運用無標記定量蛋白質(zhì)組學技術(shù)分析AURKB介導骨肉瘤惡性表型的分子機制

皮聞森，劉家明，黃山虎

(南昌大學第一附屬醫(yī)院骨科 330006)

骨肉瘤(osteosarcoma,OS)是最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤，多發(fā)于兒童和青少年。雖然新輔助化療藥物使用后患者生存率有所提高(55%～80%)，但是5年生存率未見提高。并且發(fā)生肺部轉(zhuǎn)移的患者5年生存率低于20%，肺轉(zhuǎn)移是OS患者的主要死亡原因[1]。因此，闡明OS轉(zhuǎn)移的分子機制為骨肉瘤轉(zhuǎn)移的防治提供有效的策略及靶點，提高生存率是非常必要的。研究表明AURKB 在多種惡性腫瘤中高表達與腫瘤發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[2]。筆者前期研究表明AURKB高表達與OS肺部轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，并促進OS細胞增殖、遷移及侵襲[3]。然而，AURKB促進OS細胞增殖、遷移及侵襲的分子機制尚不清楚。本研究采用慢病毒轉(zhuǎn)染、無標記定量蛋白質(zhì)組學技術(shù)篩選差異表達蛋白，結(jié)合生物信息學分析，預(yù)測AURKB促進OS惡性表型的關(guān)鍵蛋白和潛在的分子調(diào)控機制，為進一步探討AURKB促進OS轉(zhuǎn)移分子機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1實驗材料 人OS細胞143B購自中國科學院上海細胞庫,AURKB-shRNA慢病毒(Lv-shAURKB)和陰性對照慢病毒(Lv-negative)購于上海吉凱基因化學技術(shù)有限公司。cDNA 第一鏈合成試劑盒及 PCR 試劑盒購于天根生化科技(北京)有限公司?？偟鞍滋崛≡噭┖?BB-3101)購自上海BestBio公司。凝膠制備試劑盒(AR018)購自武漢博士德生物技術(shù)公司。AURKB 單克隆抗體(兔抗人)購自美國Abcam公司。β-actin 單克隆抗體(鼠抗人)、HRP標記山羊抗兔多克隆抗體和HRP標記山羊抗鼠多克隆抗體購自北京中杉金橋公司。高分辨質(zhì)譜儀Q-Exactive和液相色譜均購自美國Thermo Fisher公司。

1.2方法

1.2.1細胞轉(zhuǎn)染 細胞分組：D組為Lv-shAURKB轉(zhuǎn)染細胞組，C組為陰性對照組(轉(zhuǎn)染Lv-negative)。按照上海吉凱基因化學技術(shù)有限公司提供的慢病毒轉(zhuǎn)染說明書進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前1天以2×104/mL細胞懸液接種6孔板，每孔總體積為2 mL，在 5% CO2，37 ℃條件下培養(yǎng)。依照感染復(fù)數(shù)50，每組3個孔，鋪板24 h后，分別加入Lv-shAURKB慢病毒和 Lv-negative慢病毒 2 μL，混勻后繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后 12 h換DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)。感染48 h后觀察慢病毒侵染結(jié)果，消化轉(zhuǎn)移細胞至50 mL培養(yǎng)瓶中，以含0.25 μg/mL嘌呤霉素的DMEM完全培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)2周，得到穩(wěn)定細胞系。不同時間重復(fù)實驗3次。

1.2.2蛋白質(zhì)譜

1.2.2.1蛋白還原烷基化及酶解上機 用細胞刮刀刮取收集細胞，加入裂解液苯甲基磺酰氟(PMSF)，超聲3 min后于冰上裂解30 min。高速離心15 min(4 ℃,15 000 r/min)，取上清。蛋白采用500 mmol/L三乙胺碳酸(TEAB)緩沖液重溶。使用BCA蛋白試劑盒測定上清液中的蛋白濃度，隨后將各個樣品100 μg轉(zhuǎn)移到新試管中，用8 mol/L 尿素調(diào)至100 μL定容。加入11 μL 1× MDTT并在37 ℃下溫育1 h，然后將樣品加到10 K超濾管14 000×g離心10 min后,加入120 μL 55 mmol/L碘乙酰胺，在室溫下避光溫育20 min。在超濾管中用100 mmol/L TEAB 連續(xù)離心3次置換Urea 體系后，用1∶50的胰蛋白酶酶解過夜。

1.2.2.2液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜(LC-MS/MS)上機測定 將凍干后的肽段重溶于30 μL溶劑A(A:0.1%甲酸水溶液)后用nano-LC分離，經(jīng)在線電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜分析。實驗在Nano ACQUITY UPLC系統(tǒng)(Waters Corporation公司,Milford,MA，美國)上進行，系統(tǒng)連接裝有在線Nano電噴霧離子源的Q-Exactive 質(zhì)譜儀(Thermo Fisher Scientific,MA,美國)。10 μL肽段樣品以10 μL/min流量上樣到捕集柱(Thermo Scientific Acclaim PepMap C18,100 μm × 2 cm)，隨后在分析柱(Acclaim PepMap C18,75 μm × 15 cm)中以線性梯度分離120 min內(nèi)3% B至32% B(B:0.1%甲酸ACN溶液)。柱子在初始條件下平衡10 min。柱流量控制在300 μL/min，電噴霧電壓2 kV。Q-Exactive質(zhì)譜儀在數(shù)據(jù)依賴采集模式下運行，自動在MS和MS/MS采集間切換。在70 K質(zhì)量分辨率下獲得全掃描譜圖(m/z 300～1 800)，隨后在17.5 K分辨率下進行后續(xù)HCD MS/MS掃描。動態(tài)排除時間10 s。

1.2.2.3數(shù)據(jù)庫的檢索 串聯(lián)質(zhì)譜圖經(jīng)過PEAKS Studio version 8.5(Bioinformatics Solutions公司,Waterloo,加拿大)分析。PEAKS DB對swiss prot-human數(shù)據(jù)庫(ver.201604,20191 entries)搜庫，設(shè)置胰蛋白酶酶解。搜庫參數(shù)碎片離子質(zhì)量容許誤差：0.05，母離子質(zhì)量容許誤差：7 ppm，最大漏切數(shù)：2，固定修飾：Carbamidomethylation 57.02，可變修飾：Oxidation(M)15.99，Deamidation(NQ)0.98，Acetylation(Protein N-term)42.01。肽段經(jīng)過1% FDR 和 1 unique peptide質(zhì)控過濾。篩選差異倍數(shù)1.5以上，具有2條unique 肽段，根據(jù)ANOVA算法取P<0.05的蛋白作為差異蛋白。

1.2.3生物信息分析 使用pheatmap軟件(https://CRAN.R-project.org/ package=pheatmap)完成構(gòu)建聚類分析熱圖，使用ggplot2軟件(http://ggplot2.org)構(gòu)建火山圖，運用Blast2GO v.4進行GO功能分析，差異蛋白的功能統(tǒng)計使用Fisher′s精確測試進行檢驗計算。運用 KOBAS(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/)進行KEGG通路富集分析，并使用STRING分析構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。聚類分析是一組將研究對象分為相對同質(zhì)的群組的統(tǒng)計分析技術(shù),分析通過pheatmap軟件生成聚類熱圖。火山圖是在x,y軸上表示倍數(shù)變化及P值的散點圖，根據(jù)顯著性變化的閾值為分界線可以看出數(shù)據(jù)分布情況。

2 結(jié) 果

2.1聚類熱圖和火山圖 慢病毒轉(zhuǎn)染后收集細胞經(jīng)無標記定量蛋白組學技術(shù)處理，共篩選到了105個差異表達蛋白，見圖1。

A：聚類熱圖；B:火山圖

圖1 聚類熱圖和火山圖

2.2GO分析結(jié)果 共計生物學過程773條，細胞組成156條，分子功能122條。前20個條目差異蛋白主要參與單生物體細胞器組織和細胞骨架組織的生物學過程；發(fā)揮RNA結(jié)合和肌動蛋白依賴性ATP酶活性的分子功能；主要定位于細胞質(zhì)和膜界限的細胞器。見圖2。

2.3KEGG分析 KEGG分析顯示涉及150條，前20個條目見表1。差異蛋白富集的主要信號通路有肌動蛋白細胞骨架的調(diào)節(jié)、局部黏著和RNA運輸?shù)取?/p>

表1 KEGG分析結(jié)果(前20條信號通路)

2.4PPI網(wǎng)絡(luò)圖 以degree≥9篩選節(jié)點蛋白，即核心蛋白。顯示的核心蛋白有：ACTN4(degree=9)、TPR(degree=9)和ACLY(degree=16)。若刪除這些核心蛋白后，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性降低。見圖3。

圖3 差異蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

3 討 論

無標記定量蛋白質(zhì)組學技術(shù)應(yīng)用于各種癌癥的研究[4],發(fā)現(xiàn)了與癌癥相關(guān)的蛋白，可用于癌癥的診斷、治療和預(yù)防，同時闡明癌癥發(fā)生的分子機制，讓人們從致病機制上認識癌癥，理解其致病的分子網(wǎng)絡(luò)圖。本研究將無標記定量蛋白組學技術(shù)用于OS中單個癌基因AURKB介導OS惡性表型的研究。共鑒定到105個差異表達蛋白，在PPI網(wǎng)絡(luò)圖中，核心蛋白包括ACTN4、TRP和ACLY。從GO分析和KEGG通路富集分析的結(jié)果來看，差異蛋白主要參與細胞骨架調(diào)節(jié)的生物學過程和起到調(diào)節(jié)肌動蛋白依賴性ATP酶活性的分子功能，主要富集的通路為肌動蛋白細胞骨架的調(diào)節(jié)。

細胞骨架是細胞內(nèi)不同蛋白質(zhì)纖維的聚合物和各種調(diào)控蛋白交錯連接的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，在維持真核細胞的形態(tài)、胞內(nèi)運輸和變形運動等方面發(fā)揮著重要作用。腫瘤細胞與正常細胞的細胞骨架有明顯的差異,細胞骨架的異常改變已成為反映腫瘤細胞的惡性生物學行為的特征之一。細胞骨架的重組影響著細胞的遷移，而腫瘤細胞遷移能力是其轉(zhuǎn)移主要因素之一[5]。差異蛋白中涉及細胞骨架調(diào)節(jié)的有ACTN4、PFN、MLC、PPP1R12A等，其中ACTN4是PPI網(wǎng)絡(luò)圖中的核心蛋白。ACTN4是一 種 非 肌 肉 的 細 胞 骨 架 蛋 白,參與細胞骨架重組，細胞質(zhì)分裂，調(diào)節(jié)細胞黏附及形態(tài)，與多種腫瘤細胞的侵襲、遷移有關(guān)，包括乳腺癌細胞[6]和肝癌細胞[7]等。在肌動蛋白細胞骨架的調(diào)節(jié)通路中，ACTN4的激活與Rho/ROCH的活性有關(guān)[8]。Rho是一種的GTP酶，屬于Rho-GTPase家族，而Rho GTPases家族是Ras超家族的一個亞家族，也是細胞骨架調(diào)節(jié)通路中的一部分[9]。因此，筆者推測AURKB可能通過Rho/ROCH-ACTN4信號通路介導骨肉瘤的侵襲、遷移。

ACLY是ATP檸檬酸裂解酶,是脂肪酸生物合成過程中的關(guān)鍵酶，是糖代謝和脂肪酸合成的連接點。ACLY 位于脂質(zhì)代謝通路最上游，其催化產(chǎn)生的乙酰 CoA 是合成脂肪酸和膽固醇等脂類物質(zhì)的主要原料，能提高脂肪酸合成酶(FASN)的活性[10]。下調(diào)ACLY表達能抑制腫瘤細胞的增殖[11]。據(jù)報道，ACLY受到PI3K-Akt信號通路的調(diào)控，Akt還能通過激活膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白 1(SREBP-1)上調(diào)ACLY mRNA水平[12]。SREBP-1是脂質(zhì)代謝重要的核轉(zhuǎn)錄因子之一,主要調(diào)控脂肪酸、三酰甘油和膽固醇的生物合成[13]。另外，SREBP-1能夠與FASN啟動子上的SREBP結(jié)合位點E-box序列強烈結(jié)合，通過 Akt-(SREBP-1)-FASN 信號通路使得FASN的表達增加[14]。筆者前期的研究已經(jīng)證實抑制FASN可通過PI3K/Akt信號通路降低OS細胞的惡性表型[15]，相反，Akt的抑制亦能降低FASN的活性[16]。目前的研究并未證實AURKB與FASN之間是否存在相關(guān)性。因此，筆者推測ACLY可能是AURKB與FASN協(xié)同調(diào)控的連接點,AURKB可能通過PI3K/Akt-(SREBP-1)-ACLY/FASN信號通路介導骨肉瘤的惡性表型。

TRP是一種瞬時受體電位陽離子通道蛋白，是一種參與離子轉(zhuǎn)運的蛋白質(zhì)。TRP通道可以作為細胞內(nèi)外刺激，諸如缺氧等的傳感器和效應(yīng)器，從而介導相應(yīng)的細胞反應(yīng)，這些細胞反應(yīng)常常涉及升高的遷移活性和/或細胞因子的產(chǎn)生和分泌[17]。TRP參與了多種腫瘤細胞的遷移和侵襲，包括胃癌[18]和前列腺導管癌[19]等。研究報道，TRP通過ERK/NF-κβ介導腫瘤細胞惡性表型，通過ERK介導capase-3級聯(lián)反應(yīng)拮抗細胞凋亡[20]。但是TRP在OS中的作用機制未見相關(guān)報道。筆者推測TRP/ERK/NF-κβ信號通路可能同樣在AURKB介導OS的侵襲、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用，但有待后續(xù)實驗進一步研究。

綜上所述，AURKB可能通過3條信號通路介導骨肉瘤惡性表型，即：Rho/ROCH-ACTN4信號通路、PI3K/Akt-(SREBP-1)-ACLY/FASN信號通路和TRP/ERK/NF-κβ信號通路。本研究為進一步研究AURKB促進OS惡性表型的分子機制提供了方向。盡管無標記定量蛋白組學技術(shù)有助于豐富和識別與疾病有關(guān)的機制，然而這些關(guān)鍵基因的確切功能還需要今后更大樣本量的實驗研究。