IL-1β介導(dǎo)膿毒癥大鼠血管α1腎上腺素能受體失敏機(jī)制的研究*

梁家林，劉良明，董 惠

(1.空軍杭州特勤療養(yǎng)中心，杭州 310013；2.陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所二室/創(chuàng)傷、燒傷與復(fù)合傷國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400042；3.陸軍軍醫(yī)大學(xué)免疫研究所，重慶 400038)

盡管研究不斷深入，但膿毒癥發(fā)病率和病死率始終居高不下[1]，血管低反應(yīng)性(即血管對(duì)血管活性物質(zhì)的反應(yīng)性降低)是致使其高病死率的重要原因[2]。

研究證實(shí)，白細(xì)胞介素(IL)-1β介導(dǎo)膿毒癥血管低反應(yīng)性發(fā)生，含NO依賴和非依賴性機(jī)制[3]，但針對(duì)上述機(jī)制進(jìn)行糾正卻只能部分恢復(fù)血管反應(yīng)性[4-5]，提示可能存在其他機(jī)制。基于α1腎上腺素能受體(α1ARs)在心血管系統(tǒng)中的重要作用，目前認(rèn)為α1ARs失敏(主要是表達(dá)下降)是導(dǎo)致膿毒癥后難治性低血壓發(fā)生的重要原因[6]。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)IL-1β能通過(guò)JAK2-STAT3途徑介導(dǎo)膿毒癥休克家兔血管α1ARs失敏[7]。另有研究顯示，IL-1β通過(guò)核因子-κB(NF-κB)途徑在轉(zhuǎn)錄而不是轉(zhuǎn)錄后水平降低小鼠血管α1ARs的表達(dá)[8]。由于α1ARs的表達(dá)調(diào)控具有種屬和組織的差異性[9]，多種屬作用機(jī)制的研究有利于闡述其詳細(xì)作用機(jī)制，本文重點(diǎn)研究IL-1β對(duì)膿毒癥大鼠α1ARs的表達(dá)調(diào)控機(jī)制。

目前已經(jīng)克隆出大鼠血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)的α1ARs各亞型(α1AAR、α1BAR、α1DAR)的啟動(dòng)子區(qū)域，其中相同的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合區(qū)域僅有Sp1和AP2[10-12]。筆者前期研究顯示：IL-1β對(duì)VSMCs α1ARs各亞型表達(dá)均有類(lèi)似幅度的下調(diào)作用[7]，推測(cè)IL-1β可能通過(guò)Sp1和AP2在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控VSMCs α1ARs表達(dá)，另外也研究IL-1β是否通過(guò)改變?chǔ)?ARs mRNA半衰期在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控VSMCs α1ARs表達(dá)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 體質(zhì)量(200±10)g的SPF級(jí)健康成年雌性SD大鼠由陸軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，通過(guò)陸軍軍醫(yī)大學(xué)倫理委員會(huì)審批。

1.2主要試劑與儀器 重組大鼠IL-1β(美國(guó)Pepro Tech公司)，兔抗大鼠α1AAR抗體(美國(guó)Epitomics公司)，山羊抗大鼠α1BAR、α1DAR抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)，兔抗大鼠Sp1、AP2抗體(美國(guó)Pierce公司)，放線菌素D(美國(guó)Invitrogen公司)，X-tremeGENE HP DNA 轉(zhuǎn)染試劑(美國(guó)Roche公司)，雙螢光素酶定量試劑盒(美國(guó)Gene Copoeia公司)，Power Lab八道生理記錄儀(澳大利亞AD Instrument公司)，垂直板狀電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司)，CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)SHEL/JB公司)，ABI Prism 7700(美國(guó)Perkin Elmer公司)。

1.3方法

1.3.1膿毒癥模型的復(fù)制及指標(biāo)檢測(cè) 將32只大鼠分為假手術(shù)組、經(jīng)盲腸結(jié)扎穿孔(CLP)3 h組、CLP 6 h組及CLP 12 h組，每組8只。采用CLP復(fù)制膿毒癥模型，手術(shù)操作、分組處理和血管環(huán)制作同文獻(xiàn)[13]，測(cè)定各組血管環(huán)的α1ARs敏感性[對(duì)去氧腎上腺素(PE)的反應(yīng)性][7]；另游離出各組腸系膜上動(dòng)脈(SMAs)分支，用RIPA裂解液提取其總蛋白，用蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測(cè)α1ARs、β-actin表達(dá)。分析上述指標(biāo)與IL-1β濃度的關(guān)系。

1.3.2IL-1β對(duì)大鼠VSMCs α1ARs、Sp1、AP2表達(dá)水平的影響 原代培養(yǎng)SMAs來(lái)源的VSMCs[13]，實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、1 ng/mL IL-1β組、10 ng/mL IL-1β組和100 ng/mL IL-1β組，每組4瓶細(xì)胞。IL-1β孵育VSMCs方法同文獻(xiàn)[13]，用RIPA裂解液提取各組細(xì)胞的總蛋白，用Western blot檢測(cè)α1ARs、Sp1、AP2、β-actin表達(dá)。

1.3.3IL-1β對(duì)大鼠VSMCs α1ARs mRNA半衰期的影響 IL-1β孵育VSMCs方法同前，在對(duì)照組或100 ng/mL IL-1β孵育12 h后加入放線菌素D(終濃度為4 μg/mL)[14]，依次加入放線菌素D后0、2、4、6 h后Realtime-PCR檢測(cè)α1ARs mRNA表達(dá)水平。所得Cq值結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線得到各組的量。引物序列見(jiàn)表1。

1.3.4Sp1和AP2 siRNA對(duì)大鼠VSMCs α1ARs表達(dá)的影響 實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、FAM siRNA(陰性對(duì)照)組、AP2γ siRNA組、AP2α siRNA組、Sp1 siRNA組，每組4瓶細(xì)胞。細(xì)胞準(zhǔn)備：取融合度40%左右的原代培養(yǎng)的大鼠VSMCs，PBS清洗2次，加入1 800 μL含20%胎牛血清的DMEM F/12培養(yǎng)基。配制轉(zhuǎn)染復(fù)合物：193 μL DMEM F/12培養(yǎng)基，2 μL X-tremeGENE HP DNA，5 μL 20 mol/L的siRNA溶液(空白對(duì)照組加入5 μL無(wú)酶水)，室溫混勻放置15 min。孵育細(xì)胞：將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入各組細(xì)胞后細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，RIPA裂解液提取各組總蛋白，Western blot檢測(cè)Sp1、AP2、β-actin及α1ARs表達(dá)水平。Sp1：正義siRNA 5′-GGA GCG AUC AUC UGU CAA ATT-3′，反義siRNA 5′-UUU GAC AGA UGA UCG CUC CTT-3′；AP2γ：正義siRNA 5′-UGU CAC CAC CGG AAU GCU UTT-3′，反義siRNA 5′-AAG CAU UCC GGU GGU GAC ATT-3′；AP2α：正義siRNA 5′-GGA GAG CGA AGU CUA AGA ATT-3′，反義siRNA 5′-UUC UUA GAC UUC GCU CUC CTT-3′；FAM：正義siRNA 5′-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3′，反義siRNA 5′-ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT-3′。

1.3.5IL-1β對(duì)大鼠VSMCs α1DAR啟動(dòng)子活性的影響 實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組和100 ng/mL IL-1β 組，每組6瓶細(xì)胞?？寺ˇ?DAR啟動(dòng)子并構(gòu)建入質(zhì)粒(GeneCopoeia公司代做)，擴(kuò)增質(zhì)粒，用X-tremeGENE HP DNA轉(zhuǎn)染試劑將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入VSMCs(轉(zhuǎn)染方法基本同1.3.4)，加入100 ng/mL(終濃度)IL-1β孵育，對(duì)照組僅加入轉(zhuǎn)染試劑，24 h后吸取兩組培養(yǎng)基，dual luciferase assay試劑盒按說(shuō)明書(shū)操作檢測(cè)兩組培養(yǎng)基

表1 引物序列

與Gaussia螢光素酶(gaussia luciferase,GLUC)和分泌性堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,SEAP)反應(yīng)產(chǎn)生的光強(qiáng)度，GLUC/SEAP光強(qiáng)度即為啟動(dòng)子活性。

2 結(jié) 果

2.1膿毒癥大鼠α1ARs敏感性和各亞型蛋白表達(dá)及與血清IL-1β的關(guān)系 與假手術(shù)組相比，在CLP后3、6和12 h，大鼠SMAs的α1ARs敏感性和各亞型蛋白表達(dá)均明顯降低(P<0.05)，見(jiàn)圖1。筆者前期研究結(jié)果顯示血漿IL-1β水平在CLP后6 h明顯升高，相關(guān)性分析顯示其與同時(shí)期SMAs的α1ARs敏感性及蛋白表達(dá)水平呈明顯負(fù)相關(guān)(r=-0.823、-0.864，P<0.05)。

a：P<0.05，與假手術(shù)組比較

圖1 膿毒癥大鼠α1ARs敏感性和蛋白表達(dá)變化

2.2IL-1β對(duì)大鼠VSMCs α1ARs、AP2和Sp1表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比，各濃度IL-1β組大鼠VSMCs α1ARs各亞型的蛋白表達(dá)均明顯降低(P<0.05)，而且呈濃度依賴性降低。各濃度IL-1β均能明顯降低AP2和Sp1表達(dá)(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

2.3IL-1β對(duì)大鼠VSMCs α1ARs mRNA穩(wěn)定性及啟動(dòng)子活性的影響 與對(duì)照組比較，100 ng/mL IL-1β組大鼠VSMCs α1ARs各亞型的mRNA穩(wěn)定性無(wú)明顯改變(P>0.05)。100 ng/mL IL-1β能明顯降低大鼠VSMCs α1DAR啟動(dòng)子活性(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

a：P<0.05，與對(duì)照組比較

圖2 IL-1β對(duì)大鼠VSMCs α1ARs、AP2和Sp1表達(dá)的影響

2.4Sp1和AP2對(duì)大鼠VSMCs α1ARs表達(dá)的影響 空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組間α1ARs表達(dá)無(wú)明顯差異(P>0.05)。與空白對(duì)照組或陰性對(duì)照組相比，Sp1 siRNA、AP2α siRNA和AP2γ siRNA組均能明顯降低VSMCs α1ARs各亞型的蛋白表達(dá)(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

a：P<0.05，與對(duì)照組比較

圖3 IL-1 對(duì)大鼠VSMCs α1ARs mRNA穩(wěn)定性及α1DAR啟動(dòng)子活性的影響

a：P<0.05，與空白對(duì)照組比較;b：P<0.05，與陰性對(duì)照組比較

圖4 Sp1、AP2 siRNA對(duì)大鼠VSMCs α1ARs表達(dá)的影響

3 討 論

盡管對(duì)膿毒癥的認(rèn)知水平有明顯提高，但在全球范圍內(nèi)，其發(fā)病率、病死率均較高。鑒于α1ARs在心血管系統(tǒng)中的重要作用，它在膿毒癥的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸中具有重要地位。

研究顯示膿毒癥時(shí)存在血管α1ARs失敏，主要是受體減少，親和力無(wú)明顯改變[8]。體內(nèi)外研究均顯示IL-1β能下調(diào)膿毒癥時(shí)血管α1ARs表達(dá)量[6-7]，但是對(duì)其調(diào)控機(jī)制目前不甚清楚。

本研究通過(guò)CLP復(fù)制膿毒癥大鼠模型，整體水平驗(yàn)證膿毒癥時(shí)存在α1ARs失敏且與IL-1β相關(guān)。結(jié)果顯示CLP 3 h后即存在α1ARs失敏和表達(dá)量進(jìn)行性下降，但α1ARs親和力無(wú)明顯改變，而血漿IL-1β卻在CLP 6 h后開(kāi)始升高[13]。IL-1β濃度升高晚于α1ARs失敏，可能因?yàn)槟摱景Y早期其他細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子α(TNF-α)對(duì)α1ARs失敏也有作用。而在IL-1β升高后α1ARs進(jìn)一步失敏，相關(guān)性分析顯示二者存在明顯負(fù)相關(guān)。為排除膿毒癥時(shí)其他細(xì)胞因子的干擾，筆者在離體時(shí)采用重組大鼠IL-1β孵育大鼠VSMCs，觀察其對(duì)α1ARs表達(dá)的影響。結(jié)果顯示IL-1β能明顯降低α1ARs各亞型的表達(dá)。整體和離體水平驗(yàn)證了IL-1β通過(guò)下調(diào)α1ARs各亞型的表達(dá)介導(dǎo)膿毒癥α1ARs失敏的發(fā)生。

盡管已有研究顯示IL-1β通過(guò)下調(diào)小鼠血管α1ARs啟動(dòng)子活性在轉(zhuǎn)錄而不是轉(zhuǎn)錄后水平下調(diào)α1ARs的表達(dá)。但現(xiàn)有研究提示α1ARs各亞型的表達(dá)、分布和調(diào)控機(jī)制具有種屬和組織的差異性，IL-1β對(duì)小鼠的作用機(jī)制是否適用于大鼠甚至人類(lèi)，目前不得而知。通過(guò)運(yùn)用轉(zhuǎn)錄抑制劑(放線菌素D)，發(fā)現(xiàn)IL-1β并不能改變大鼠VSMCs α1ARs各亞型 mRNA的半衰期，提示IL-1β也可能是通過(guò)轉(zhuǎn)錄而不是轉(zhuǎn)錄后介導(dǎo)大鼠血管α1ARs表達(dá)下降。為驗(yàn)證這一結(jié)論，筆者隨機(jī)選擇檢測(cè)α1DAR啟動(dòng)子活性，結(jié)果顯示IL-1β能明顯下調(diào)大鼠VSMCs α1DAR啟動(dòng)子活性，盡管沒(méi)有檢測(cè)α1AAR和α1BAR啟動(dòng)子活性，但仍然可以得到IL-1β通過(guò)轉(zhuǎn)錄水平介導(dǎo)大鼠VSMCs α1ARs表達(dá)下降這一結(jié)論。

目前α1ARs各亞型在大鼠VSMCs的啟動(dòng)子區(qū)域已經(jīng)克隆出來(lái)， α1AAR主要有Sp1、NF-κB、NF/IL-6、AP1、CTF/NF1、AP2等轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合區(qū)域[10]，α1BAR主要有Sp1、HNF-1/5、AP2、NF1、CREB、CP1等的結(jié)合區(qū)域[11]，而α1DAR則主要有Sp1和AP2的結(jié)合區(qū)域[12]。它們都有Sp1和AP2的結(jié)合區(qū)域，上述結(jié)果提示IL-1β對(duì)大鼠VSMCs α1ARs各亞型的表達(dá)存在相同的下調(diào)作用，且下調(diào)趨勢(shì)基本一致，為此筆者推測(cè)IL-1β可能通過(guò)相同的轉(zhuǎn)錄因子(Sp1和AP2)發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。筆者檢測(cè)了IL-1β對(duì)大鼠VSMCs Sp1和AP2表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)IL-1β能明顯降低Sp1和AP2的蛋白表達(dá)。Sp1和AP2的蛋白表達(dá)下調(diào)是否引起α1ARs的表達(dá)下降呢？通過(guò)運(yùn)用Sp1和AP2(含AP2α和AP2γ)siRNA，發(fā)現(xiàn)Sp1和AP2表達(dá)下降使得α1ARs各亞型表達(dá)下降。由于α1AAR和α1BAR還有其他轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合區(qū)域，也可能在IL-1β介導(dǎo)的膿毒癥大鼠血管α1ARs失敏中發(fā)揮作用。鑒于本研究得出Sp1和AP2在膿毒癥大鼠血管α1ARs失敏中的重要作用，值得進(jìn)一步的研究，未來(lái)可以考慮作為膿毒癥的治療靶點(diǎn)。

綜上所述，IL-1β可能通過(guò)下調(diào)大鼠VSMCs 的Sp1和AP2表達(dá)，在轉(zhuǎn)錄而不是轉(zhuǎn)錄后水平下調(diào)α1ARs表達(dá)，介導(dǎo)膿毒癥大鼠血管α1ARs失敏的發(fā)生。