響應面法優(yōu)化金果欖多糖提取工藝及抗氧化活性研究

蔣德旗 柒善懷 張?zhí)m熙 趙仕花 盧燕燕

摘要：目的? 研究復合酶提取金果欖多糖的最佳條件，并探討其體外抗氧化活性。方法? 復合酶種類及配比為纖維素酶∶果膠酶∶木瓜蛋白酶=1∶1∶1，液料比固定為20 mL/g，以金果欖多糖得率為響應值，在單因素試驗基礎上，以酶解pH值、酶解時間、復合酶添加量、酶解溫度為自變量，采用響應面法建立數(shù)學模型，篩選最佳提取工藝;采用DPPH自由基、羥自由基（·OH）、超氧陰離子自由基（O2-·）清除能力體系評價金果欖多糖體外抗氧化活性。結(jié)果? 金果欖多糖最佳提取條件為：酶解pH值5.1，酶解時間56 min，復合酶添加量2.0%，酶解溫度52 ℃。在此條件下多糖得率為14.03%，與理論值14.12%的相對誤差<5%。酶解溫度對多糖得率影響最顯著，酶解時間、酶解pH值次之，酶添加量影響最小。金果欖多糖對DPPH、·OH、O2-·清除的半數(shù)抑制濃度分別為1.358、0.927、1.096 mg/mL，與維生素C比較，抗氧化活性較弱。結(jié)論? 本研究優(yōu)選的金果欖多糖復合酶法提取工藝方便可行，酶解得到的多糖具有較強的體外抗氧化活性。

關鍵詞：金果欖;多糖;響應面法;復合酶;抗氧化活性

中圖分類號：R284.2;R285.5? ? 文獻標識碼：A? ? 文章編號：1005-5304（2019）04-0085-06

金果欖為防己科植物青牛膽或金果欖的干燥塊根，主要分布于我國廣西、四川、貴州等西南地區(qū)。金果欖主要含有季銨生物堿、萜類、甾醇類及多糖等化學成分[1-2]，性寒味苦，具有清熱解毒、清喉利咽、消腫止痛功效，臨床主要用于治療急慢性咽喉炎、扁桃體炎、菌痢、癰腫疔癤等[3-4]，有“壯藥中的廣譜抗菌素”之稱[5]。目前對其萜類及生物堿成分的藥理作用研究較多，而對金果欖多糖的相關研究鮮見報道?，F(xiàn)代藥理學研究表明，天然產(chǎn)物多糖具有抗炎、抗氧化、抗衰老、降低血糖及增強免疫等多種藥理作用[6-8]，且生物活性強、毒副作用少[9]。本研究采用響應面法優(yōu)化復合酶提取金果欖多糖的工藝條件，并探討其體外抗氧化活性，為金果欖多糖成分進一步開發(fā)為藥品及食品抗氧化添加劑提供一定的依據(jù)。

1? 儀器與試藥

5810R型高速冷凍離心機，德國Eppendorf;Alpha-1506型紫外分光光度計，上海譜元儀器有限公司;SHA-BA雙功能水浴恒溫振蕩器，常州華普達教學儀器有限公司;PHS-25型pH計，上海雷磁;SHB-III型循環(huán)水真空泵、2L-ARE旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海皓莊儀器有限公司。

金果欖購自廣西玉林眾康大藥房，經(jīng)玉林師范學院生物與制藥學院陳曉白教授鑒定為防己科植物金果欖Tinospora capillipes Gagnep.的干燥塊根;維生素C（批號100425-201709），中國食品藥品檢定研究院;D-無水葡萄糖（批號20171104）、超氧陰離子自由基（O2-·）和羥自由基（·OH）清除能力檢測試劑盒（批號20180105），北京索萊寶科技有限公司;纖維素酶（5萬U/g，批號20171205）、果膠酶（10萬U/g，批號20171108）、木瓜蛋白酶（8萬U/g，批號20171013），江蘇銳陽生物技術公司;DPPH（批號D4313-6HOG4），日本TCI公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

2? 方法與結(jié)果

2.1? 提取方法

多糖提取方法參照文獻[10]進行，主要包括粉碎過篩（100目）、特定酶解條件下提取、高溫滅活、分離濃縮、乙醇沉淀、Sevage法脫蛋白、二次醇沉、真空冷凍干燥等系列步驟。

2.2? 多糖含量測定

采用苯酚-硫酸法測定多糖含量。以葡萄糖濃度為橫坐標，490 nm波長處吸光度值為縱坐標，得標準曲線方程為Y=8.498 6X-0.018 5，r2=0.990 3，表明葡萄糖的線性范圍為20～120 μg。多糖得率（%）=CnV/m×100%，C為樣品稀釋液中多糖濃度（mg/mL），n為稀釋倍數(shù)，V為樣品稀釋液體積（mL），m為金果欖粉末質(zhì)量（mg）。

2.3? 單因素試驗

酶解時的搖床轉(zhuǎn)速固定為180 r/min，液料比為20 mL/g，復合酶（纖維素酶-果膠酶-木瓜蛋白酶）配比為1∶1∶1[11]，分別考察酶解pH值、酶解時長、酶添加量和酶解溫度對金果欖多糖得率的影響，其中各因素固定水平為pH值5.0、酶添加量2.0%、酶解時間60 min、酶解溫度50 ℃。

2.3.1? 復合酶添加量

復合酶添加量分別為1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%時的多糖得率見圖1。當復合酶添加量增加到2.0%時，多糖得率可達13.47%，進一步加大酶用量，多糖得率無顯著提升，說明在該底物濃度下酶濃度已趨于飽和，繼續(xù)增加復合酶用量對多糖得率沒有顯著影響，故選擇2.0%作為酶的最佳添加量。

2.3.2? 酶解pH值

酶解pH值分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0時的多糖得率見圖2。當pH值增加到5.0時，多糖得率達到最大值13.72%，pH值為6.0時多糖得率反而減小，這主要與pH值過高或過低影響酶本身活性有關，故酶解最適pH值選定為5.0。

2.3.3? 酶解溫度

酶解溫度分別為30、40、50、60 ℃時的多糖得率見圖3。隨著溫度升高，多糖得率先增大后減小，這是由于溫度過高導致酶活力減弱所致，故選擇最適酶解溫度為50 ℃。

2.3.4? 酶解時間

酶解時間分別為20、40、60、80、100 min的多糖得率見圖4。當酶解時間為60 min時，多糖得率為13.68%，接近80 min時的最大值13.76%，再延長提取時間，多糖得率反而減小。這是因為酶解時間過長，酶催化活性減弱，反而不利于多糖提取?？紤]到實際生產(chǎn)效率，故選擇60 min為最佳酶解時間。

2.4? 響應面試驗設計及結(jié)果

響應面試驗設計自變量為酶解pH值、酶解時間、酶添加量、酶解溫度4個因素，以多糖得率為響應值，采用Design Expert 8.06軟件進行數(shù)據(jù)分析。因素水平見表1，試驗設計及結(jié)果見表2，回歸模型方差分析見表3。

對表2中數(shù)據(jù)進行回歸擬合，獲得自變量（酶解pH、酶解時間、酶添加量、酶解溫度）對金果欖多糖得率的二次多項回歸方程：Y=13.86-0.19A-0.64B-0.17C+0.98D-1.86AB-0.61AC+2.07AD-0.56BC+0.41BD+0.17CD-2.06A2-2.49B2-0.74C2-1.65D2。方差分析結(jié)果顯示，回歸方程模型P<0.000 1，失擬項不顯著（P=0.1145），模型總決定系數(shù)R2=0.980 1，調(diào)整后R2Adj=0.960 2，以上參數(shù)均說明該模型與試驗數(shù)據(jù)擬合程度好，試驗誤差小，可用于不同變量條件下的響應值預測。

由表3中F值可知，金果欖多糖復合酶法提取影響因素主次順序為：酶解溫度（D）>酶解時間（B）>酶解pH值（A）>酶添加量（C），其中D、B兩因素影響顯著。因素間交互作用對金果欖多糖得率的影響見圖5，由圖5、表3可知，AB、AC、AD、BC交互作用顯著影響金果欖多糖酶法提取的得率，其中AB、AD影響極顯著，AC、BC顯著，BD、CD間交互作用對多糖得率影響不顯著（P>0.05）。

2.5? 最佳提取條件預測及驗證試驗

對回歸模型方程求解，獲得金果欖多糖復合酶提取的最佳條件為：酶解pH值5.1，酶解時間56.3 min，酶添加量2.0%，酶解溫度52.2 ℃。在此條件下，理論多糖得率為14.12%?？紤]實際操作方便，將上述最佳提取工藝參數(shù)修改為：酶解pH值5.1，酶解時間56 min，酶添加量2.0%，酶解溫度52 ℃。按照該工藝條件進行3次驗證試驗，結(jié)果多糖得率平均值為（14.03±1.25）%，與理論多糖得率的相對誤差為0.64%，提示本法得到的回歸模型有效、可靠，該復合酶提取金果欖多糖工藝條件具有實際應用價值。

2.6? 體外抗氧化活性測定

參照文獻[11]方法測定金果欖多糖清除DPPH自由基、O2-·能力，檢測波長分別為517、320 nm。測定金果欖多糖清除·OH能力的具體步驟按照試劑盒說明書進行，檢測波長536 nm。抗氧化活性檢測均選擇維生素C作為對照。樣品金果欖多糖及維生素C的質(zhì)量濃度梯度設置為0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.2、2.6、3.0 mg/mL。

2.6.1? 金果欖多糖對DPPH自由基清除作用

金果欖多糖對DPPH自由基清除作用見圖6。當金果欖多糖濃度在0.2～3.0 mg/mL時對DPPH自由基清除率穩(wěn)步提升，濃度為3.0 mg/mL時，金果欖多糖對DPPH自由基清除率為81.96%，維生素C對DPPH自由基清除率可達90.45%，金果欖多糖清除DPPH自由基的半數(shù)抑制濃度（IC50）為1.358 mg/mL，維生素C的IC50為0.867 mg/mL，兩者比較，金果欖多糖清除能力弱于維生素C。以上結(jié)果提示金果欖多糖具有一定的DPPH自由基清除作用。

2.6.2? 金果欖多糖對羥自由基清除作用

金果欖多糖對羥自由基清除作用見圖7。當金果欖多糖濃度在0.2～3.0 mg/mL時對·OH清除率不斷增大，而維生素C在濃度1.8 mg/mL時對·OH清除率已接近最大值，之后趨于穩(wěn)定。當濃度為3.0 mg/mL時，金果欖多糖對·OH清除率為92.05%，維生素C對·OH清除率為96.74%，金果欖多糖清除·OH的IC50為0.927 mg/mL，維生素C的IC50為0.591 mg/mL，兩者比較，維生素C對·OH清除能力強于金果欖多糖。以上結(jié)果提示金果欖多糖具有較好的·OH清除作用。

2.6.3? 金果欖多糖對超氧陰離子自由基清除作用

金果欖多糖對超氧陰離子自由基清除作用見圖8。當金果欖多糖濃度在0.2～3.0 mg/mL時對O2-·清除率穩(wěn)步提升，濃度為3.0 mg/mL時，金果欖多糖對O2-·清除率為83.12%，維生素C對O2-·清除率為91.48%，金果欖多糖清除O2-·的IC50為1.096 mg/mL，維生素C的IC50為0.804 mg/mL，兩者比較，金果欖多糖對O2-·清除能力弱于維生素C。以上結(jié)果說明金果欖多糖具有較好的O2-·清除作用。

3? 討論

酶法提取中藥有效成分操作簡單、條件較溫和、節(jié)約能源、不需要大型設備，并且在成分結(jié)構與生物活性保持方面具有一定的優(yōu)勢[12]。本研究在單因素試驗基礎上，通過響應面優(yōu)化設計考察了金果欖多糖復合酶法提取的工藝。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，金果欖多糖最佳酶解提取條件為：酶解pH值5.1，酶解時間56 min，復合酶添加量2.0%，酶解溫度52 ℃，液料比20 mL/g。在此最佳工藝條件下，金果欖多糖得率為14.03%，與回歸模型方程預測值14.12%比較，相對誤差<5%。4個影響因素中，酶解溫度對金果欖多糖得率的影響最明顯，其次是酶解時間和酶解pH值，而復合酶添加量對多糖得率影響最小。趙成剛等[13]采用熱水浸提法提取金果欖多糖，在提取時間1.5 h、提取溫度80 ℃、料液比1∶20、提取3次的工藝條件下，多糖得率為13.64%，稍低于本研究中復合酶法提取獲得的金果欖多糖得率。本研究選擇的酶法提取溫度為52 ℃，明顯低于熱水浸提法所需的80 ℃，提取溫度低在多糖成分結(jié)構與活性保持及節(jié)能方面具有一定優(yōu)勢。且酶法提取時間也比水提法明顯縮短，可在一定程度上提高生產(chǎn)效率。

機體多種疾病如炎癥、心腦血管病等的產(chǎn)生均與自由基及其代謝產(chǎn)物誘發(fā)機體氧化損傷有關。鄧曉梅[14]研究指出，金果欖總皂苷對·OH、亞硝酸鹽、O2-·的清除能力隨其濃度增大而遞增。目前有關金果欖多糖抗氧化活性的研究很少見。本研究發(fā)現(xiàn)，金果欖多糖對DPPH自由基、·OH、O2-·均具有較強的清除能力，且濃度與自由基清除能力呈現(xiàn)一定的正相關關系;但與維生素C比較，金果欖多糖對DPPH自由基、·OH、O2-·的清除能力較弱。本研究結(jié)果可為金果欖多糖藥用價值的開發(fā)及其抗氧化活性的深入研究提供一定的依據(jù)。

參考文獻：

[1] 李一圣，李文周，衛(wèi)平，等.不同產(chǎn)地金果欖藥材中古倫賓含量測定[J].藥學研究，2016，35（6）：328-330.

[2] 王柳卜，賈憲生，陳秀芬，等.金果欖二萜類成分色譜及相關藥效學研究[J].中國實驗方劑學雜志，2011，17（15）：83-86.

[3] 葉方，楊光義，王剛.金果欖藥理作用及臨床應用研究綜述[J].中國藥師，2011，14（1）：132-134.

[4] 榮堃，周正祎.周正祎應用金果欖經(jīng)驗[J].中醫(yī)藥通報，2017，16（5）：20-22.

[5] 覃文格，羅試計，楊文進，等.桂西名壯醫(yī)楊順發(fā)應用金果欖治療疾病經(jīng)驗[J].中國民族醫(yī)藥雜志，2017，23（7）：12-14.

[6] 胡彩虹，徐坤，孫靜，等.黃芪多糖對老年糖尿病大鼠糖脂代謝的影響[J].中國老年學雜志，2018，38（6）：1353-1455.

[7] 蔡琨，盧芳國，楊娟，等.仙茅多糖作為流感疫苗佐劑對小鼠巨噬細胞的免疫增強作用[J].中華中醫(yī)藥雜志，2018，33（4）：1344-1347.

[8] 史敏，陳雷，郭曉波，等.茶多糖抗氧化延緩衰老的研究進展[J].中國美容醫(yī)學，2018，27（3）：140-143.

[9] 李雨虹，董文賓，付瑜，等.藥食兩用植物多糖的研究進展[J].食品研究與開發(fā)，2016，37（9）：219-221.

[10] 蔣德旗，黃利敏，王艷，等.響應面優(yōu)化纖維素酶法提取桂花多糖工藝及其抗氧活性研究[J].食品工業(yè)科技，2015，36（2）：271-275.

[11] 楊佳琦，冮潔，冀春陽，等.復合酶法提取云芝多糖及其抗氧化活性[J].食品工業(yè)科技，2017，38（23）：176-181.

[12] 李萍，李衛(wèi)燕，曹蔚.酶解技術在多糖結(jié)構和活性研究中的應用進展[J].西北藥學雜志，2015，30（4）：433-436.

[13] 趙成剛，潘海上，付蓉，等.正交提取金果欖粗多糖的工藝研究[J].科技信息，2013，14（16）：48-49.

[14] 鄧曉梅.金果欖總皂苷抗氧化活性研究[J].湖南文理學院學報：自然科學版，2017，29（2）：32-35.

（收稿日期：2018-07-31）

（修回日期：2018-08-17;編輯：陳靜）