di- GMP含量穩(wěn)定在453μg/gVSS,明顯高于接種污泥,說明較高濃度的c-di-GMP是維持AGS結構穩(wěn)定與污染物高效去除的關鍵因素.

如圖6b所示,接種污泥中PDE/c-di-GMP值為0.27,在10d左右升高到0.5,這可能是因為接種污泥前期不適應反應器環(huán)境,大量污泥隨出水排出,污泥濃度降低,微生物通過群體感應現象啟動特征基因編碼[4],促進c-di-GMP分泌以提高污泥沉降性能,但為了使微生物能夠穩(wěn)定、有序聚集,PDE酶活性也同步升高.隨后該比值一直降低,成熟的AGS形成之后PDE/c-di-GMP穩(wěn)定在0.11,低于接種污泥,表明AGS中c-di-GMP合成量較高,為AGS發(fā)揮穩(wěn)定功能奠定基礎.

2.5 信號分子與蛋白質和多糖的相關性分析

Whiteley等[6]研究發(fā)現,c-di-GMP會促進蛋白質和多糖的合成,如圖7a所示,EPS中蛋白質、多糖和c-di-GMP的變化趨勢基本一致.其中蛋白質與c-di-GMP在接種污泥中的含量比較低,55d左右達到最高,隨著AGS的成熟,2者的含量都略有降低.與2者變化不同的是,多糖在AGS成熟階段濃度不再明顯變化.通過SPSS軟件對3者關系進行相關性分析,結果如圖7b、7c所示,在AGS形成過程中c-di- GMP與EPS中蛋白質的相關性系數2=0.92871,顯著性水平=0.0042,表明信號分子是影響蛋白質合成的極顯著因素;c-di-GMP與多糖的相關性系數2=0.83506,顯著性水平=0.015,表明信號分子是影響多糖合成的顯著因素.由于TB-EPS中蛋白質和多糖的變化最為明顯,又對信號分子和TB-EPS中的蛋白質和多糖進行相關性分析,結果如圖7d、7e所示,在污泥顆?；^程中c-di-GMP與TB-EPS中蛋白質相關性系數2=0.89025,顯著性水平= 0.0113,說明信號分子是影響TB-EPS層蛋白質含量的顯著因素;c-di-GMP與TB-EPS中多糖的相關性系數2=0.82913,顯著性水平=0.0214,說明信號分子與TB-EPS中多糖含量具有顯著相關性,但相關性程度略低于信號分子與TB-EPS中蛋白質的相關性程度.推測第二信使c-di-GMP是通過指導蛋白質(尤其是TB-EPS中蛋白質)的合成來促進絮狀污泥顆?；M程的.

3 結論

3.1 絮狀污泥顆?；^程中,污泥形態(tài)由最初的絮體形態(tài)變成光滑緊密的顆粒態(tài),污泥濃度呈現先降低后增高的趨勢,成熟AGS對COD、NH4+-N和PO43--P去除率分別提高到92%、93%和85%.

3.2 隨著AGS的形成,EPS含量明顯提高,以TB-EPS層蛋白質增加為主,多糖含量相對增加, PN/PS值由接種污泥的6.2增加到AGS中的7.4.

3.3 第二信使c-di-GMP與EPS中蛋白質相關系數2=0.92871,呈現極顯著相關性;與TB-EPS中的蛋白質相關系數2=0.89025,呈顯著相關性.

3.4 與接種污泥相比,AGS中PDE酶活性和信號分子c-di-GMP含量都明顯提高,PDE/c-di-GMP值降低,表明AGS中c-di-GMP合成量較高.

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Characteristics of signal molecules in the formation of aerobic granular sludge.

WANG Yu-ying1, ZHI Li-ling1, MA Xin-xin1, WANG Shuo1,2, LI Ji1,2*

(1.Jiangsu Key Laboratory of Anaerobic Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China；2.Collaborative Innovation Center of Water Treatment Technology and Material of Jiangsu Colleges, Jiangnan University, Suzhou 215009, China)., 2019,39(4)：1516~1524

The correlation analysis based on the physical and chemical properties of sludge, the removal efficiency of pollutants, the variation of extracellular polymeric substances (EPS) and signal molecules during the granulation process were carried out. It was notable that the contaminants removal efficiency was significantly improved.Compared with activated sludge, the removal rates of COD, NH4+-N and PO43--P increased by factors of 20%, 36% and 57% in mature aerobic granular sludge. The extracellular protein (PN) and polysaccharide (PS) content increased by 116 and 31mg/gMLVSS, respectively. On the basis of laser confocal scanning microscopy (CLSM) analysis, it was remarkable that the protein from EPS increased significantly, which indicated that the protein may play an important role in the granulation process. The activity of phosphodiesterase showed an upward trend, and the second messenger cyclic diguanylic (c-di-GMP) content increased during formation and decreased when AGS became mature, which was consistent with the variation of protein and polysaccharide in EPS. Moreover, according to the SPSS analysis, c-di-GMP has a significantly positive correlation with proteins in Tightly Bound-EPS (TB-EPS). It was speculated that c-di-GMP may accelerate the formation of aerobic granular sludge by regulating the biosynthesis of proteins in TB-EPS.

aerobic granular sludge；extracellular polymeric substances (EPS)；protein and polysaccharide；c-di-GMP；phosphodiesterase

X522

A

1000-6923(2019)04-1516-09

2018-09-03

國家水體污染控制與治理科技重大專項(2017ZX07202001- 004,2017ZX07202001-005);國家自然科學基金資助項目(51408264)

*責任作者, 教授, liji@jiangnan.edu.cn

王玉瑩(1993-),女,山東濟南人,江南大學碩士研究生,主要研究方向為好氧顆粒污泥形成機理解析.發(fā)表論文1篇.