轉基因食物中常見外源基因PCR檢測方法的建立

（長春理工大學 生命科學技術學院，長春 130022）

自1996年轉基因作物在美國首次商業(yè)化大規(guī)模種植以來，轉基因技術在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領域得到了快速的應用與發(fā)展，并且隨著其種植面積的不斷擴大，已經(jīng)對現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的生產(chǎn)方式產(chǎn)生了巨大而深刻的影響。根據(jù)國際農(nóng)業(yè)生物技術應用服務組織（ISAAA）于2018年6月發(fā)布的最新統(tǒng)計數(shù)據(jù)，2017年種植轉基因作物的國家已經(jīng)達到24個，并且全世界轉基因作物種植面積由1996年的174萬公頃增加到2017年的1.898億公頃，增長種植面積超過了110倍［1］。隨著轉基因作物的迅猛發(fā)展，關于轉基因生物及其產(chǎn)品成分食用和環(huán)境安全性的爭議也與日俱增，世界各國都在不同程度上制訂了相應的管理制度，主要包括轉基因的安全性評價制度和轉基因成分標識制度等［2-4］。目前，國內(nèi)外對轉基因作物及其相關制品的檢測主要是針對其含有的外源蛋白和外源核酸展開的，并且已經(jīng)建立了一系列轉基因定性和定量檢測技術，如酶聯(lián)免疫吸附技術（ELISA）、PCR技術、等溫擴增技術（LAMP）、基因芯片技術（gene chip）及數(shù)字PCR技術（digital PCR）等［5-6］。

我國對待轉基因采取比較謹慎的態(tài)度，于2001年相繼頒布了《農(nóng)業(yè)轉基因生物安全管理條例》及一系列管理辦法，對農(nóng)業(yè)轉基因生物及其產(chǎn)品實行安全評價、產(chǎn)品標識、生產(chǎn)許可、經(jīng)營許可、進口許可、加工許可等方面管理［7-8］。目前我國實施的是沒有閾值的標識制度，規(guī)定來源于玉米、大豆、番茄等五種作物的17種轉基因產(chǎn)品必須進行標識［9-12］。然而市場上一些散裝售賣的農(nóng)作物加工品普遍存在缺乏明顯標識的現(xiàn)象，且深加工制品一般核酸會受到不同程度的破壞，不便于檢測與監(jiān)管［13］。

本文參照國家標準中提供的植物基因組提取方法，通過對試劑盒法、胍-氯仿法和CTAB法提取食品中基因組DNA效果進行比較，選擇出DNA回收率高、純度高的方法用于后續(xù)的PCR檢測，然后針對轉基因食品中一些常見的外源基因及調(diào)控元件設計出特異性引物，構建普通PCR的檢測方法，并且擴增片段都小于200bp以適用于深加工品的檢測，為監(jiān)管部門對轉基因食品標識的監(jiān)管提供技術支持。

1 實驗材料

1.1 實驗樣品

非轉基因玉米種子黏墾、非轉基因大豆種子合豐、陽性質粒pUC57-TP（見圖1）為本實驗室保存，轉基因玉米MON89034、MIR162，轉基因大豆GTS40-3-2（5%），陽性質粒pBJGMM001（見圖2）均由中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究所提供［14］，豆?jié){粉、豆芽購自超市。

圖1 pUC57-TP質粒結構

圖2 pBJGMM001質粒結構

1.2 實驗藥品

PCR反應試劑（上海生工生物工程股份有限公司），EDTA、異丙醇、NaOH（天津光復科技發(fā)展有限公司），NaCl、無水乙醇、氯仿、異戊醇（北京化工廠），PVP40000（寶泰克生物科技公司），Proteinase K（Genview），Tris（BioFroxx），CTAB（上海源葉生物），β-巰基乙醇、Tris飽和酚（北京鼎國生物）、質粒提取試劑盒（北京天根生物科技公司）、植物基因組提取試劑盒（艾德萊生物）。

1.3 實驗儀器

PCR儀（LifeTouch公司），離心機（Eppendorf公司），電泳槽，電泳儀，凝膠成像儀Azure c300（azure biosystems公司），微量核酸測定儀Nanodrop One（美國Thermo Fisher公司）。

2 實驗方法

2.1 基因組DNA提取

參照GB/T 19495.3-2004中基因組DNA的CTAB提取方法［15］、胍-氯仿法，及購買的植物基因組提取試劑盒分別對豆芽、豆?jié){粉、大豆種子的基因組進行提取，每種方法設置兩組重復。將DNA沉淀用去離子水溶解，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

通過凝膠電泳實驗判斷所提取植物及其加工品基因組DNA的完整度，再用微量核酸及蛋白測定儀Nanodrop One對提取DNA的濃度和純度進行測定分析。

2.2 陽性質粒分子的提取

從-80℃冰箱中取出凍存的菌株，將其按1∶100接種到氨芐青霉素終濃度為100μg/mL的5mL LB培養(yǎng)基中，在37℃下180rpm振蕩過夜，再將菌液在4℃下離心分離，使用天根Mini Plasmid Kit提取大腸桿菌中的質粒，操作步驟參照試劑盒的說明書。

將質粒溶液保存在1.5mL離心管中，通過凝膠電泳實驗判斷質粒DNA的提取情況。

2.3 引物設計與合成

根據(jù)CaMV35S啟動子、NOS終止子、CaMV35S終止子、NOS啟動子、FMV35S啟動子、Hpt、CP4-EPSPS、Cry1A.105、Cry2Ab2九種不同基因的核苷酸序列，使用Oligo 7.0設計出特異性引物，玉米內(nèi)參zSSIIb、大豆內(nèi)參Lectin的引物序列參照國家標準GB/T19495.4-2004《轉基因產(chǎn)品檢測核酸定性PCR檢測方法》［16］，引物的詳細信息見表1，并由長春庫美生物公司合成和純化，用去離子水稀釋成100μM備用。

2.4 PCR反應體系及條件

PCR反應體系見表2，PCR反應條件見表3。

表1 引物序列

表2 PCR反應體系

表3 PCR反應條件

2.5 電泳檢測

吸取PCR產(chǎn)物10μL，在2%瓊脂糖凝膠中電泳，緩沖液為0.5×TBE電泳緩沖液，設置水空白對照、陰性對照、陽性對照，以DL2000 DNA Marker作為標準尺，在100V電壓下電泳30min，通過EB染色［17-18］，在凝膠成像儀中觀察結果。

3 實驗結果

3.1 不同基因組提取方法比較

分別用植物基因組試劑盒法、CTAB法和鹽酸胍-三氯甲烷法對豆芽、豆?jié){粉、大豆種子中的基因組DNA進行提取，從電泳結果和核酸含量測定中可以看出，相同質量的樣品用CTAB法提取到的基因組DNA的含量和純度最高，后續(xù)實驗將采用CTAB法提取食品中DNA進行PCR檢測驗證。

圖3 三種不同方法對不同樣品基因組提取結果

表4 不同方法提取核酸含量測定結果

3.2 陽性質粒提取

從圖4、圖5電泳結果可以看出，所提取的陽性質粒條帶明亮清晰，可適用于后續(xù)的PCR檢測。

圖4 pUC57-TP質粒提取結果

圖5 pBJGMM001質粒提取結果

3.3 PCR檢測方法特異性驗證

以空白對照（水）、陰性樣本、陽性樣本（或陽性質粒）作為實驗材料，分別對9種基因的PCR檢測方法進行特異性驗證，結果如圖6所示。從中可以看出9種基因的檢測方法均能從陽性樣本（或陽性質粒）中得到預期大小一致的擴增產(chǎn)物，而在陰性樣本、空白對照及不含目標基因的轉基因樣本中均未出現(xiàn)擴增（部分有引物二聚體出現(xiàn)），說明該檢測方法具備高度特異性。

圖7 不同基因PCR檢測方法的靈敏度

圖6 PCR檢測方法特異性結果

3.4 PCR擴增產(chǎn)物的測序驗證

將PCR擴增得到的9種擴增產(chǎn)物送去生工公司測序，測序結果與已知的目標基因序列進行比對分析，發(fā)現(xiàn)9種PCR產(chǎn)物的測序結果與已知序列基本一致，驗證了擴增產(chǎn)物的正確性。

3.5 PCR檢測方法的靈敏度試驗

將提取的基因組DNA稀釋至200ng/μL，那么50ng/反應，因為玉米基因組大小為2500Mbp，所以約18242 copies/反應，pBJGMM001質粒與pUC57-TP質粒大小分別為5078bp、3169bp，200ng/μL玉米基因組拷貝數(shù)分別等同于質粒40.623×10-5ng/μL、25.351×10-5ng/μL，然后將陽性質粒與陰性玉米混合成不同的百分含量，同時也將MON89034、GTS40-3-2、MIR162與非轉基因樣品按質量比進行混合，制備成5%、1%、0.5%、0.1%的梯度，進行靈敏度測試。從圖7結果中可以看出，p35S、tNOS、Hpt、t35S、pNOS、pFMV35S、Cry2Ab2的PCR檢測方法均可從含量0.1%的樣品中擴增出與預期大小一致的PCR產(chǎn)物，而CP4-EPSPS、Cry1A.105能從含量0.5%的樣品中得到擴增（詳細信息見表5），能夠滿足對食品中轉基因成分的檢測。其中，MIR162中由于含有的t35S片段太短與引物序列不一致，所以并未得到擴增。

表5 9種檢測方法檢測限與適用性

4 結論

本研究通過對CTAB法、胍-氯仿法和試劑盒法三種植物基因組提取方法進行比較，篩選出提取率最大、提取純度最高的CTAB法用于本實驗樣品基因組的提取。以Lectin基因、zSSIIb基因分別為大豆、玉米的內(nèi)標準基因，針對轉基因作物中9種常見的外源基因序列為模板，設計出9對引物，建立了定性PCR的檢測方法，該方法具有高度的特異性，檢測靈敏度可達0.1%～0.5%，滿足轉基因產(chǎn)品的檢測要求。

隨著轉基因技術的進一步發(fā)展，轉基因作物的種類也在不斷增加，據(jù)ISAAA于2018年發(fā)布的最新統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，轉基因玉米單品系現(xiàn)有44種，轉基因大豆單品系現(xiàn)有25種。目前，國家發(fā)布的相關標準文件中公布了18種篩選檢測基因、15種大豆品系、23種玉米品系PCR檢測方法的推薦標準，本文就其中p35S、tNOS、Hpt、t35S、pNOS、pFMV35S、CP4-EPSPS、Cry1A.105、Cry2Ab2九種基因構建了定性PCR檢測方法，后期將進一步增加篩選檢測和品系檢測的覆蓋范圍，并開發(fā)出定量檢測的熒光PCR和數(shù)字PCR方法檢測轉基因，為我國的轉基因監(jiān)管提供依據(jù)和技術基礎。