髓系細(xì)胞觸發(fā)受體-1對膿毒癥腸功能障礙大鼠瓜氨酸循環(huán)水平的影響*

沈麗娟,吳錫平,王 倩,孫月雯,關(guān)云艷

(南京中醫(yī)藥大學(xué)無錫附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，江蘇無錫 214071)

膿毒癥時，腸上皮細(xì)胞數(shù)量減少、功能障礙，腸黏膜屏障破壞，腸道菌群移位，引起體內(nèi)促炎性和抗炎性介質(zhì)平衡失調(diào)，導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)，最終造成多器官功能障礙(MODS)，這是膿毒癥發(fā)展過程中的一個主要病理過程[1-2]。髓系細(xì)胞觸發(fā)受體-1 (TREM-1)是一種跨膜糖蛋白，選擇性地表達(dá)于中性粒細(xì)胞和一部分單核細(xì)胞，它是感染性疾病炎癥激發(fā)及級聯(lián)放大的關(guān)鍵介質(zhì)，可以增強(qiáng)炎性反應(yīng)對機(jī)體的影響[3]。但正常腸道固有層巨噬細(xì)胞幾乎不表達(dá)TREM-1，是腸道防止炎性反應(yīng)與組織損傷過強(qiáng)的重要機(jī)制[4]。目前已知TREM-1不僅參與了感染等急性炎性反應(yīng)，同時在腸道急慢性炎癥中也起到了促進(jìn)炎性反應(yīng)和加重組織損傷的作用[4]。因此筆者推測在膿毒癥腸黏膜損傷時腸道TREM-1呈現(xiàn)高表達(dá)，并與腸黏膜的損傷程度相關(guān)。瓜氨酸是一種非蛋白質(zhì)的氨基酸，主要由小腸黏膜上皮細(xì)胞吸收代謝谷氨酰胺產(chǎn)生[5]。前期研究證實(shí)，瓜氨酸可以作為診斷膿毒癥大鼠急性腸功能障礙的有效指標(biāo)[6]。筆者推測腸黏膜組織TREM-1水平與血清瓜氨酸水平呈現(xiàn)相關(guān)性，能反映膿毒癥急性腸功能障礙的程度。本研究通過脂多糖(LPS)構(gòu)建膿毒癥大鼠模型，用TREM-1特異性阻斷劑 LP17人工合成肽阻斷TREM-1，觀察腸黏膜組織TREM-1水平與血清瓜氨酸及腸黏膜組織病理學(xué)改變的關(guān)系，為膿毒癥急性腸功能障礙治療藥物新靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物 選取健康8周齡雄性SD大鼠30只[北京維通利華公司，質(zhì)量合格證：SCXK(京)2012-0001],體質(zhì)量280～300 g。

1.1.2主要儀器 多用脫色搖床SYC-2101(蘇州捷美)，BM450A全自動組織包埋機(jī)(常州派斯杰醫(yī)療)，光學(xué)顯微鏡[日本Olympus公司DX45顯微鏡及其自帶的計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)(DP2-BSW)]，JEM-1010透射電子顯微鏡(日本電子公司)，帶電化學(xué)檢測器的高壓液相色譜儀(HPLC-PED，美國Dionex公司)。1525高效液相色譜儀、2489紫外檢測器(美國Waters公司)，XBridge C18色譜柱(5 μm,4.6×250.0 mm)，Empower2色譜工作站。Elx-800酶聯(lián)免疫分析儀(美國BioTek公司)，LightCycler480基因擴(kuò)增儀(美國BioER公司)。

1.1.3主要試劑 LPS(L2880-100MG，美國Sigma公司)。LP17人工合成肽由上?？齐纳锟萍加邢薰竞铣?，采用Fmoc法經(jīng)去保護(hù)、激活和交聯(lián)、循環(huán)3步合成，序列為LQVTDSGLYRCVIYHPPL，相對分子質(zhì)量2 074.41，HPLC分析其純度為98.22%。腫瘤壞死因子α(TNF-α)和TREM-1 ELISA 試劑盒(上海滬峰化工有限公司，貨號F11310-A、F3151-A)。乳果糖、甘露醇(美國Sigma公司)。蘇木素-伊紅染色試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，Trizol RNA Isolation(美國Invitrogen公司)，SYBR?Premix ExTaq TMⅡ、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒[寶生物工程(大連)有限公司]，引物序列(上海博彩生物技術(shù)有限公司)，TREM-1單克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，編號23400R)。

1.2方法

1.2.1動物模型及分組 雄性SD大鼠30只分為正常組(A組)、模型組(B組)及LP17組(C組),每組10只。模型組及LP17組大鼠腹腔注射4.5 mg/kg LPS進(jìn)行造模[7]。大鼠出現(xiàn)心率加快(為造模前心率2倍)、血壓下降、精神萎靡、少動、豎毛、口鼻分泌物增多等視為造模成功[8]。造模成功后，C組尾靜脈注射TREM-1特異性阻斷劑LP17人工合成肽(24.5 mg/kg)[9]，其余兩組尾靜脈注射等量生理鹽水。實(shí)驗(yàn)期間自由進(jìn)食飲水。72 h后各組大鼠灌胃乳果糖100 mg、甘露醇50 mg混懸液2 mL，放置代謝籠，留取24 h尿液。

1.2.2標(biāo)本采集及檢測 大鼠下腔靜脈取血，將收集的血液標(biāo)本經(jīng)1 000 r/min離心5 min，取上清液，-80 ℃保存，統(tǒng)一檢測。取血后處死，打開腹腔，觀察并記錄腸管顏色，有無水腫、出血、擴(kuò)張及穿孔等情況。取回腸用10%福爾馬林固定，常規(guī)取材，脫水，石蠟包埋，切片經(jīng)HE染色。

1.2.3病理檢測 光學(xué)顯微鏡觀察腸壁絨毛有無水腫，黏膜上皮細(xì)胞有無變性、壞死，黏膜下層、肌層、漿膜層、固有層有無充血、水腫、炎細(xì)胞浸潤。按Chiu氏6級評分[10]評價病變程度，由輕到重依次評為1～5分，無明顯病變?yōu)?分。用圖像分析軟件測量腸壁絨毛長度、黏膜層厚度，求出每只大鼠平均絨毛長度與黏膜層厚度的比值(絨毛長度/黏膜層厚度)。

1.2.4腸黏膜通透性 帶電化學(xué)檢測器的高壓液相色譜儀(HPLC-PED)檢測尿液中乳果糖與甘露醇的濃度[11]，計(jì)算比值(L/M)。淋洗液0.1 mol/L NaOH，流速1.0 mL/min，檢測電極+0.1 V，氧化電極+0.75 V，還原電極-0.01 V，進(jìn)樣量25 μL。

1.2.5血清瓜氨酸水平 運(yùn)用高效液相色譜法檢測[12]，色譜條件：25 mmol/L醋酸銨緩沖(pH6.0):甲醇=90∶10→85∶15(8 min)→55∶45(10 min)→10∶90(10 min)，流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長254 nm，進(jìn)樣量20 μL。

1.2.6血清TNF-α、TREM-1水平 ELISA檢測血清TNF-α、TREM-1水平。具體步驟如下：加樣，加酶標(biāo)液，密封酶標(biāo)板，37 ℃孵育，反復(fù)清洗酶標(biāo)板，吸水紙拍干，加入顯色劑A和顯色劑B，37 ℃下避光反應(yīng)10～15 min，加入終止液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀檢測光密度(OD)值，波長450 nm，根據(jù)檢測結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣本濃度。

1.2.7回腸組織TREM-1 mRNA表達(dá) 將50 mg的冷凍回腸組織按照說明書提取總RNA。-80 ℃保存。采用RT-PCR兩步法進(jìn)行檢測，通過溶解曲線、2%瓊脂糖凝膠電泳確定產(chǎn)物的準(zhǔn)確性，采用Real Time-PCR方法進(jìn)行相對定量，標(biāo)準(zhǔn)化比值計(jì)算公式采用2-△△CT法[13]。以大鼠β-actin作為內(nèi)參基因，檢驗(yàn)所用引物序列見表1。

表1 大鼠回腸目的基因和內(nèi)參基因引物序列

1.2.8免疫組織化學(xué)檢測TREM-1表達(dá) 石蠟切片脫胎換骨蠟、水化，PBS沖洗，加入3%H2O2,室溫孵育10 min,PBS沖洗，抗原修復(fù)，PBS沖洗。滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育30 min，加入TREM-1一抗(1∶500)，4 ℃孵育過夜，PBS沖洗，加入二抗，37 ℃孵育1 h，PBS沖洗。DAB染色2～5 min，顯微鏡下觀察，PBS沖洗10 min，蘇木素復(fù)染2 min，鹽酸酒精分化，自來水沖洗10 min，梯度乙醇脫水、透明、樹膠封片，鏡檢。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠血清TREM-1、TNF-α、瓜氨酸水平 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時，B組大鼠死亡3只，A組與C組無死亡。與A組比較，B組與C組血清TREM-1、TNF-α水平明顯升高(P<0.05)，血清瓜氨酸水平明顯降低(P<0.05)；與B組比較，C組血清TREM-1、TNF-α水平明顯下降(P<0.05)，血清瓜氨酸水平明顯升高(P<0.05)，見表2。3組大鼠血清TREM-1水平與TNF-α呈正相關(guān)(r=0.920,P=0.001)，見圖1。

表2 各組大鼠血清TREM-1、TNF-α、瓜氨酸水平比較

圖1 血清TREM-1與TNF-α的相關(guān)性分析

2.2回腸組織TREM-1 mRNA表達(dá) B組與C組回腸組織TREM-1 mRNA表達(dá)0.56±0.12、0.30±0.09較A組無表達(dá)明顯升高(P<0.05);與B組比較，C組回腸組織TREM-1 mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.05)。

2.3免疫組織化學(xué)檢測回腸組織TREM-1表達(dá) TREM-1陽性表達(dá)呈黃色或棕黃色的染色顆粒，在A組回腸組織中未檢測到TREM-1的表達(dá)，B組與C組回腸組織中有TREM-1表達(dá)，C組表達(dá)量較B組減少，見圖2。

A：A組；B：B組：C：C組

圖2 各組回腸組織TREM-1的表達(dá)(×200)

2.4回腸黏膜形態(tài)及病理學(xué)情況 A組：回腸由黏膜層、黏膜下層、肌層和漿膜層4層結(jié)構(gòu)組成，各層次結(jié)構(gòu)清晰。黏膜層表覆單層柱狀上皮，向腸腔突起形成細(xì)長的絨毛，排列整齊，均無異常。固有層內(nèi)有腸腺，間質(zhì)無水腫。黏膜下層為疏松結(jié)締組織，肌層較厚，漿膜為間皮，單層扁平狀。B組：大部分腸黏膜上皮抬高，絨毛較A組短、寬，向兩側(cè)倒伏，部分絨毛頂端脫落，絨毛頂端上皮下出現(xiàn)囊狀間隙，伴隨毛細(xì)血管充血。少部分出現(xiàn)黏膜層細(xì)長的絨毛，排列整齊，頂端上皮細(xì)胞無明顯變性，無明顯壞死。固有層腺體和間質(zhì)，黏膜下層、肌層無明顯病變。C組：大部分腸黏膜絨毛上皮下間隙輕度擴(kuò)大，伴隨毛細(xì)血管輕度充血。

與A組比較，B組與C組回腸黏膜厚度、絨毛長度明顯降低(P<0.05)，Chiu氏評分明顯升高(P<0.05)；與B組比較，C組回腸黏膜厚度、絨毛長度明顯升高(P<0.05)，Chiu氏評分未見明顯差異(P>0.05)，見表3、圖3。

2.5回腸黏膜通透性改變 B組與C組回腸黏膜通透性3.57±0.38、2.35±0.27較A組0.19±0.02明顯升高(P<0.05)；與B組比較，C組回腸黏膜通透性明顯降低(P<0.05)。

表3 各組回腸黏膜形態(tài)及病理學(xué)比較

A：0分；B：1分；C：2分

圖3 Chiu氏評分情況

圖4 回腸組織TREM-1 mRNA表達(dá)與血清瓜氨酸水

2.6回腸組織TREM-1 mRNA表達(dá)與血清瓜氨酸及Chiu氏評分相關(guān)性分析 B、C組回腸組織TREM-1 mRNA表達(dá)與血清瓜氨酸水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.974,P=0.000)，與Chiu氏評分呈正相關(guān)(r=0.914,P=0.000)，見圖4。

3 討 論

2000年BOUCHON等[3]首次發(fā)現(xiàn)TREM-1為一種跨膜糖蛋白，選擇性地表達(dá)于中性粒細(xì)胞和一部分單核細(xì)胞，是感染性疾病炎癥激發(fā)及級聯(lián)放大的關(guān)鍵介質(zhì)，其可以增強(qiáng)炎性反應(yīng)對機(jī)體的影響[3]。TREM-1與配體結(jié)合后激活下游信號通路，導(dǎo)致細(xì)胞合成TNF-α、白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-8等促炎因子，同時抑制抗炎因子IL-10的合成；而TNF-α、IL-8等可協(xié)助LPS上調(diào)TREM-1的表達(dá)，IL-10則抑制TREM-1的上調(diào)，從而產(chǎn)生激發(fā)和放大炎性反應(yīng)的惡性循環(huán)[14]。研究顯示，膿毒癥時所有效應(yīng)細(xì)胞的TREM-1均呈現(xiàn)特異性的高表達(dá)，且細(xì)胞表面的TREM-1表達(dá)明顯增高[15]。本研究與上述研究結(jié)果一致，膿毒癥大鼠血清TREM-1明顯升高，并與TNF-α呈正相關(guān)，證實(shí)TREM-1參與膿毒癥的發(fā)生、發(fā)展過程。

正常腸道固有層巨噬細(xì)胞幾乎不表達(dá)TREM-1，是腸道防止炎性反應(yīng)與組織損傷過強(qiáng)的重要機(jī)制[4]。研究發(fā)現(xiàn)，TREM-1不僅參與了感染等急性炎性反應(yīng)，同時在腸道急慢性炎癥中也起到了促進(jìn)炎性反應(yīng)和加重組織損傷的作用[4]。有報(bào)道，重癥胰腺炎大鼠腸組織內(nèi)TREM-1高表達(dá)，促進(jìn)炎癥介質(zhì)釋放和腸黏膜屏障功能障礙，促進(jìn)炎癥因子釋放，導(dǎo)致SIRS，誘發(fā)和加重 MODS[16]。抑制腸巨噬細(xì)胞TREM-1的表達(dá)可減輕氧化應(yīng)激對腸黏膜屏障的損傷[17]。膿毒癥時，腸上皮細(xì)胞凋亡增加，細(xì)胞數(shù)量減少，腸上皮細(xì)胞功能障礙，腸黏膜屏障破壞，腸道菌群失調(diào)，腸道免疫功能受損，導(dǎo)致腸腔內(nèi)毒素入血，引起炎癥介質(zhì)釋放增多，使腸黏膜屏障進(jìn)一步受損，大量細(xì)菌和毒素易位，引起體內(nèi)促炎性和抗炎性炎癥介質(zhì)平衡失調(diào)，導(dǎo)致惡性循環(huán)，加重SIRS，最終導(dǎo)致MODS[1-2]。本研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥時腸黏膜絨毛長度及黏膜層厚度降低，通透性增加，回腸組織TREM-1呈現(xiàn)高表達(dá)，并與腸黏膜的損傷程度相關(guān)，提示TREM-1參與了膿毒癥腸功能障礙的發(fā)生、發(fā)展。

瓜氨酸是一種非蛋白質(zhì)的氨基酸，主要由小腸黏膜上皮細(xì)胞吸收、代謝谷氨酰胺而產(chǎn)生[18]。瓜氨酸被釋放入肝門靜脈系統(tǒng)，但肝組織對瓜氨酸沒有首過效應(yīng)，肝臟中的瓜氨酸絕大部分被腎臟攝取后代謝為精氨酸[18]。研究發(fā)現(xiàn)，血清瓜氨酸水平能反映諸多小腸疾病(如短腸綜合征、放射性腸炎、克羅恩病)患者小腸黏膜上皮細(xì)胞的數(shù)量[7]。前期研究證實(shí)，血清瓜氨酸水平能夠反映膿毒癥腸黏膜上皮細(xì)胞的數(shù)量和功能[19]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，急性腸功能損傷的危重癥患者血清瓜氨酸水平降低,是死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥大鼠血清瓜氨酸水平降低，并與回腸組織TREM-1 mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，給予膿毒癥大鼠尾靜脈注射TREM-1特異性阻斷劑LP17人工合成肽后，回腸組織TREM-1 mRNA表達(dá)有所降低，腸黏膜損傷程度減輕，同時血清瓜氨酸水平有所升高，提示TREM-1能夠影響膿毒癥血清瓜氨酸水平，進(jìn)一步證實(shí)TREM-1在膿毒癥腸急性功能障礙中有重要意義。

TREM-1是感染性疾病炎癥激發(fā)及級聯(lián)放大的關(guān)鍵介質(zhì)，TREM-1能夠影響膿毒癥血清瓜氨酸水平，反映膿毒癥急性腸功能障礙的程度。驗(yàn)證了TREM-1作為膿毒癥急性腸功能障礙分子治療靶點(diǎn)的價值，找到抑制TREM-1活性的藥物為改善膿毒癥急性腸功能障礙患者的預(yù)后提供了新的思路和有效的治療策略，這將成為下一步研究的重要方向。