人源多菌株益生菌發(fā)酵條件的研究

印伯星，瓦云超，黃玉軍，徐廣新，顧瑞霞

（1.揚(yáng)州大學(xué)，江蘇揚(yáng)州225009；2.揚(yáng)州大學(xué)江蘇省乳品生物技術(shù)與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇揚(yáng)州225009；3.江蘇省乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心，江蘇揚(yáng)州225004；4.揚(yáng)州市揚(yáng)大康源乳業(yè)有限公司，江蘇揚(yáng)州225004）

0 引 言

發(fā)酵乳具有獨(dú)特的風(fēng)味、豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和多種健康因子，廣受各國(guó)消費(fèi)者青睞，已成為乳制品中發(fā)展最快的產(chǎn)品之一。中國(guó)發(fā)酵乳市場(chǎng)每年保持著兩位數(shù)的高速增長(zhǎng)，增長(zhǎng)率領(lǐng)跑全球，2017年產(chǎn)值已經(jīng)超過(guò)1 000億，預(yù)計(jì)2020年中國(guó)發(fā)酵乳市場(chǎng)規(guī)模將近2 000億元[1]。發(fā)酵乳產(chǎn)品和品牌的競(jìng)爭(zhēng)也日趨激烈，功能性發(fā)酵乳產(chǎn)品的研究與開發(fā)將成為下一階段乳制品發(fā)展的重點(diǎn)。

發(fā)酵乳品質(zhì)在很大程度上取決于發(fā)酵劑的質(zhì)量，并且其功能特性更加依賴于發(fā)酵菌株的益生特性。因此，在發(fā)酵乳生產(chǎn)前必須根據(jù)發(fā)酵乳的不同種類和生產(chǎn)條件的差異選定適宜菌種預(yù)先制備相應(yīng)的發(fā)酵劑。其次，在保障發(fā)酵乳具有良好口感和風(fēng)味的同時(shí)，還應(yīng)保持發(fā)酵乳制品中存在較高的活菌數(shù)以保證其進(jìn)入體內(nèi)發(fā)揮益生作用。因此，新型發(fā)酵乳制品開發(fā)的核心將是優(yōu)良菌株篩選、高活性發(fā)酵劑制備、新型發(fā)酵乳制備技術(shù)的研究[2]。

選用 L.rhamnosus LV108、L.casei grx12 和 L.fer?mentum grx08是實(shí)驗(yàn)室從3160株分離自長(zhǎng)壽地區(qū)人群體內(nèi)的3株具有較好的耐酸、耐膽鹽、人工胃腸液等特性。僅以3株人源乳桿菌組合制備發(fā)酵乳，旨在確定3株菌株復(fù)配比例及優(yōu)化發(fā)酵乳制備工藝，為進(jìn)一步研究開發(fā)具有降膽固醇的功能特性的人源益生菌發(fā)酵乳提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株與材料

本實(shí)驗(yàn)所選用的L.rhamnosus LV108、L.casei grx12和L.fermentum grx08均由揚(yáng)州大學(xué)江蘇省乳品生物技術(shù)與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

MRS液體、固體培養(yǎng)基，12%脫脂乳培養(yǎng)基，生理鹽水，氫氧化鈉（分析純）。

1.2 主要儀器與設(shè)備

HH-6恒溫水浴鍋，JF-SX-500全自動(dòng)滅菌鍋，日立7020全自動(dòng)生化分析儀，Legend mach1.6R高速冷凍離心機(jī)，SPX-150BSH生化培養(yǎng)箱，CAR/PDMS75μ m萃取纖維頭，Trace DSQ氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，Milli-Q Direct 8超純水系統(tǒng)，SW-CJ-1F單人雙面工作凈化臺(tái)，GYB60-08高壓均質(zhì)機(jī)，BS2000S電子天平，F(xiàn)E20pH計(jì)，TMS-Pro質(zhì)構(gòu)儀。

1.3 方法

1.3.1 菌種的活化

將凍存于-80℃冰箱的實(shí)驗(yàn)菌株接入MRS液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)24 h，革蘭氏染色鏡檢是否有雜菌。確定無(wú)雜菌后，活化三代用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.2 人源乳酸菌益生特性測(cè)定

對(duì)菌株的耐酸能力、耐膽鹽能力、耐抗生素能力、抑菌能力、疏水性、黏附性、甘油三酯降解能力及膽固醇降解能力等安全指標(biāo)和功能性指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，方法參照作者所在實(shí)驗(yàn)室的測(cè)定方法[3-5]。

1.3.3 不同混合菌株發(fā)酵特性

將脫脂乳粉復(fù)原成12%(w/v)的脫脂乳，放置30 min使蛋白質(zhì)充分復(fù)水后分裝每個(gè)三角玻璃小瓶100 mL（平行樣5個(gè)），95℃滅菌5 min，冷卻至37℃左右，分別以 1∶0∶0、0∶1∶0、0∶0∶1、1∶1∶1、2∶1∶1 接種 L.rham?nosus LV108、L.casei grx12和L.fermentum grx08，制成乳酸菌脫脂乳發(fā)酵劑進(jìn)行發(fā)酵乳試驗(yàn)。每2 h取樣測(cè)定其酸度、黏度、游離氨基酸數(shù)值，連續(xù)測(cè)定24 h。將實(shí)驗(yàn)菌株按3%接種至脫脂乳培養(yǎng)基，42℃恒溫培養(yǎng)并記錄凝乳時(shí)間。

1.3.4 理化指標(biāo)測(cè)定

酸度測(cè)定：參照國(guó)標(biāo)GB5413.34-2010[6]的方法，用0.10 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行滴定。

黏度測(cè)定：參照欒少萌[7]的方法進(jìn)行測(cè)定。

游離氨基酸測(cè)定：樣品采用H.M.Abu-tarboush的處理方法；游離氨基酸測(cè)定采用Frank.C.Church等[8]建立的鄰苯二甲醛(OPA)法。

活菌數(shù)測(cè)定：參照陳廷續(xù)[9]方法，無(wú)菌條件下吸取樣品5 mL置于滅菌三角瓶?jī)?nèi)，加入45mL滅菌水，振蕩5 min制成1∶10稀釋液，隨后進(jìn)行梯度稀釋到10-6～10-8左右，分別在做10倍遞增稀釋，選取不同稀釋度稀釋液1 mL置于滅菌平皿中，注入30 mL培養(yǎng)基（同時(shí)做培養(yǎng)基空白對(duì)照）；待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平板，置于37℃溫箱中進(jìn)行培養(yǎng)48 h左右，選取菌落數(shù)在30～300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。隨機(jī)挑取5個(gè)菌落數(shù)進(jìn)行革蘭氏染色，顯微鏡進(jìn)行復(fù)查，排除雜菌。

1.3.5 人源乳酸菌發(fā)酵乳工藝優(yōu)化

根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，本研究在前期單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以活菌數(shù)、pH測(cè)定和冷藏后發(fā)酵乳狀態(tài)為響應(yīng)值對(duì)接種量（2%、3%、4%、5%、6%）、蔗糖添加量（5%、6%、7%、8%、9%）、發(fā)酵溫度（33℃、35℃、37℃、39℃、41℃）與固形物含量（11%、12%、13%、14%、15%）4個(gè)因素進(jìn)行分析。

表1 人源乳酸菌發(fā)酵乳配方因素水平表

1.3.6 質(zhì)構(gòu)測(cè)定

測(cè)試模式為compression，測(cè)試前下降速度為1.0 mm/s，測(cè)試速度為1.0 mm/s，測(cè)試后速度為10.0 mm/s，測(cè)試距離為30 mm，采用A/BE探頭，直徑40 mm[10]。

1.3.7 風(fēng)味物質(zhì)測(cè)定

樣品預(yù)處理：固相微萃取法；GC-MS分析色譜條件：色譜柱，PEG-20M柱(30m×0.25mm×0.25I×m)，升溫程序(初始溫度36℃，以4℃/min升至120℃，保持4 min隨后以10℃/min升至230℃，保持8 min載氣(流速0.8 mL/min)，進(jìn)樣溫度為250℃，

質(zhì)譜條件：電子能量70 eV，離子化電流200 I×A，離子源溫度200℃，電子倍增電壓350 V[11]。

2 結(jié)果與討論

2.1 人源乳酸菌益生特性

對(duì)分離得到的人源乳酸菌進(jìn)行了體外功能益生特性研究，其中獲得了3株益生特性良好且對(duì)甘油三酯和膽固醇具有降解作用的乳酸菌株，具體如表2所示。

表2 3株益生特性良好的乳酸菌

2.2 混合菌株發(fā)酵特性測(cè)定

2.2.1 人源乳酸菌產(chǎn)酸特性

酸度的測(cè)定主要監(jiān)測(cè)不同混合乳酸菌的產(chǎn)酸能力及后酸化情況，分別對(duì)使用不同人源乳酸菌組別制成發(fā)酵乳產(chǎn)酸情況進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同乳酸菌發(fā)酵過(guò)程中酸度變化

由圖1發(fā)現(xiàn)，L.casei grx12菌株酸度在22 h左右仍有跳躍性增長(zhǎng)，L.fermentum grx08酸度隨時(shí)間的變化呈現(xiàn)先急速增加后緩慢增長(zhǎng)的趨勢(shì)，L.rhamnosus LV108、混合乳酸菌（1∶1∶1）和混合乳酸菌（2∶1∶1）酸度均隨測(cè)定時(shí)間而增加，且在凝乳后緩慢增長(zhǎng)。

跟蹤測(cè)定3 d后，各組發(fā)酵乳酸度發(fā)現(xiàn)，混合乳酸菌（2∶1∶1）制備的發(fā)酵乳酸度上升3.5 °T，混合乳酸菌（1∶1∶1）制備的酸乳上升4.2 °T，LV108后酸化較弱僅上升2.1°T，L.fermentum grx08和L.casei grx12則分別上升了3.5°T和5.3°T，這可能由于菌株中的脲酶能夠分解尿素形成氮，從而有效減緩后酸化[15]。由此可看出，各組發(fā)酵乳的后酸化程度均不高，可作為生產(chǎn)發(fā)酵劑使用。

2.2.2 人源乳酸菌產(chǎn)黏特性

對(duì)使用不同人源乳酸菌組別制成發(fā)酵乳測(cè)定其黏度，結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同乳酸菌發(fā)酵乳發(fā)酵過(guò)程中黏度變化

選擇產(chǎn)高黏度發(fā)酵劑既可提高產(chǎn)品在生產(chǎn)過(guò)程中經(jīng)泵運(yùn)輸時(shí)的抗剪切作用，也可提高產(chǎn)品拉絲感及醇厚的口感。由圖2可看出，不同人源乳酸菌組別發(fā)酵劑的黏度隨測(cè)定時(shí)間的延長(zhǎng)先增加后緩慢變化，但最大黏度差異較大，其變化范圍在0.9 Pa·s-1.6 Pa.s?；旌先樗峋?∶1∶1）發(fā)酵劑黏度最高為1.6 Pa·s，grx12黏度則最低為0.9 Pa·s，而grx08、LV108、混合乳酸菌（1∶1∶1）發(fā)酵劑的黏度分別為1.5 Pa·s、1.1 Pa·s和1 Pa·s。除grx12外，其它幾組發(fā)酵劑黏度均高于1 Pa·s，混合乳酸菌（2∶1∶1）發(fā)酵劑黏度高于單一發(fā)酵菌株，這主要由于不同菌種間的共生關(guān)系能夠刺激菌株的產(chǎn)黏特性[16]。同時(shí)，多菌株共同發(fā)酵過(guò)程中胞外多糖的組分不同，會(huì)直接影響酸乳的組織狀態(tài)。因此，混合乳酸菌（2∶1∶1）可以優(yōu)先作為發(fā)酵乳發(fā)酵劑。

2.2.3 人源乳酸菌蛋白水解能力

對(duì)使用不同人源乳酸菌組別制成發(fā)酵乳測(cè)定游離氨基酸，結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同乳酸菌發(fā)酵過(guò)程中氨基酸含量變化

由圖3可以看出，不同人源乳酸菌組別發(fā)酵劑的蛋白水解能力差異較大，且隨時(shí)間變化呈現(xiàn)先繼續(xù)增加后穩(wěn)定的趨勢(shì)，其中g(shù)rx08游離氨基酸含量最低為1.21 mmol·L-1，而 grx12 含量為 1.35 mmol·L-1，LV108含量為1.13 mmol·L-1?；旌先樗峋?∶1∶1）發(fā)酵劑和混合乳酸菌（2∶1∶1）發(fā)酵劑的游離氨基酸含量與單一菌株相差不顯著，分別為1.29和1.43 mmol·L-1，這可能由于混合菌株生長(zhǎng)過(guò)程中消耗了部分氨基酸[17]。

2.2.4 人源乳酸菌貯藏期內(nèi)活菌存活率

本研究產(chǎn)品屬于低溫活性發(fā)酵乳制品，產(chǎn)品活菌數(shù)是考量產(chǎn)品品質(zhì)的一個(gè)重要因素，對(duì)使用不同人源乳酸菌組別制成的發(fā)酵乳測(cè)定3 d和21 d后的產(chǎn)品活菌數(shù)值。結(jié)果如表3所示。

表3 單一及混合乳酸菌發(fā)酵乳貯藏過(guò)程中的活菌數(shù)變化

由表3可以看出，不同組合發(fā)酵劑在活菌數(shù)達(dá)到最大值后會(huì)隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)而減少，且呈顯著性差異。其中發(fā)酵劑5的活菌總數(shù)3 d后仍高達(dá)1.10×109CFU/mL，這可能是該發(fā)酵溫度下，混合乳酸菌具有良好的共生關(guān)系，也可能是某些代謝產(chǎn)物刺激乳酸菌生長(zhǎng)繁殖。另外，21 d后發(fā)酵劑5的活菌數(shù)仍然高達(dá)0.78×108CFU/mL，表明混合人源乳酸菌具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性。且該發(fā)酵劑制備發(fā)酵乳活菌數(shù)顯著高于國(guó)標(biāo)GB19302中關(guān)于乳酸菌含量要達(dá)到1×106CFU/mL的要求。

綜合以上研究發(fā)現(xiàn)，混合乳酸菌（2∶1∶1）發(fā)酵時(shí)間適當(dāng)、后酸化較弱、黏度較強(qiáng)、游離氨基酸較多且產(chǎn)品活菌數(shù)高，混合乳酸菌（2∶1∶1）更適用于人源乳酸菌發(fā)酵乳的制備發(fā)酵劑。

2.3 人源乳酸菌發(fā)酵乳制備條件優(yōu)化

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以混合乳酸菌（2∶1∶1）作為人源乳酸菌發(fā)酵乳發(fā)酵劑，選擇接種量、發(fā)酵溫度、乳固形物含量及蔗糖添加量作為實(shí)驗(yàn)因素，設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，并記錄每組乳酸菌發(fā)酵乳活菌數(shù)量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，并用數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行直觀和極差分析，結(jié)果如表4所示。

表4 混合乳酸菌發(fā)酵乳正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表4可知，發(fā)現(xiàn)對(duì)混合乳酸菌發(fā)酵乳活菌數(shù)量影響程度順序依次為A＞C＞D＞B。因此，選定A2B3C2D1，即混合乳酸菌接種量為5.0%，蔗糖添加量為8.0%，發(fā)酵溫度為37℃，乳固形物含量為12.0%作為混合乳酸菌發(fā)酵乳制備條件。

2.4 人源乳酸菌發(fā)酵乳風(fēng)味和質(zhì)構(gòu)特性

2.4.1 人源乳酸菌發(fā)酵乳風(fēng)味物質(zhì)

以混合乳酸菌（2∶1∶1）作為發(fā)酵乳發(fā)酵劑，根據(jù)最佳工藝制作發(fā)酵乳，同時(shí)制作普通酸牛奶作為對(duì)照，利用頂空SPME GC/MS測(cè)定樣品揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，結(jié)果如表5所示。

比較普通乳酸菌制備的發(fā)酵乳和混合乳酸菌制備的發(fā)酵乳中揮發(fā)性物質(zhì)種類可以發(fā)現(xiàn)，普通發(fā)酵乳中檢測(cè)到的揮發(fā)性物質(zhì)種類較少，為26種，而人源乳酸菌制備的發(fā)酵乳中檢測(cè)到的揮發(fā)性物質(zhì)種類為41株。其中作為發(fā)酵乳特征風(fēng)味物質(zhì)的乙醛和雙乙酰含量，人源乳酸菌制備的發(fā)酵乳的含量分別為25 ug/g和26 ug/g，是普通發(fā)酵乳的3倍左右，這就使其特征風(fēng)味優(yōu)于普通發(fā)酵乳。另外，酸類物質(zhì)對(duì)發(fā)酵乳風(fēng)味強(qiáng)度影響較大，人源乳酸菌制備的發(fā)酵乳中己酸、乙酸、辛酸等含量顯著高于普通發(fā)酵乳。其中，乙酸具有淡淡的酸味、辛酸具有清香、己酸有油脂味，其它的不飽和脂肪酸具有果香和乳香味[18]。

表5 普通酸奶和混合乳酸菌發(fā)酵乳主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)

2.4.2 多菌株人源乳酸菌發(fā)酵乳質(zhì)構(gòu)特性

表6 普通酸奶和混合乳酸菌發(fā)酵乳質(zhì)構(gòu)特性

由表6可知，多菌株人源乳酸菌酸奶的質(zhì)構(gòu)特性顯著優(yōu)于空白組，其硬度、稠度、凝聚性和黏度分別為215 g、5179 g·s、178 g、341 g·s。這主要是因?yàn)槎嗑耆嗽慈樗峋崮探M織狀態(tài)細(xì)膩、均勻，且硬度、稠度、凝聚性和黏度都較適中，這也是容易被消費(fèi)者接受的原因。

3 結(jié)論

混合乳酸菌（L rhamnosus LV108∶L.casei grx12∶L.fermentum grx08=2∶1∶1）發(fā)酵時(shí)間適當(dāng)、后酸化較弱、黏度較強(qiáng)、游離氨基酸較多且產(chǎn)品活菌數(shù)高，以混合乳酸菌（2∶1∶1）為發(fā)酵劑的最佳發(fā)酵工藝為接種量為5.0%，蔗糖添加量為8.0%，發(fā)酵溫度為37℃，乳固形物含量為12.0%。按此參數(shù)生產(chǎn)的多菌株人源益生菌酸奶組織細(xì)膩、質(zhì)地均勻、酸甜適中、黏稠適度，具有較佳的風(fēng)味。