靶向納米探針在結(jié)直腸癌干細(xì)胞熒光成像及光熱治療中的研究

曹 永，呂 強(qiáng)，孫迎燕，高曉虹

(1.遵義醫(yī)學(xué)院法醫(yī)病理教研室,貴州遵義 563099；2.牡丹江醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥研究中心，黑龍江牡丹江 157011；3.牡丹江醫(yī)學(xué)院紅旗醫(yī)院超聲科，黑龍江牡丹江 157011；4.牡丹江醫(yī)學(xué)院生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江牡丹江 157011)

腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cell,CSC)概念是MACKILLOP等[1]于1983年提出,認(rèn)為CSC是維持腫瘤生長(zhǎng)的核心，是腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的根源。LAPIDOT等[2]于1994年將急性髓性白血病中CD34+CD38-的瘤細(xì)胞接種到非肥胖糖尿病/重癥聯(lián)合免疫(NOD/SCID)小鼠體內(nèi)時(shí)能形成腫瘤，進(jìn)而證實(shí)CSC的存在。隨后，證實(shí)CSC是腫瘤組織內(nèi)具有自我更新和異體種植成瘤能力的一小群細(xì)胞[3-4]，如在乳腺癌、結(jié)腸癌等中均分離出CSC[2-4]。眾多學(xué)者認(rèn)為腫瘤侵襲由少數(shù)具有特殊表型的細(xì)胞做誘發(fā)，這些細(xì)胞具有與CSC相似的特性[5-6]。目前，諸多研究已證實(shí)CD44可以參與細(xì)胞間的信號(hào)傳導(dǎo)，并與腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移及造血干細(xì)胞的歸巢等密切相關(guān)。在胃癌、結(jié)腸癌、肝癌等中普遍存在CD44v6表達(dá)失控，CD44v6高表達(dá)與腫瘤進(jìn)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后等過(guò)程有關(guān)[7]。然而，關(guān)于CD44在結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用仍未明確。而上轉(zhuǎn)換納米粒子(up-conversion nanoparticles,UCNPs)具有生物安全性高、抗光漂白作用強(qiáng)、發(fā)光穩(wěn)定性好，且易與抗體相耦聯(lián)等優(yōu)點(diǎn)。因此，本實(shí)驗(yàn)擬構(gòu)建CD44v6功能化UCNPs探針，并將其應(yīng)用于體外結(jié)直腸癌CSC的熒光成像及光熱治療，為結(jié)直腸癌的早期診斷及治療提供一定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器 六水硝酸釔[Y(NO3)3·6H2O]、六水硝酸鐿[Yb(NO3)3·6H2O]、六水硝酸鉺[Er(NO3)3·6H2O]、六水硝酸銩[Tm(NO3)3·6H2O]等(上海莎博化工科技有限公司)，氟化鈉(NaF)、環(huán)己烷(C6H12)等(北京化學(xué)試劑公司)，1-乙基-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N-羥基丁二酰亞胺(NHS)、2-無(wú)水嗎啉乙磺酸(MES)等(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，CD44v6[NO:MCA1730，安諾倫(北京)生物科技有限公司]，透射電子顯微鏡JEM-1010(日本電子公司JEOL)，傅立葉紅外光譜分析儀Tensor 37(德國(guó)Bruker Optics公司)，980 nm激光器STL980AIO3-20.0W(北京思通博遠(yuǎn)激光科技有限公司)，倒置相差顯微鏡TS100(日本Nikon公司)，小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)Berthold LB983 NC100(德國(guó)Berthold Technologies公司)等。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1UCNPs制備 制備UCNPs時(shí)參考熱解法合成[8],對(duì)實(shí)驗(yàn)步驟修正改進(jìn)。

1.2.1.1鉺鐿共摻雜四氟釔鈉(NaYF4:Yb,Er)制備 稱取0.012 7 g氧化鉺(Er2O3)、0.118 0 g氧化鐿(Yb2O3)和0.300 5 g氧化釔(Y2O3)，滴入稀鹽酸加熱至溶解，結(jié)晶后待用。將去離子水、無(wú)水乙醇和油酸各10 mL加入燒瓶中，磁力攪拌10 min，將0.394 3 g氧化銨(NH4F)和0.106 4 g氫氧化鈉(NaOH)加入燒瓶攪拌10 min；將混合物移到反應(yīng)釜，180 ℃持續(xù)720 min后冷卻至室溫，將反應(yīng)物經(jīng)4 000 r/min,離心20 min，乙醇洗滌3次，70 ℃烘干備用。

1.2.1.2銩鐿共摻雜四氟釔鈉(NaYF4:Yb,Tm)制備 將NaYF4:Yb,Er制備中的Er2O3用Tm2O3替代，其余方法步驟同1.2.1，即得NaYF4:Yb,Tm。

1.2.2NaYF4:Yb,Er/Tm的表面修飾 配置Lemieux-von Rudloff氧化劑[去離子水30 mL、偏高碘酸鈉(NaIO4)2.6 g、高錳酸鉀(KMnO4)0.036 g]，稱0.2 g NaYF4:Yb,Er用正己烷和乙醇超聲3次，22 000 r/min離心,向離心產(chǎn)物中加入100 mL環(huán)己烷、70 mL叔丁醇、10 mL去離子水和5 mL 5%的碳酸鈉(Na2CO3),攪拌20 min；向混合物加入30 mL Lemieux-von Rudloff氧化劑，將混合物于40 ℃攪拌24 h，將產(chǎn)物，22 000 r/min離心30 min，洗滌再離心上述產(chǎn)物；將產(chǎn)物分別分散在50 mL(pH4～5)鹽酸中,攪拌30 min后經(jīng)11 000 r/min，離心30 min、70 ℃干燥備用。NaYF4:Yb,Tm的表面修飾方法用NaYF4:Yb,Er的表面修飾。

1.2.3透射電鏡 將待檢測(cè)樣品充分分散后取適量放置到銅網(wǎng)上壓片檢測(cè)，用電鏡觀察UCNPs形貌及尺寸(加速電壓100 kV；點(diǎn)分辨力 0.24 nm)。

1.2.4熒光分光光度計(jì)檢測(cè) 將待測(cè)樣品調(diào)制10 mg/mL,室溫下將樣品用連續(xù)激發(fā)980 nm激光器的熒光光譜儀進(jìn)行測(cè)定，掃描范圍200～800 nm；

1.2.5傅立葉紅外光譜儀檢測(cè) 取干燥樣品與溴化鉀(KBr,1∶100)研磨成細(xì)粉狀，壓片后置傅立葉紅外光譜中分析顆粒表面的化學(xué)基團(tuán)，掃描范圍250～4 000/cm。

《舌尖上的中國(guó)》里有一段話：在這個(gè)時(shí)代，每一個(gè)人都經(jīng)歷了太多的苦痛和喜悅，中國(guó)人總會(huì)將苦澀藏在心里，而把幸福變成食物，呈現(xiàn)在四季的餐桌之上。

1.2.6結(jié)直腸癌細(xì)胞DLD1培養(yǎng) 將DLD1細(xì)胞置含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)瓶中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育。棄DMEM培養(yǎng)液[含青霉素鈉100 IU/L，鏈霉素100 IU/L(pH7.2～7.4]，加入2～3 mL 0.25%胰酶消化，待細(xì)胞變圓或細(xì)胞間隙增寬時(shí)，終止消化，收集細(xì)胞離心，棄胰酶消化液，加入新鮮DMEM培養(yǎng)液，制成細(xì)胞懸液，按1∶3傳代至培養(yǎng)瓶中。

1.2.7四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)UCNPs對(duì)DLD1細(xì)胞抑制率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的DLD1細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化制備細(xì)胞懸液，96孔板接種DLD1細(xì)胞5.0×104/孔，設(shè)陰性對(duì)照組及調(diào)零組，每孔加不同濃度的UCNPs(NaYF4:Yb,Er或NaYF4:Yb,Tm 0、50、100、200、400、800、1 600 μg/mL)，每組設(shè)7個(gè)復(fù)孔,培養(yǎng)24 h；加入MTT(5 mg/mL)20 μL后繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄培養(yǎng)基，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150 μL,振蕩10 min,在酶標(biāo)儀570 nm下檢測(cè)吸光度(OD)值(用630 nm校準(zhǔn))；計(jì)算UCNPs對(duì)細(xì)胞抑制率，本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次；細(xì)胞抑制率=1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×100%。NaYF4:Tm對(duì)DLD1細(xì)胞抑制率檢測(cè)方法同NaYF4:Yb,Er的檢測(cè)方法。

1.2.8制備CD44v6 UNCPs探針 取氧化的NaYF4:Yb,Er 10 mg分別加入MES緩沖液洗滌后離心，加7 mL MES緩沖液、5 mg EDC、15 mg NHS，磁力攪拌器反應(yīng)1 h；將產(chǎn)物用PBS洗滌，11 000 r/min離心30 min；將產(chǎn)物放入3 mL PBS經(jīng)0.22 μm過(guò)濾器濾過(guò)后，加入10 μL CD44v6單克隆抗體，室溫反應(yīng)2 h，既得NaYF4:Yb,Er-CD44v6探針，4 ℃保存?zhèn)溆?。NaYF4:Yb,Tm-CD44v6探針制備方法同NaYF4:Yb,Er-CD44v6。

1.2.9DLD1干細(xì)胞光熱治療 利用980nm激光器激發(fā)結(jié)合CD44v6 UCNPs探針對(duì)結(jié)直腸癌CSC進(jìn)行光熱治療。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件分析數(shù)據(jù)，各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組細(xì)胞抑制率比較采用方差分析(Analysis of Variance)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1NaYF4:Yb,Er/Tm的表征 透射電鏡對(duì)NaYF4:Yb，Er和NaYF4:Yb,Tm進(jìn)行形貌、晶體結(jié)構(gòu)表征觀察，結(jié)果顯示，兩種UCNPs經(jīng)謝勒公式計(jì)算，粒子直徑20～35 nm，均為六角相的UCNPs，圖1A、C圖示兩種UCNPs均有良好分散性，圖1B、D示兩種UCNPs在受到電子束激發(fā)時(shí)均具有同心圓環(huán)組成的選區(qū)多晶電子衍射圖樣。

A:NaYF4:Yb,Er圖像；B:NaYF4:Yb,Er電子衍射圖；C:NaYF4:Yb,Tm圖像；D:NaYF4:Yb,Tm電子衍射圖

圖1 透射電鏡對(duì)NaYF4:Yb,Er/Tm進(jìn)行表征觀察

圖2 NaYF4:Yb,Er/Tm上轉(zhuǎn)換發(fā)光光譜圖

2.3NaYF4:Yb,Er/Tm表面修飾后表征 傅立葉紅外光譜檢測(cè)修飾前、后的NaYF4:Yb,Er/Tm。結(jié)果如圖5～6示，圖5、6中黑色線分別代表NaYF4:Yb,Er/Tm氧化前的振動(dòng)光譜，圖5綠色線代表NaYF4:Yb,Er氧化后的振動(dòng)光譜，圖6藍(lán)色線代表NaYF4:Yb,Tm氧化后的振動(dòng)光譜，均在～1 640/cm處發(fā)現(xiàn)羧基(-COH)基團(tuán)的伸縮振動(dòng)譜，而在～3 417/cm處表現(xiàn)出寬頻帶吸收峰，對(duì)應(yīng)羥基(-OH)基因的伸縮振動(dòng)譜，UCNPs氧化后的振動(dòng)譜比氧化前明顯增強(qiáng)，證實(shí)NaYF4:Yb,Er/Tm氧化后-COOH的存在，表明NaYF4:Yb,Er/Tm修飾成功。

圖3 NaYF4:Yb,Er上轉(zhuǎn)換發(fā)光機(jī)制

圖4 NaYF4:Yb,Tm上轉(zhuǎn)換發(fā)光機(jī)制

黑色線：NaYF4:Yb,Er氧化前振動(dòng)光譜，綠色線：NaYF4:Yb,Er氧化后振動(dòng)光譜

圖5 NaYF4:Yb,Er氧化前后紅外光譜

2.4MTT檢測(cè)2種UCNPs對(duì)DLD1細(xì)胞抑制率 NaYF4:Yb,Er(表1)和NaYF4:Yb,Tm(表2)細(xì)胞毒性分析結(jié)果顯示，1 600 μg/mL高濃度組細(xì)胞抑制率與陰性對(duì)照組(0 μg/mL)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(NaYF4:Yb,Er,P=0.003；NaYF4:Yb,Tm,P=0.000)，其余各組與陰性對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，實(shí)驗(yàn)時(shí)采用中劑量濃度組(400 μg/mL)，所合成的NaYF4:Yb,Er/Tm在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)腫瘤細(xì)胞無(wú)毒性。

黑色線：NaYF4:Yb,Tm氧化前振動(dòng)光譜，藍(lán)色線：NaYF4:Yb,Tm氧化后振動(dòng)光譜

圖6 NaYF4:Yb,Tm氧化前后紅外光譜

2.5NaYF4:Yb,Er/Tm熒光成像 用980 nm激光器分別對(duì)NaYF4:Yb,Er和NaYF4:Yb,Tm進(jìn)行2 W/10 s連續(xù)紅外光激發(fā)，分別獲取粒子的明、暗場(chǎng)圖像和熒光像，并對(duì)圖像進(jìn)行合并,以證明上轉(zhuǎn)換得到的紅、綠色熒光像和藍(lán)色熒光像是納米粒子本身受到激發(fā)所得。結(jié)果顯示(圖7)：采用980 nm連續(xù)激發(fā)取樣拍照。從圖7F中清晰得到NaYF4:Yb,Er紅、綠兩種熒光，從成像圖中可證實(shí)合成的納米粒子具有良好的發(fā)光性，且發(fā)光不受時(shí)間限制。

2.6CD44v6 UCNPs探針靶向DLD1 CSC熒光成像 12孔培養(yǎng)板每孔加入500 μL CD44v6 UCNPs探針，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h，棄上清液，加1 000 μL PBS。DLD1細(xì)胞與探針共孵育后用PBS代替DMEM培養(yǎng)基以減少培養(yǎng)基中顏色對(duì)980 nm激光的影響。CD44v6-NaYF4:Yb,Er探針上轉(zhuǎn)換成像結(jié)果(圖8)示：CD44v6表達(dá)于細(xì)胞膜，尤其處于分裂晚期的細(xì)胞之間蛋白表達(dá)量明顯增多，CD44v6蛋白表達(dá)符合干細(xì)胞不對(duì)稱分裂特性。CD44v6-NaYF4:Yb,Tm探針上轉(zhuǎn)換成像圖(圖9)中可見熒光成像在腫瘤細(xì)胞表面呈簇狀分布或呈點(diǎn)狀分布，提示腫瘤細(xì)胞成像時(shí)對(duì)于發(fā)光較弱的熒光信號(hào)可以加大激發(fā)功率或延遲激發(fā)時(shí)間以便得到清晰圖像。

A：NaYF4:Yb,Er明場(chǎng)像;B：綠色熒光暗場(chǎng)像;C：A、B明場(chǎng)與暗場(chǎng)合并像;D：紅色熒光暗場(chǎng)圖;E：A、D明場(chǎng)與暗場(chǎng)合并像;F：NaYF4:Yb,Er明、暗場(chǎng)、紅綠色熒光合并像;G：NaYF4:Yb,Tm明場(chǎng)像;H：藍(lán)色熒光暗場(chǎng)像;I：G、H明、暗場(chǎng)合并像

圖7 UCNPs上轉(zhuǎn)換成像圖

A:明場(chǎng)像;B:綠色熒光暗場(chǎng)像;C:A、B明暗場(chǎng)合并像;D：紅色熒光暗場(chǎng)像;E：A、D明暗場(chǎng)合并像;F：紅、綠色熒光合并成黃色熒光像

圖8 CD44v6-NaYF4:Yb,Er上轉(zhuǎn)換熒光成像

A：明場(chǎng)像;B：藍(lán)色熒光暗場(chǎng)像;C：明暗場(chǎng)合并像

圖9 CD44v6-NaYF4:Yb,Tm上轉(zhuǎn)換熒光成像

A、B:1 W/50 s;C、D：2 W/50 s;E、F：3 W/50 s;G、H：4 W/50 s;I、J:5 W/50 s;K、L：6 W/50 s;M、N：7 W/50 s;O、P：8 W/50 s

圖10 腫瘤細(xì)胞光熱治療

2.7DLD1 CSC的靶向光熱治療 鑒于藍(lán)色熒光轉(zhuǎn)換為熱能效率高的特點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)選擇被激發(fā)后發(fā)藍(lán)光的CD44v6-NaYF4:Yb,Tm探針，以不同功率不同時(shí)間的980 nm連續(xù)激發(fā)后，明確藍(lán)光轉(zhuǎn)換為熱能對(duì)細(xì)胞損傷的閾值,如圖10A～F示經(jīng)1～3 W/50 s 980 nm激發(fā)后細(xì)胞形態(tài)未見明顯異常；圖10G、H圖顯示4 W/50 Rs 980 nm連續(xù)激發(fā)細(xì)胞后可見分裂末期兩個(gè)子細(xì)胞連接處明顯萎縮；圖10I、J和圖10K、L分別經(jīng)5、6 W/50 s激發(fā)后部分細(xì)胞萎縮，包括細(xì)胞膜皺縮，細(xì)胞體積變??；圖10M、N示經(jīng)7 W/50 s激發(fā)后細(xì)胞核核仁皺縮成團(tuán)塊狀凝集，部分細(xì)胞核仁呈塊狀分布；圖10O、P示經(jīng)8 W/50 s激發(fā)后細(xì)胞膜邊緣皺縮部分呈肉芽狀突起、破碎，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器凝聚、蛋白質(zhì)凝聚，細(xì)胞核部分核仁皺縮成團(tuán)塊狀凝集。經(jīng)上述不同功率980 nm激發(fā)照射，腫瘤細(xì)胞膜、細(xì)胞核等發(fā)生不同程度形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果顯示：DLD1細(xì)胞在受到近紅外980 nm激發(fā)不超過(guò)3 W/50 s時(shí)，DLD1細(xì)胞不會(huì)受到明顯影響，因此，后續(xù)細(xì)胞光熱治療以4 W/50 s作為治療閾值。

A：明場(chǎng)像;B：暗場(chǎng)像;C：明暗場(chǎng)合并像;D：4 W/50 s熒光暗場(chǎng)像;E：4 W/50 s連續(xù)激發(fā)后明場(chǎng)像;F：治療前、后合并像顯示細(xì)胞體積明顯固縮

圖11 CD44v6-NaYF4:Yb,Tm光熱損傷成像圖

以980 nm、4 W/50 s激發(fā)特異性結(jié)合的納米探針(CD44v6-NaYF4:Yb,Tm對(duì)DLD1細(xì)胞進(jìn)行光熱治療時(shí))，結(jié)果如圖11中可見，腫瘤細(xì)胞在經(jīng)980 nm、4 W/50 s連續(xù)激發(fā)后其細(xì)胞體積明顯固縮，細(xì)胞膜明顯皺縮、破壞等病理形態(tài)改變。

表1 NaYF4:Yb,Er對(duì)腫瘤細(xì)胞抑制率

表2 NaYF4:Yb,Tm對(duì)腫瘤細(xì)胞抑制率

3 討 論

結(jié)直腸癌確診需術(shù)后病理切片證實(shí)，發(fā)現(xiàn)時(shí)多數(shù)已進(jìn)入中晚期，目前，結(jié)直腸癌治療仍以手術(shù)和化學(xué)藥物治療為主，但常規(guī)化學(xué)藥物因無(wú)抗腫瘤細(xì)胞的特異靶向性，其在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也對(duì)正常組織細(xì)胞產(chǎn)生損傷，并且易引起腫瘤細(xì)胞的耐藥性。隨著對(duì)CSC的深入研究發(fā)現(xiàn)，CSC決定了腫瘤的復(fù)發(fā)和侵襲轉(zhuǎn)移，同時(shí)腫瘤的耐藥性也取決于CSC的耐藥性[9-10]。因此，針對(duì)CSC的靶向治療可能是有效的腫瘤治療方案之一。目前，已有研究證實(shí)在多種惡性腫瘤如胃癌、結(jié)腸癌、肝癌等普遍存在CD44v6表達(dá)失控，CD44v6高表達(dá)與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后等密切相關(guān)[7]，另外，TODARO等[11]在2014年發(fā)現(xiàn)CD44v6既可能是一個(gè)生物標(biāo)記物也可能是結(jié)直腸癌CSC治療性靶點(diǎn)之一。

基于以上研究，本實(shí)驗(yàn)制備NaYF4:Yb,Tm UCNPs，經(jīng)NHS/EDC偶聯(lián)CD44v6抗體的靶向探針，以期達(dá)到靶向結(jié)直腸癌CSC目的，并經(jīng)分子成像技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)結(jié)直腸癌CSC的影像診斷及靶向光熱治療的作用鑒別，從而提高腫瘤治療效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，制備UCNPs直徑為20～35 nm，粒徑均勻；經(jīng)傅立葉紅外光譜檢測(cè)UCNPs修飾成功，具有良好的生物相容性及水溶液分散性；MTT檢測(cè)說(shuō)明UCNPs實(shí)驗(yàn)用量對(duì)DLD1細(xì)胞無(wú)毒性。通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí),該納米探針對(duì)CD44v6+的結(jié)直腸癌CSC有良好的靶向性，可實(shí)現(xiàn)上轉(zhuǎn)換熒光的實(shí)時(shí)成像，避免了生物發(fā)光成像中如熒光素酶半衰期的限制。關(guān)于UCNPs經(jīng)980 nm激光器激發(fā)后是否對(duì)細(xì)胞本身造成影響的報(bào)道并不多見，SHEN等[12]報(bào)道HeLa細(xì)胞在接受近紅外激光獲得的輻射前、后顯微鏡圖像的對(duì)比圖發(fā)現(xiàn)，其細(xì)胞形態(tài)并沒有明顯差異。而高溫殺傷腫瘤細(xì)胞的具體作用機(jī)制目前仍未完全明確，一般認(rèn)為有多種作用機(jī)制：高溫能夠破壞細(xì)胞核，尤其當(dāng)溫度超過(guò)41 ℃時(shí)，細(xì)胞核、染色質(zhì)可凝集成團(tuán)塊，使蛋白質(zhì)凝固變性，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡，并產(chǎn)生新的溶酶體使細(xì)胞發(fā)生自身溶解[13]，而激光作用于生物組織后，可以引起各種物理化學(xué)效應(yīng)，因此使用激光治療各種疾病已被廣泛應(yīng)用[14-15]。目前，針對(duì)腫瘤細(xì)胞熱治療多數(shù)研究的重點(diǎn)是光動(dòng)力學(xué)治療[16]，但采用UCNPs本身作為直接熱殺傷腫瘤細(xì)胞的研究未見報(bào)道，因此本研究主要針對(duì)UCNPs本身在受到不同時(shí)間、不同功率980 nm激發(fā)后其局部的產(chǎn)熱作用，以達(dá)到殺傷結(jié)直腸癌CSC的目的，其研究結(jié)果顯示：DLD1 CSC經(jīng)980 nm、4 W/50 s連續(xù)激發(fā)后其細(xì)胞體積明顯縮小，部分細(xì)胞核呈團(tuán)塊狀凝集、固縮，細(xì)胞膜皺縮等病理改變，此研究結(jié)果表明UCNPs可在980nm激發(fā)后具有直接殺死腫瘤CSC的作用。

綜上所述，通過(guò)使用靶向納米探針，可實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤CSC的實(shí)時(shí)無(wú)創(chuàng)性影像學(xué)診斷，又可實(shí)現(xiàn)對(duì)其靶向精準(zhǔn)光熱治療，從而達(dá)到在殺死CSC的同時(shí)又達(dá)到了常規(guī)化學(xué)藥物不能達(dá)到的治療效果；同時(shí)，靶向納米探針可避免CSC耐藥性的產(chǎn)生，進(jìn)而提高常規(guī)化學(xué)藥物對(duì)一般腫瘤細(xì)胞的治療效果。因此，UCNPs探針是一種具有良好應(yīng)用前景的治療方案之一。本實(shí)驗(yàn)下一階段將進(jìn)一步探討UCNPs探針在體內(nèi)對(duì)腫瘤的熒光成像及光熱治療作用，以及靶向納米載藥體系的構(gòu)建和應(yīng)用。