鎖陽原花青素對葡萄糖/甘氨酸模擬體系糖基化終產(chǎn)物的抑制效果

張喜峰，徐 瑩，尚 琪，馬銀山，陳雨迪，羅光宏

1河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院；2甘肅省河西走廊特色資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，張掖 734000；3渭南市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，渭南 714000；4河西學(xué)院凱源生物技術(shù)開發(fā)中心，張掖 734000

晚期糖基化終末產(chǎn)物 (advanced glycation end products，AGEs)是指核酸、脂肪酸、蛋白質(zhì)或氨基酸的氨基與還原糖的醛基之間發(fā)生重排、脫水、氧化、縮合等一系列非酶促性反應(yīng) (又稱 Maillard反應(yīng))，最終形成具有活性的不可逆化合物[1]。在食品加工、加熱和貯藏過程中，Maillard反應(yīng)可以提高食品風(fēng)味和色澤；然而，含AGEs食物的過量攝入和機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生過量的AGEs均會(huì)導(dǎo)致多種慢性疾病，如糖尿病[2]、腎臟疾病[3]、阿爾茨海默病(AD)[4]、衰老等[5]。

近年來，抗糖基化一直被認(rèn)為是一種有效的策略來減緩人的衰老和疾病的發(fā)生。糖基化的抑制作用可以抑制炎性激活，減少炎癥反應(yīng)[6,7]。國內(nèi)外學(xué)者普遍認(rèn)為[8-10]，抗氧化劑對AGEs的生成具有良好的抑制效果；另外，食物中的成分、加工方式、加熱溫度、加熱時(shí)間等均可影響AGEs的形成[11]。原花青素(proanthocyanidins，PC)是植物中廣泛存在的一大類多酚化合物的總稱，其抗糖基化、抗氧化和抗炎癥的能力已被廣泛研究[12]。

鎖陽(CynomoriumsongaricumRupr.)，為鎖陽科、鎖陽屬多年生肉質(zhì)寄生草本，國內(nèi)主要分布于新疆、甘肅、內(nèi)蒙、寧夏等地；國內(nèi)外研究學(xué)者主要對鎖陽中多糖、皂苷、黃酮、原花青素等活性成分及其生物學(xué)活性進(jìn)行了一系列研究[13-16]；鎖陽原花青素研究主要集中于單體分離和動(dòng)物相關(guān)試驗(yàn)，其作為AGEs抑制劑在食品加工應(yīng)用中的相關(guān)報(bào)道較少。目前，已有其他類型原花青素提取物對模擬體系中AGEs抑制作用的相關(guān)報(bào)道，如黎超等人[17]研究表明肉桂原花青素對高級糖基化終產(chǎn)物抑制活性高于陽性對照；吳茜等[18]研究表明一定濃度范圍內(nèi)蓮原花青素對乳糖-賴氨酸體系中晚期糖基化終產(chǎn)物具有一定抑制作用；荔枝皮原花青素在不同模擬體系中均對美拉德反應(yīng)和晚期糖基化終末產(chǎn)物具有良好的抑制效果[19]。

因此，本試驗(yàn)將原花青素加入可產(chǎn)生甜香型風(fēng)味物質(zhì)葡萄糖/甘氨酸模擬體系，研究其對模擬體系發(fā)生Maillard反應(yīng)抑制效果，分別研究不同溫度、反應(yīng)時(shí)間、金屬離子種類和濃度等參數(shù)，分析鎖陽原花青素對體系中形成AGEs的抑制效果，為天然活性成分深度開發(fā)和在食品加工領(lǐng)域的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

鎖陽(CynomoriumsongaricumRupr)由甘肅微藻工程技術(shù)研究中心提供。

Ca2+、Zn2+、Fe2+、Mg2+、Cu2+、Al3+標(biāo)準(zhǔn)溶液及兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品購自成都德思特生物技術(shù)有限公司；L-甘氨酸、α-D-葡萄糖購于上海源葉生物科技有限公司；其它試劑均為分析純，購自北京索萊寶科技有限公司。

AE124電子天平，上海恒平科學(xué)儀器有限公司；JPT-10型架盤天平，常熟市衡器廠；DD-5M立式大容量離心機(jī)，湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司；XO-SM50超聲波微波組合反應(yīng)系統(tǒng)，南京先歐生物科技有限公司；JRA-6數(shù)顯磁力攪拌水浴鍋，金壇市杰瑞爾電器有限公司；F-7000熒光分光光度計(jì)，日立高新技術(shù)公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 鎖陽原花青素的制備

稱取一定量的鎖陽粉末，按照料液比1∶8 (g/mL)加入體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇，在40 ℃水浴攪拌30 min，在功率為100 W條件下，超聲處理10 min；4 000 rpm離心10 min后，收集上清液；將離心后殘?jiān)凑丈鲜霾襟E重復(fù)提取1次后，上清液經(jīng)減壓濃縮后，采用大孔樹脂XAD-7分離純化，采用體積分?jǐn)?shù)為60%乙醇洗脫、濃縮、冷凍干燥后，得鎖陽原花青素提取物，經(jīng)香草醛-濃鹽酸法測其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為90%以上。

1.2.2 不同反應(yīng)時(shí)間下，鎖陽原花青素對葡萄糖/甘氨酸模擬體系中AGEs抑制作用的影響

參考夏秋琴之法[20]，略作改動(dòng)；在葡萄糖/甘氨酸模擬體系中，加入質(zhì)量濃度為1 mg/mL的鎖陽原花青素1 mL，充分混勻。在溫度為80 ℃條件下分別加熱反應(yīng)15、30、45、60、75、90、105 min；在溫度為100 ℃條件下分別加熱反應(yīng)4、6、10、15、20、30、60 min。反應(yīng)結(jié)束后，在λex/λem=370 nm/440 nm測定不同反應(yīng)時(shí)間下的熒光值，確定最佳的反應(yīng)時(shí)間。

1.2.3 不同濃度的鎖陽原花青素對甘氨酸/葡萄糖模擬體系中AGEs的抑制作用的影響

實(shí)驗(yàn)參考Zha等[21]方法并略作修改；在葡萄糖/甘氨酸模擬體系中，在溫度為80 ℃條件下，分別加入濃度為0.025、0.05、0.15、0.3、0.5、1.0 mg/mL原花青素各1 mL；溫度為100 ℃條件下，分別加入質(zhì)量濃度為0.05、0.15、0.3、0.5、1.0 mg/mL原花青素各1 mL；根據(jù)1.2.2部分確定的最佳反應(yīng)時(shí)間，反應(yīng)結(jié)束后，在λex/λem=370 nm/440 nm測定其熒光值，對照組和空白組的設(shè)置同1.2.2。

1.2.4 金屬離子對鎖陽原花青素抑制葡萄糖/甘氨酸模擬體系A(chǔ)GEs的影響

將Ca2+、Cu2+、Fe2+、Mg2+、Zn2+標(biāo)準(zhǔn)溶液均稀釋為50.0、10.0、1.0、0.1 mg/L四個(gè)梯度；配制10.0、1.0、0.1 mg/L的Al3+溶液。在葡萄糖/甘氨酸模擬體系中，取不同種類、不同濃度的金屬離子溶液各0.5 mL，鎖陽原花青素提取液0.5 mL，加入pH為7.4的磷酸鹽緩沖液補(bǔ)足至5 mL。在λex/λem=370 nm/440 nm測定其熒光值，研究不同種類、不同濃度金屬離子對原花青素抑制甘氨酸/葡萄糖模擬體系A(chǔ)GEs的影響。

圖1 不同溫度、不同反應(yīng)時(shí)間下鎖陽中的原花青素對AGEs的抑制效果Fig.1 The inhibition effects of the formation of AGEs at different temperature levels

1.2.5 相對抑制率的計(jì)算

依據(jù)上述步驟測定不同條件下熒光值，按以下公式計(jì)算鎖陽原花青素對葡萄糖/甘氨酸模擬體系A(chǔ)GEs相對抑制率。

F樣品為加入鎖陽原花青素提取液而且加熱的反應(yīng)液的熒光值；

F對照為不添加原花青素但加熱的模擬體系的熒光值；

F空白為不添加原花青素也不加熱的模擬體系的熒光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同反應(yīng)時(shí)間下鎖陽中的原花青素對葡萄糖/甘氨酸模擬體系A(chǔ)GEs的抑制效果

由圖1A可知，將鎖陽原花青素加入葡萄糖/甘氨酸模擬體系中，在80 ℃下反應(yīng)不同時(shí)間后，原花青素對該體系產(chǎn)生AGEs具有一定的抑制效果；其隨著加熱反應(yīng)時(shí)間的不斷延長，相對抑制率逐漸增加，當(dāng)加熱反應(yīng)時(shí)間為75 min時(shí)，達(dá)到最大值(85.73%±1.57%)；且與其它反應(yīng)時(shí)間相比，差異顯著(P<0.05)；當(dāng)反應(yīng)時(shí)間超過75 min后，抑制率呈現(xiàn)下降趨勢；原因可能是加熱時(shí)間過長時(shí)，影響原花青素的穩(wěn)定性，導(dǎo)致其發(fā)生降解；

從圖1B可看出，在100 ℃加熱反應(yīng)條件下，鎖陽原花青素對該體系A(chǔ)GEs抑制作用隨反應(yīng)時(shí)間延長呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢；當(dāng)加熱反應(yīng)30 min時(shí)，相對抑制率達(dá)到最大值，為74.01%±1.45%；且差異顯著(P<0.05)；當(dāng)反應(yīng)時(shí)間大于30 min后，相對抑制率逐漸下降，可能是由于溫度較高，原花青素較長時(shí)間加熱促使其熱降解速度加快。

圖2 不同溫度、不同濃度的鎖陽原花青素對AGEs的抑制效果Fig.2 The inhibition effects of the formation of AGEs at different concentrations

2.2 不同濃度鎖陽原花青素對葡萄糖/甘氨酸模擬體系中AGEs的抑制效果

由圖2A可知，在80 ℃的反應(yīng)條件下，當(dāng)鎖陽原花青素質(zhì)量濃度為0.025～0.5mg/mL時(shí)，其對模擬體系中產(chǎn)生AGEs的相對抑制率也不斷增加，當(dāng)其原花青素濃度繼續(xù)增加為1.0 mg/mL時(shí)，抑制率可達(dá)到最大值，且與其它濃度下對AGEs相對抑制差異顯著(P<0.05)；原因可能是在較低濃度原花青素對模擬體系中AGEs的利用效果較好。

在100 ℃的反應(yīng)條件下，隨著鎖陽原花青素質(zhì)量濃度逐漸增加，其對體系中AGEs抑制效果呈現(xiàn)先增加后逐漸趨于穩(wěn)定的趨勢，可能是原花青素對體系中AGEs抑制效果趨于飽和；在高溫環(huán)境中，受原花青素穩(wěn)定性的影響，其結(jié)構(gòu)可能受到破壞，影響其抑制效果。

2.3 金屬離子對鎖陽原花青素抑制AGEs的影響

2.3.1 Al3+對鎖陽原花青素抑制AGEs的影響

表1 不同溫度下Al3+和鎖陽原花青素對AGEs的抑制效果

注：小寫字母不同表示顯著性差異(P<0.05)，以下同。

Note:The different letters on the same list mean significant difference (P<0.05),the same as in the following tables.

從表1 Al3+組可以看出，反應(yīng)溫度為80 ℃，Al3+的質(zhì)量濃度為0.1和1.0 mg/L，均可促進(jìn)甘氨酸/葡萄糖模擬體系A(chǔ)GEs的形成，二者間具有顯著性差異；相反，在100 ℃時(shí)條件，不同濃度的Al3+對AGEs的形成均表現(xiàn)一定的抑制作用，均呈現(xiàn)顯著性差異；當(dāng)Al3+質(zhì)量濃度為10.0 mg/L時(shí)，在不同溫度的反應(yīng)條件下，均對AGEs形成具有抑制效果。

從Al3++原花青素組可以看出，不同濃度的Al3+在不同溫度的反應(yīng)條件下都對AGEs的生成具有抑制作用，均呈現(xiàn)顯著性差異。在80 ℃下Al3+的質(zhì)量濃度為10.0 mg/L時(shí)抑制率可達(dá)到62.84%±1.95%；在100 ℃時(shí)，Al3+不存在時(shí)鎖陽原花青素對生成AGEs的抑制率達(dá)到最大值(70.87%±3.71%)。結(jié)果表明，在不同濃度的Al3+單獨(dú)存在時(shí)，對葡萄糖/甘氨酸模擬體系中AGEs的生成既有促進(jìn)也有抑制作用，而在Al3+和鎖陽原花青素共同作用時(shí)，在不同濃度，不同反應(yīng)溫度的條件下，均表現(xiàn)對AGEs的形成起抑制作用。

2.3.2 Cu2+對鎖陽原花青素抑制AGEs的影響

表3 不同溫度下Cu2+和鎖陽原花青素對AGEs的抑制效果

由表2 Cu2+組可知，在80 ℃的條件下Cu2+的質(zhì)量濃度為0.1和1.0 mg/L時(shí)，其對AGEs的生成有促進(jìn)作用；且0.1 mg/L Cu2+的促進(jìn)效果較強(qiáng)。在100 ℃時(shí)不同濃度的Cu2+對AGEs的生成均有抑制作用，且抑制效果差異顯著(P<0.05)。質(zhì)量濃度為10.0、50.0 mg/L時(shí)，80 ℃和100 ℃條件下對AGEs的生成均表現(xiàn)為抑制作用。在80 ℃時(shí)Cu2+可達(dá)到的最高抑制率為20.62%±2.59%，在100 ℃時(shí)為29.76%±3.46%。

從Cu2++原花青素組可以看出，加入不同濃度的Cu2+，在不同溫度的反應(yīng)條件下鎖陽原花青素對AGEs的生成均有抑制作用，均呈現(xiàn)顯著性差異。不同濃度的Cu2+存在時(shí)，鎖陽原花青素對體系中AGEs的形成的抑制效果均比Cu2+不存在時(shí)的抑制效果小，且差異顯著。在80、100 ℃下，Cu2+存在時(shí)鎖陽原花青素對體系中形成的AGEs抑制率分別為53.71%±2.84%和70.87%±3.09%；結(jié)果表明，在不同濃度的Cu2+單獨(dú)存在時(shí)，其對體系中AGEs的生成既有促進(jìn)也有抑制作用，而在Cu2+和鎖陽原花青素共同反應(yīng)時(shí)，在不同濃度，不同溫度的反應(yīng)條件下，對AGEs的生成均表現(xiàn)為顯著性抑制效果。

2.3.3 Fe2+對鎖陽原花青素抑制AGEs的影響

表3 不同溫度下Fe2+和鎖陽原花青素對AGEs的抑制效果

從表3 Fe2+組可以看出，不同質(zhì)量濃度下Fe2+在80 ℃和100 ℃時(shí)，均對體系中AGEs的生成具有顯著性促進(jìn)作用。

從Fe2++原花青素組可以看出，在不同溫度的反應(yīng)條件下，不同濃度的Fe2+存在時(shí)，鎖陽原花青素對體系中AGEs的生成具有顯著性抑制作用。在80 ℃反應(yīng)條件下，F(xiàn)e2+的質(zhì)量濃度為50.0 mg/L時(shí)，對AGEs生成的最大抑制率為45.59%±2.86%，在100 ℃，F(xiàn)e2+不存在時(shí)，抑制率最大為66.65%±2.86%。結(jié)果表明，不同濃度的Fe2+單獨(dú)存在時(shí)，對AGEs的生成具有促進(jìn)作用；在不同濃度，不同溫度的反應(yīng)條件下，F(xiàn)e2+存在時(shí)，鎖陽原花青素對AGEs的生成具有抑制作用。

2.3.4 Mg2+對鎖陽原花青素抑制AGEs的影響

表4 不同溫度下Mg2+和鎖陽原花青素對AGEs的抑制效果

從表8 Mg2+組可以看出，Mg2+濃度為0.1和50 mg/L時(shí)，80 ℃和100 ℃對AGEs的生成都有促進(jìn)作用，100 ℃時(shí)質(zhì)量濃度為50 mg/L的Mg2+促進(jìn)效果最好；1.0和10 mg/L的Mg2+對AGEs的生成有抑制作用，在100 ℃時(shí)1.0 mg/L的Mg2+抑制效果最好，為33.87±3.01%，且差異顯著。

在Mg2++原花青素組可以看出，在80 ℃的反應(yīng)條件下添加1.0、10.0、50.0 mg/L Mg2+時(shí)，鎖陽原花青素對AGEs的抑制作用和無Mg2+時(shí)相比，差異顯著；Mg2+不存在與加入0.1和50.0 mg/L的Mg2+存在相比，其對模擬體系利于AGEs的形成，轉(zhuǎn)變?yōu)閷GEs的抑制作用，效果顯著。在80 ℃下50.0 mg/L的 Mg2+的抑制率為31.78±2.41%，在100 ℃時(shí)10.0 mg/L Mg2+的抑制率最高達(dá)到73.48±3.49%。結(jié)果表明，Mg2+存在條件下，其對模擬體系中AGEs的形成，同時(shí)兼有促進(jìn)和抑制兩種作用；然而，原花青素的加入，使其由上述兩種作用轉(zhuǎn)變?yōu)閮H有的抑制作用。

2.3.5 Ca2+對鎖陽原花青素抑制AGEs的影響

表5 不同溫度下Ca2+和鎖陽原花青素對AGEs的抑制效果

從表5 Ca2+組可以看出，在80 ℃反應(yīng)條件下，質(zhì)量濃度為0.1、1.0和10.0 mg/L Ca2+對模擬體系產(chǎn)生的AGEs具有抑制作用；10.0 mg/L的Ca2的存在時(shí)，具有較好的抑制效果；在100 ℃反應(yīng)條件下，1.0和10.0 mg/L的Ca2+可以抑制體系中AGEs的形成；當(dāng)50.0 mg/L Ca2+單獨(dú)存在時(shí)，其對體系中AGEs形成具有促進(jìn)作用。

從Ca2++原花青素組可知，在Ca2+存在下，鎖陽原花青素對模擬體系中AGEs的抑制效果與無Ca2+存在時(shí)均呈現(xiàn)抑制作用；在80 ℃無Ca2+存在時(shí)，抑制率達(dá)到62.08%±1.71%；100 ℃條件下Ca2+的質(zhì)量濃度為50.0 mg/L時(shí)抑制率達(dá)到75.31%±1.77%。結(jié)果表明，在Ca2+存在下，其對模擬體系中AGEs的生成表現(xiàn)為促進(jìn)和抑制兩種作用，當(dāng)鎖陽原花青素加入后，可消除促進(jìn)作用，從而表現(xiàn)為抑制作用。

2.3.6 Zn2+對鎖陽原花青素抑制AGEs的影響

表6 不同溫度下Zn2+和鎖陽原花青素對AGEs的抑制效果

從表6 Zn2+組可以看出，在100 ℃反應(yīng)條件下Zn2+的質(zhì)量濃度為0.1和50.0 mg/L時(shí)，對模擬體系生成的AGEs表現(xiàn)促進(jìn)作用，且0.1 mg/L的Zn2+的促進(jìn)效果良好；其他均呈現(xiàn)抑制作用；在80 ℃條件下Zn2+濃度為50.0 mg/L時(shí)抑制率為29.87%±1.64%，100 ℃時(shí)10.0 mg/L的Zn2+達(dá)到41.94±2.57%。

在Zn2++原花青素組中，除100 ℃時(shí)0.1 mg/L的Zn2+外，其他不同水平的Zn2+存在時(shí)，鎖陽原花青素對生成AGEs的抑制率均低于無Zn2+存在時(shí)的抑制率。在80、100 ℃條件下無Zn2+存在時(shí)，原花青素對AGEs的抑制率分別為62.41%±1.54%和72.89%±3.24%。結(jié)果表明，不同質(zhì)量濃度的Zn2+對葡萄糖/甘氨酸模擬體系產(chǎn)生的AGEs兼有促進(jìn)和抑制作用，鎖陽原花青素加入后，消除了原來的促進(jìn)作用，使其之后全部變?yōu)橐种谱饔谩?/p>

3 結(jié)論

鎖陽原花青素對葡萄糖/甘氨酸模擬體系中AGEs的產(chǎn)生具有一定的抑制效果：在80 ℃時(shí)，原花青素對模擬體系中AGEs相對抑制率會(huì)隨著反應(yīng)時(shí)間的延長呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為75 min時(shí)，達(dá)到最大值85.73%±1.57%；在100 ℃條件下，加熱反應(yīng)時(shí)間為30 min時(shí)，達(dá)到最大值為74.01%±1.45%。

80 ℃反應(yīng)條件下，隨著鎖陽原花青素質(zhì)量濃度的增加對AGEs的抑制率也不斷增加，增長趨勢較為緩慢，在鎖陽原花青素的質(zhì)量濃度1.0 mg/mL時(shí)達(dá)到最大值；在100 ℃條件下也在1.0 mg/mL時(shí)抑制率最大。

在80 ℃或100 ℃時(shí)，在體系中加入Al3+、Cu2+、Fe2+、Mg2+、Ca2+和Zn2+，發(fā)現(xiàn)金屬離子對AGEs的生成既有促進(jìn)作用又有抑制作用。在加入1.0 mg/mL的鎖陽原花青素以后，所有的促進(jìn)作用被逆轉(zhuǎn)為抑制作用。在加入低濃度金屬離子時(shí)，鎖陽原花青素對AGEs的抑制作用與無金屬離子加入時(shí)相比稍有所降低，加入高濃度金屬離子時(shí)，對鎖陽原花青素抑制AGEs的影響不顯著。