MEIS2、BRCA1表達(dá)的相關(guān)性及與術(shù)后非小細(xì)胞肺癌化療預(yù)后的關(guān)系

黃長(zhǎng)江 聶婷婷 王迎難 倪吉祥

全球肺癌的病死率占惡性腫瘤病死率第一位[1]。肺癌按組織病理類型分為小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)，NSCLC主要分為鱗狀細(xì)胞癌、腺癌、大細(xì)胞癌，其中NSCLC約占肺癌總數(shù)的80%～85%，NSCLC的治療包括手術(shù)、化療、放療、靶向治療等，對(duì)有手術(shù)適應(yīng)癥手術(shù)切除的患者，仍有部分患者復(fù)發(fā)，化療對(duì)預(yù)防其復(fù)發(fā)具有重要價(jià)值[2]。人乳腺癌易感基因1(breast cancer susceptibility gene 1, BRCA1)的表達(dá)與NSCLC化療療效及預(yù)后密切相關(guān)，其表達(dá)越低，化療療效越好[3]。在肺腺癌細(xì)胞中沉默MEIS2基因，BRCA1基因表達(dá)降低，提示BRCA1為MEIS2的下游基因[4]。MEIS2基因是同源異型盒基因( homeobox genes, HOX)的分枝基因，人類MEIS2基因位于染色體15q14[5]。MEIS2在個(gè)體發(fā)育中發(fā)揮著重要的作用，缺失后可導(dǎo)致個(gè)體發(fā)育異常；MEIS2基因在前列腺癌、卵巢癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤等中異常表達(dá)，但在肺癌中的研究目前國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道較少[6-8]。研究MEIS2與BRCA1的關(guān)系有利于指導(dǎo)NSCLC接受鉑類藥物治療的預(yù)后，故研究MEIS2、BRCA1兩者表達(dá)的相關(guān)性及與術(shù)后NSCLC化療預(yù)后的關(guān)系有重要意義。

對(duì)象與方法

一、研究對(duì)象

選擇2012年2月至 2016年1月在三峽大學(xué)人民醫(yī)院(宜昌市第一人民醫(yī)院)住院患者61例，所有患者均行手術(shù)切除并經(jīng)病理確診為NSCLC，收集患者的石蠟包埋組織標(biāo)本及臨床資料，包括性別、年齡、病理類型、分期等。61例NSCLC患者中，>60歲31例，≤60歲30例，男性年齡42～80歲，平均年齡(62±11.1)歲，女性48～70歲，平均年齡(57±9.7)歲；男性43例，女性18例；鱗癌26例，腺癌35例。電話隨訪患者疾病進(jìn)展情況，隨訪起點(diǎn)時(shí)間為NSCLC手術(shù)后，隨訪終止時(shí)間為2017年1月31日。

二、研究方法

61例NSCLC患者均經(jīng)手術(shù)切除治療，按美國(guó)東部腫瘤協(xié)作組PS(performance status，體力狀況)評(píng)分<2分能耐受化療，術(shù)后接受以鉑類為基礎(chǔ)的第三代藥物聯(lián)合化療，化療方案為：DP方案：多西他賽+順鉑(卡鉑或奈達(dá)鉑)；GP方案：吉西他濱+順鉑(卡鉑或奈達(dá)鉑)；PC方案：培美曲賽+順鉑(卡鉑或奈達(dá)鉑)，共化療4～6周期。

1. 儀器與試劑： HistoStar組織包埋機(jī)、Scientific Shandon石蠟切片機(jī)為Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品，二甲苯、蘇木素為上海川翔生物科技有限公司產(chǎn)品，抗原修復(fù)液EDTA為上海江萊生物公司產(chǎn)品，MEIS2一抗(SC-81986)、BRCA1一抗(SC-642)均為Santa公司產(chǎn)品。

2. 實(shí)驗(yàn)方法： 收集經(jīng)病理確診的石蠟包埋組織標(biāo)本61例，運(yùn)用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)MEIS2、BRCA1的表達(dá)。步驟為：石蠟切片、脫蠟、沖洗，修復(fù)液(EDTA)修復(fù)，加山羊封閉血清室溫下孵育10 min后，加一抗，沖洗，加二抗，37 ℃孵育60 min，沖洗，37 ℃恒溫箱中孵育10 min。PBS沖洗，組織切片上加現(xiàn)配DAB試劑，顯色5～10 min后置于蒸餾水中終止染色，運(yùn)用蘇木素復(fù)染，用蒸餾水沖洗后鹽酸酒精分色后蒸餾水沖洗3 min，干燥脫水，中性樹膠封片后用顯微鏡觀察。

3. 判斷標(biāo)準(zhǔn)： 在顯微鏡下觀察，MEIS2蛋白陽(yáng)性染色或BRCA1蛋白陽(yáng)性染色為顯微鏡下細(xì)胞核或漿呈棕黃色沉著，每例切片至少計(jì)數(shù)10個(gè)200倍視野，視野中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<50%者判為低表達(dá)，視野中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≥50%者判為高表達(dá)。分析MEIS2、BRCA1表達(dá)與NSCLC術(shù)后化療療效兩者表達(dá)的相關(guān)性，按WHO實(shí)體瘤標(biāo)準(zhǔn)將療效分為：完全緩解(complete response, CR)，部分緩解(partial response, PR)，疾病穩(wěn)定(stable disease, SD)，疾病進(jìn)展(progression disease, PD)；CR+PR為近期客觀有效，有效者應(yīng)1個(gè)月后隨訪檢查確認(rèn)。無進(jìn)展生存期(progression free survival, PFS)是從患者開始治療到腫瘤發(fā)生進(jìn)展或死亡的時(shí)間，時(shí)間按月計(jì)算。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

MEIS2、BRCA1在NSCLC組織中的表達(dá)情況，見圖1、2。由圖可知，MEIS2在細(xì)胞核、漿中呈棕黃色沉著>50%。BRCA1在細(xì)胞核、漿中呈棕黃色沉著>50%。

圖1 MEIS2在鱗癌及腺癌組織中的高表達(dá)(×200)

圖2 BRCA1在鱗癌及腺癌組織中的高表達(dá)(×200)

二、MEIS2、BRCA1的表達(dá)與臨床特征的關(guān)系

61例患者中，男性43例，MEIS2高表達(dá)者為24例，BRCA1高表達(dá)者為25例，女性18例，MEIS2高表達(dá)者為為11例，BRCA1高表達(dá)者為15例，61例患者中從性別、年齡、病理分型、TNM 分期，吸煙等方面進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，顯示MEIS2和BRCA1在NSCLC中的表達(dá)與上述臨床特征無顯著相關(guān)性(P>0.05)，見表1。

三、MEIS2、BRCA1的表達(dá)與接受鉑類藥物化療方案的關(guān)系

患者化療方案、臨床特征不一，為避免影響對(duì)化療療效的判斷，將MEIS2、BRCA1高低表達(dá)組與患者的化療方案進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，顯示在化療方案的選擇上無顯著性差異(P>0.05)，見表2。

表2 MEIS2、BRCA1的表達(dá)與化療方案

注：DP：多西他賽+順鉑(卡鉑或奈達(dá)鉑)；GP：吉西他濱+順鉑(卡鉑或奈達(dá)鉑)；PC：培美曲賽+順鉑(卡鉑或奈達(dá)鉑)

四、NSCLC中MEIS2和BRCA1的表達(dá)相關(guān)性

61例患者中MEIS2和BRCA1兩者均高表達(dá)32例，均低表達(dá)18例，MEIS2高表達(dá)且BRCA1低表達(dá)3例，MEIS2低表達(dá)且BRCA1高表達(dá)8例，61例NSCLC患者中MEIS2和BRCA1的高表達(dá)率分別為57.38%(35/61)和65.57%(40/61)，兩者表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.59，P=0.003)。

五、MEIS2、BRCA1表達(dá)與化療療效關(guān)系

對(duì)61例NSCLC 患者經(jīng)至少2周期含鉑化療后進(jìn)行隨訪，CR+PR共20例，SD12例，PD29例，MEIS2高表達(dá)中CR+PR有7例，5例SD，23例PD，MEIS2低表達(dá)中CR+PR有13例，7例SD，6例PD；BRCA1高表達(dá)中CR+PR有6例，6例SD，28例PD，BRCA1低表達(dá)中CR+PR有14例，6例SD，1例PD，MEIS2、BRCA1表達(dá)與化療療效有極顯著性差異(P<0.01)。

表1 患者臨床資料及免疫組化結(jié)果

六、MEIS2、BRCA1表達(dá)與控制、進(jìn)展率的關(guān)系

61例NSCLC 患者中，MEIS2高表達(dá)控制有7例、進(jìn)展23例，MEIS2低表達(dá)中控制有13例，進(jìn)展6例，兩者有顯著性差異(P<0.05)。BRCA1高表達(dá)控制有6例、進(jìn)展28例，BRCA1低表達(dá)中控制有14例，進(jìn)展1例，兩者有顯著性差異(P<0.05)。

七、MEIS2、BRCA1的表達(dá)與無進(jìn)展生存期的關(guān)系

61例NSCLC MEIS2高表達(dá)患者的無進(jìn)展生存期為：(31.44±0.41)個(gè)月，低表達(dá)患者為：(40.5±2.89)個(gè)月；BRCA1高表達(dá)患者的無進(jìn)展生存期為：(26.49±0.37)個(gè)月，低表達(dá)患者為：(44.7±0.66)個(gè)月。MEIS2、BRCA1低表達(dá)的無進(jìn)展生存期較高表達(dá)組長(zhǎng)。Kaplan-Meier生存曲線并統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)MEIS2、BRCA1的表達(dá)與無進(jìn)展生存期有極顯著性差異(P<0.01)，見圖3～4。

圖3 MEIS2基因表達(dá)與疾病進(jìn)展時(shí)間的關(guān)系P=0.000(月)

圖4 BRCA1基因表達(dá)與疾病進(jìn)展時(shí)間的關(guān)系P=0.000(月)

討 論

肺癌是全球面臨的最嚴(yán)重公共健康問題之一，也是我國(guó)最常見的惡性腫瘤之一，2015年我國(guó)肺癌新發(fā)病例達(dá)73.3萬，死亡病例達(dá)61.0萬，死亡率和發(fā)病率均居惡性腫瘤的第一位[9]。肺癌可分為SCLC和NSCLC兩種病理類型，NSCLC主要分為鱗狀細(xì)胞癌、腺癌、大細(xì)胞癌，85%左右的肺癌患者為NSCLC，近年來年輕肺癌患者且女性肺癌(尤其是肺腺癌)的發(fā)病率增加[10]。美國(guó)醫(yī)療保險(xiǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)統(tǒng)計(jì)，初診肺癌患者有57%已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，喪失手術(shù)的機(jī)會(huì)，晚期肺癌一年生存率僅約10%左右，合理運(yùn)用手術(shù)、放化療及分子靶向治療等方法，特別是化療仍然是控制腫瘤進(jìn)展，延長(zhǎng)生存率的重要措施[11-12]。NSCLC的分期采用IASLC(國(guó)際肺癌研究協(xié)會(huì))第七版2009年或第八版2015年分期標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)Ⅰa、Ⅰb、Ⅱa和Ⅱb期能耐受手術(shù)的NSCLC患者首選手術(shù)，部分患者經(jīng)術(shù)前化療(新輔助化療)而降低腫瘤分期，再聯(lián)合手術(shù)治療，可延長(zhǎng)患者生存率[13-14]。但在NSCLC患者手術(shù)治療后，術(shù)后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率高達(dá)80%[15]。化療可降低其復(fù)發(fā)率，故化療是NSCLC的重要治療措施，術(shù)后常使用含鉑兩藥化療方案治療4個(gè)周期，按美國(guó)東部腫瘤協(xié)作組(Eastern Cooperative Oncology Group, ECOG)對(duì)體力狀況(performance status, PS)評(píng)分≤2分，主要器官能耐受化療的患者進(jìn)行化療[16]。大部分NSCLC患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于晚期，失去手術(shù)機(jī)會(huì)，采取多學(xué)科綜合治療與個(gè)體化治療相結(jié)合的原則，合理應(yīng)用手術(shù)、化療、放療和分子靶向治療等手段，可以最大程度地延長(zhǎng)患者的生存時(shí)間、控制腫瘤進(jìn)展和提高患者生活質(zhì)量[17]。

肺癌的發(fā)生與抑癌基因失活和癌基因激活相關(guān)，基因表達(dá)異?？芍孪嚓P(guān)蛋白功能異常，可促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[18]。某些基因與腫瘤的預(yù)后相關(guān)，如文獻(xiàn)報(bào)道BRCA1基因表達(dá)水平與腫瘤接受鉑類藥物化療的敏感性相關(guān)[19]。我們運(yùn)用短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA, shRNA)干擾技術(shù)介導(dǎo)肺腺癌A549細(xì)胞的MEIS2基因沉默，shRNA介導(dǎo)的MEIS2基因沉默可誘導(dǎo)A549出現(xiàn)生長(zhǎng)抑制、密度稀疏、細(xì)胞皺縮、流式細(xì)胞檢測(cè)提示細(xì)胞凋亡，G2/M期比例增高，基因芯片檢測(cè)DAVID分析發(fā)現(xiàn)DNA復(fù)制及細(xì)胞周期信號(hào)通路基因表達(dá)全面下調(diào)，BRCA1表達(dá)下調(diào)明顯，實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證BRCA1 mRNA水平和BRCA1蛋白表達(dá)水平降低，MEIS2沉默后BRCA1表達(dá)也降低，顯示MEIS2在NSCLC細(xì)胞的調(diào)控中，BRCA1是其下游基因，MEIS2通過BRCA1調(diào)控NSCLCA549細(xì)胞生長(zhǎng)及細(xì)胞周期阻滯[4]。MEIS2基因與肺癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，是否也與接受含鉑藥物的化療敏感性相關(guān)，本文通過收集病例進(jìn)行了探討。

人乳腺癌易感基因1(breast cancer susceptibility gene 1, BRCA1)是首先被發(fā)現(xiàn)的具有遺傳傾向乳腺癌易感基因[20]。研究發(fā)現(xiàn)，鉑類藥物作用機(jī)制為在細(xì)胞核內(nèi)與DNA結(jié)合，通過DNA鏈內(nèi)、鏈間交聯(lián)，使DNA雙鏈、單鏈斷裂和損傷，抑制細(xì)胞分裂，殺滅腫瘤細(xì)胞而起治療作用[21]。BRCA1在鉑類藥物導(dǎo)致的DNA損傷中具有修復(fù)能力，故使鉑類藥物存在耐藥性，BRCA1高表達(dá)時(shí)提高了細(xì)胞修復(fù)DNA損傷的能力，導(dǎo)致鉑類藥物耐藥[22]。除了與DNA損傷藥物的關(guān)系外，BRCA1還具有調(diào)控有絲分裂的作用，BRCA1基因參與有絲分裂紡錘體的形成及染色體的正確分離過程，與紫杉類藥物(紡錘體毒性藥物)化療敏感性相關(guān)[23]。同時(shí)在腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移相關(guān)的血管生成過程中BRCA1也發(fā)揮了一定作用。BRCA1的表達(dá)與NSCLC化療療效及預(yù)后密切相關(guān)，其表達(dá)越低，化療療效越好，生存越長(zhǎng)，反之生存越差[24]。

在生物發(fā)育中，其某一部位的性狀特征出現(xiàn)在其他部位的現(xiàn)象，稱為同源異形突變[25]。在研究果蠅胚胎發(fā)育過程中，發(fā)現(xiàn)果蠅的形態(tài)發(fā)育由一套基因編碼的蛋白質(zhì)決定，若其中某基因發(fā)生突變，就會(huì)出現(xiàn)同源異形突變，所以稱這套基因?yàn)镠OX基因(即同源盒基因或同源異型盒基因)[26]。同源盒基因分為2類，Ⅰ類為HOX基因，Ⅱ類為HOX分枝基因，包括TALE家族(含MEIS家族及PBX家族)、PAX等，人類MEIS基因家族成員包括：MEIS1、MEIS2、MEIS3[5]。MEIS2通常與PBX形成蛋白復(fù)合物，進(jìn)而與HOX基因相互作用通過信號(hào)通路促進(jìn)下游基因的轉(zhuǎn)錄并參與個(gè)體發(fā)育以及分化過程，MEIS2在個(gè)體發(fā)育中發(fā)揮著重要的作用[27]；MEIS2在斑馬魚中表達(dá)下調(diào)，其心臟發(fā)育則出現(xiàn)嚴(yán)重受損[28]；MEIS2與PAX3、PAX7相互作用調(diào)控頂蓋發(fā)育，在腦的發(fā)育中起重要作用[29]；MEIS2通過促進(jìn)PAX6及cyclin D1在眼的及視網(wǎng)膜的發(fā)育中起重要作用[30]。MEIS2基因在腫瘤中常異常表達(dá)，提示MEIS2基因與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，James等[6]報(bào)道MEIS2基因表達(dá)與前列腺癌的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移有關(guān)。Crijns等[7]報(bào)道MEIS2基因在卵巢癌中廣泛表達(dá)，并且可能在卵巢中起致癌作用，MEIS2基因在卵巢癌細(xì)胞株A2780中可降低對(duì)順鉑的藥物敏感性。MEIS2基因表達(dá)與卵巢癌的總生存率相關(guān)，MEIS2基因涉及卵巢致癌過程，可能在DNA結(jié)合，細(xì)胞周期控制，血管生成和細(xì)胞-細(xì)胞間信號(hào)傳遞等過程中起作用。

對(duì)本組61例NSCLC患者測(cè)定肺癌組織中MEIS2基因的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，MEIS2的表達(dá)與性別、年齡、病理類型、臨床分期、吸煙狀況均無明顯差異性，但MEIS2和BRCA1兩者的高低表達(dá)存在顯著相關(guān)性。統(tǒng)計(jì)分析顯示MEIS2、BRCA1與NSCLC患者術(shù)后接受鉑類藥物化療的預(yù)后相關(guān)，MEIS2和BRCA1的表達(dá)越低，化療療效越好。但本文納入的樣本數(shù)量有限，尚需更多研究以進(jìn)一步證實(shí)MEIS2與NSCLC患者接受鉑類藥物化療敏感性的關(guān)系，同時(shí)需進(jìn)一步研究MEIS2與鉑類藥物敏感性的機(jī)制，以指導(dǎo)NSCLC的治療。