多價(jià)噬菌體分離篩選及靶向滅活土壤病原菌的應(yīng)用研究*

趙遠(yuǎn)超 葉 茂 孔令雅 萬(wàn)金忠 黃 丹 張忠云 夏 冰張勝田 馮彥房 孫明明 武 俊 胡 鋒 蔣 新 杜良成

（1 中國(guó)科學(xué)院土壤環(huán)境與污染修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（中國(guó)科學(xué)院南京土壤研究所），南京 210008）（2 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院土壤生態(tài)實(shí)驗(yàn)室，南京 210095）（3 生態(tài)環(huán)境部南京環(huán)境科學(xué)研究所土壤污染防治研究中心，南京 210042）（4 安徽省環(huán)境科學(xué)研究院，合肥 230022）（5 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所，南京 210014）（6 University of Nebraska—Lincoln，Lincoln，Nebraska，Lincoln 68588，USA）

由于我國(guó)現(xiàn)階段畜禽糞便安全化處理技術(shù)或環(huán)境管理仍存在一定的不足或缺失，許多城郊畜牧業(yè)養(yǎng)殖廠周邊的農(nóng)田土壤常成為殘留和滋生人畜共患病原菌的高風(fēng)險(xiǎn)熱點(diǎn)區(qū)域，嚴(yán)重影響人體健康和環(huán)境安全［1］。因而，針對(duì)病原菌污染農(nóng)田土壤，開展必要的生物修復(fù)技術(shù)研究十分迫切。

噬菌體療法（Phage therapy）為修復(fù)上述污染土壤提供了一種全新途徑。細(xì)菌噬菌體（簡(jiǎn)稱噬菌體）是一類較為專屬捕食活體宿主細(xì)菌而存活的生物體，在土壤、水、空氣乃至人/動(dòng)物體表或腸道內(nèi)均廣泛分布了大量噬菌體，據(jù)估算其總量達(dá)到1031數(shù)量級(jí)［2］。噬菌體療法是指通過(guò)分離、篩選、純化和富集宿主病原菌的專屬噬菌體之后，向污染土壤中添加特定噬菌體菌液，定向侵染滅活病原菌的修復(fù)方式［3-4］。國(guó)外學(xué)者已成功將噬菌體療法應(yīng)用在滅活辣椒、番茄、葡萄等果蔬的植物病害細(xì)菌或人畜共患致病細(xì)菌的食品安全保障領(lǐng)域［5-6］。然而，使用噬菌體療法來(lái)削減土壤中病原菌的生物修復(fù)技術(shù)研究則相對(duì)較少。此外，現(xiàn)有研究常認(rèn)為噬菌體僅限于侵染某一“種”類的宿主細(xì)菌，而近年來(lái)學(xué)術(shù)界發(fā)現(xiàn)：一些噬菌體經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)幕蚋脑旎蛉斯ぜ铀倨鋵捤拗髯V的表達(dá)，可針對(duì)同一“屬”內(nèi)幾種高度同源性的宿主細(xì)菌，甚至針對(duì)不同種屬之間的宿主細(xì)菌也具有一定廣譜性捕食區(qū)間［7-8］。這為噬菌體療法廣泛應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

本研究以南京城郊典型奶牛場(chǎng)牛糞堆積池塘周邊，復(fù)合病原菌污染農(nóng)田土壤為例；先從污染土壤中分離、篩選、加速其寬宿主譜表達(dá)獲得多價(jià)噬菌體；接著在水相和實(shí)際污染土壤中驗(yàn)證和優(yōu)化其同步滅活多種病原菌的效果和能力，并評(píng)估修復(fù)過(guò)程中的微生物生態(tài)效應(yīng)。本研究結(jié)果可為靶向滅活農(nóng)田土壤中多種病原菌提供切實(shí)可行的生物修復(fù)技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌株大腸桿菌K12（Escherichia coliK12，K12）與帶紅色熒光標(biāo)記（Red Fluorescent Protein，RFP）的銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PAO1），均為南京農(nóng)業(yè)大學(xué)土壤生態(tài)實(shí)驗(yàn)室提供。

供試污染土壤為水稻土，采自南京市橫梁奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)（32°30′45″N，118°94′7″E）牛糞堆積池附近。采用五點(diǎn)取樣法，取0～10 cm的表層土壤，共5 kg，混勻，于暗處4°C冷藏保存。測(cè)定土樣基本理化性質(zhì)［9］：pH 7.9，全氮1.8 g·kg-1，全磷1.1 g ·kg-1， 全 鉀 17.9 g ·kg-1， CEC 19.9 cmol·kg-1，水溶性氮1.8 g·kg-1，砂粒25.5%，壤粒45.3%，黏粒29.2%。

供試儀器與試劑為臺(tái)式低溫高速離心機(jī)、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫?fù)u床；大腸桿菌直接瓊脂（Escherichia coliDirect Agar，ECD瓊脂）、假單胞菌選擇性培養(yǎng)基（Pseudomonas SelectiveAgar，PSA）、SM緩沖液、Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基、環(huán)境樣品病毒核酸提取試劑盒（PowerViral Environmental RNA/DNA Isolation Kit，Mobio公司，型號(hào)28000-50）。

1.2 噬菌體的分離純化

取新鮮土壤樣品5 g，加入50 mL無(wú)菌水中，28℃、150 r·min-1振蕩培養(yǎng)5 h，10 000 r·min-1離心5 min，上清液經(jīng)0.22 μm濾膜除菌，取9 mL濾液與1 mL生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期的宿主菌（K12或PAO1(RFP)）懸液加入40 mL LB液體培養(yǎng)基，加氯化鈣固體至溶液終濃度1 mmol·L-1，37℃、150 r·min-1搖床培養(yǎng)12 h。所得培養(yǎng)液10 000 r·min-1離心5 min，再經(jīng)0.22 μm濾膜除菌，濾液即為含有噬菌體的原液［10-11］。采用雙層平板法篩選噬菌體并提純。取上述濾液100 μL與100 μL的宿主菌懸液混勻，室溫靜置15 min，加入3 mL的 0.7%LB瓊脂培養(yǎng)基，混勻后平鋪倒入LB固體平板上，37 ℃培養(yǎng)10～12 h，觀察噬菌斑。待出現(xiàn)噬菌斑，挑取單個(gè)邊緣清晰透明的噬菌斑到含有宿主菌的LB液體中，37℃、250 r·min-1培養(yǎng)8 h；10 000 r·min-1離心5 min，0.22 μm濾膜除菌，濾液保存在SM緩沖液中，于4℃冰箱冷藏保存。取上述濾液適當(dāng)稀釋培養(yǎng)并倒雙層平板驗(yàn)證，如此重復(fù)4～6次即可獲得純種的噬菌體。

基于上述獲得的兩株專一型噬菌體（以K12為專一宿主的噬菌體命名為YSZ1；以PAO1（RFP）為專一宿主的噬菌體命名為YSZ5），開展加速其寬宿主譜的表達(dá)過(guò)程［12-13］。取600 μL保存的噬菌體（YSZ1或YSZ5）原液，分別與200 μL K12和200 μL PAO1(RFP)混合菌懸液，共同加入99 mL LB液體培養(yǎng)基中，再加入氯化鈣固體調(diào)至終濃度為1 mmol·L-1，37℃、150 r·min-1振蕩培養(yǎng)96 h，每隔8 h取樣，將離心過(guò)濾獲得的新噬菌體與PAO1（RFP）和K12分別倒雙層平板驗(yàn)證，觀察噬菌斑。若出現(xiàn)噬菌斑則證明表達(dá)成功，獲得多價(jià)噬菌體YSZ1R和YSZ5K，挑取單個(gè)清晰透明的噬菌斑富集儲(chǔ)存。

1.3 噬菌體的生物學(xué)特性鑒定

噬菌體的形態(tài)觀察，將噬菌體原液滴在銅網(wǎng)上，用pH 7.0、2%磷鎢酸負(fù)染90 s后，用濾紙吸去多余染液，干燥后于日立H-7650型透射電子顯微鏡下觀察其形態(tài)。

噬菌體核酸提取及鑒定，噬菌體核酸提取使用環(huán)境樣品病毒核酸提取試劑盒（核酸提取效率107copies·mL-1，核酸最終體積50～100 μL），提取的核酸用DNaseⅠ、RNaseⅠ和HindⅢ酶切處理并使用瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)，根據(jù)酶切圖譜鑒定和判斷其核酸性狀及大小。

噬菌體最佳感染復(fù)數(shù)，感染復(fù)數(shù)（Multiplicity of infection，MOI）又稱作噬菌體滴度，是指感染發(fā)生之前噬菌體與宿主菌數(shù)量的比值。最佳感染復(fù)數(shù)（Optimal multiplicity of infection，OMOI）即獲得子代噬菌體最高產(chǎn)量時(shí)的MOI。取對(duì)數(shù)期宿主菌懸液100 μL，按感染復(fù)數(shù)分別為100∶1、10∶1、1∶1、1∶100、1∶1 000、1∶10 000加入噬菌體。37℃搖床振蕩培養(yǎng)5 h。用雙層平板法測(cè)定各組噬菌體滴度1。

噬菌體一步生長(zhǎng)曲線，按最佳感染復(fù)數(shù)，取500 μL噬菌體與500 μL宿主菌懸液加入9 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃、150 r·min-1振蕩培養(yǎng)，每10 min取樣，離心過(guò)濾，并用雙層平板法測(cè)定噬菌體滴度［14］。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

噬菌體對(duì)宿主菌的滅活能力，驗(yàn)證上述分離獲得的噬菌體對(duì)宿主菌的滅活能力，按照最佳感染復(fù)數(shù)添加噬菌體與宿主菌各100 μL于100 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃、150 r·min-1振蕩培養(yǎng)。每隔2 h取樣，每次取200 μL稀釋適當(dāng)濃度，平板計(jì)數(shù)細(xì)菌數(shù)量。每個(gè)處理同時(shí)設(shè)置單獨(dú)不添加噬菌體的對(duì)照。

噬菌體療法在水相中滅活病原菌的效果，設(shè)置水相對(duì)照組（CK），即：將K12與PAO1(RFP)培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期后，各取100 μL加入100 mL LB液體培養(yǎng)基中，振蕩混勻，37℃、150 r·min-1振蕩培養(yǎng)。在CK基礎(chǔ)上，綜合參考最佳感染復(fù)數(shù)，再設(shè)立4個(gè)處理：處理1：添加專一型噬菌體YSZ1；處理2：添加多價(jià)噬菌體 YSZ1R；處理3；添加專一型噬菌體 YSZ5；處理4：添加多價(jià)噬菌體YSZ5K。每種噬菌體均添加100 μL（104PFU·mL-1），每隔4 h取樣，共監(jiān)測(cè)48 h，每次取200 μL菌懸液進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)。根據(jù)細(xì)菌平板計(jì)數(shù)判斷評(píng)估噬菌體療法在水相中對(duì)病原菌的滅活效果。

噬菌體療法在污染土壤中的滅活驗(yàn)證研究，為進(jìn)一步驗(yàn)證噬菌體療法在實(shí)際污染土壤中滅活多種病原菌的效果，本環(huán)節(jié)將進(jìn)行逐一回接上述分離獲得的噬菌體至污染土壤中，開展修復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。重點(diǎn)關(guān)注土壤中糞腸桿菌（Fecal coliform）和假單胞菌屬（Pseudomonas）菌群等病原菌的滅活效果。共設(shè)置5個(gè)實(shí)驗(yàn)處理：對(duì)照組（CK）：稱250 g污染土壤，每隔8 d以無(wú)菌水調(diào)控土壤含水率至最大田間持水量的80 %，28℃±4℃，避光培養(yǎng)24 d；處理1：在對(duì)照組基礎(chǔ)上添加專一型噬菌體YSZ1；處理2：在對(duì)照組基礎(chǔ)上添加多價(jià)噬菌體YSZ1R；處理3：在對(duì)照組基礎(chǔ)上添加專一型噬菌體YSZ5；處理4：在對(duì)照組基礎(chǔ)上添加多價(jià)噬菌體YSZ5K。每組處理均添加噬菌體500 μL（104PFU·mL-1）。每隔3 d取樣，每次取5 g土壤，平板計(jì)數(shù)法測(cè)定細(xì)菌數(shù)量。使用ECD培養(yǎng)基篩選并測(cè)定糞腸桿菌群細(xì)菌數(shù)目，使用PSA培養(yǎng)基篩選并測(cè)定假單胞菌群細(xì)菌數(shù)目，每個(gè)計(jì)數(shù)濃度設(shè)3次重復(fù)。

1.5 土壤微生物群落功能的多樣性和穩(wěn)定性分析

將1.4中采集的土壤樣品，進(jìn)行微生物群落功能多樣性和穩(wěn)定性分析。土壤微生物群落功能多樣性采用Biolog ECO測(cè)定法［15-16］。Biolog ECO微平板中多底物酶聯(lián)反應(yīng)采用每孔的平均吸光度值（Average well color development，AWCD）來(lái)描述，計(jì)算表達(dá)式：

式中，C代表含底物試驗(yàn)孔的吸光值，R代表不含底物對(duì)照孔的吸光值。土壤群落功能多樣性采用培養(yǎng)Biolog ECO微平板孔中吸光值，計(jì)算土壤微生物群落功能多樣性指數(shù)（香農(nóng)指數(shù)H和辛普森指數(shù)D）。

式中，Pi為第i孔相對(duì)吸光值（C-R）與整個(gè)微平板相對(duì)吸光值總和(∑ODi)的比率。

1.6 數(shù)據(jù)處理

所用數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)采樣的平均值，利用軟件SPSS 21進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。圖表采用 Microsoft Excel 2016和軟件 OriginPro 9.0繪制。

2 結(jié)果與討論

2.1 噬菌體分離純化

經(jīng)5次分離純化及加速寬宿主譜表達(dá)后獲得四株裂性噬菌體，分別是：?jiǎn)我还鬕12的噬菌體YSZ1；在YSZ1基礎(chǔ)上加速寬宿主譜表達(dá)得到能同時(shí)攻擊K12和PAO1(RFP)能力的多價(jià)噬菌體YSZ1R；單一攻擊PAO1(RFP)的噬菌體YSZ5；在YSZ5基礎(chǔ)上加速寬宿主譜表達(dá)得到能同時(shí)攻擊PAO1(RFP)和K12能力的多價(jià)噬菌體YSZ5K。由圖1可知，噬菌體YSZ1和YSZ5的噬菌斑呈清晰透明、邊緣整齊、無(wú)暈環(huán)的圓斑，直徑約1～2 mm；噬菌體YSZ1R和YSZ5K噬菌斑中間透明、四周無(wú)暈環(huán)、直徑為2～3 mm。

圖1 四株噬菌體噬菌斑形態(tài)Fig. 1 Plaques of four phages

2.2 噬菌體形態(tài)觀察

通過(guò)透射電鏡觀察不同噬菌體形態(tài)，發(fā)現(xiàn)噬菌體YSZ1（圖2 A）具有清晰多面體頭部，頭長(zhǎng)徑約95 nm，橫徑約70 nm，尾長(zhǎng)約100 nm；YSZ1R可見到球狀頭部和一條長(zhǎng)尾，頭長(zhǎng)徑約60 nm，橫徑約70 nm，尾長(zhǎng)約175 nm（圖2 B）；YSZ5可見到形狀規(guī)則的立體結(jié)構(gòu)頭部和一條長(zhǎng)尾，頭長(zhǎng)徑約100 nm，橫徑約70 nm，尾長(zhǎng)約180 nm（圖2 C）；YSZ5K可見到橢圓形頭部及可收縮的尾鞘，頭長(zhǎng)徑約110 nm，橫徑約80 nm，尾長(zhǎng)約120 nm（圖2 D）。根據(jù)國(guó)際病毒分類委員會(huì)(The International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV)第九次報(bào)告［17］，以上四種噬菌體均屬于長(zhǎng)尾噬菌體科。

圖2 噬菌體的透射電鏡觀察（×50.0 K）Fig. 2 Transmission electron micrographs of phage（×50.0 K）

2.3 噬菌體核酸產(chǎn)物酶切電泳分析

利用環(huán)境樣品病毒核酸提取試劑盒提取噬菌體基因組，并對(duì)核酸產(chǎn)物用酶切處理，由圖3可知，四株噬菌體均能被DNase Ⅰ 降解完全（4、8、B、F泳道），而RNase A處理核酸均無(wú)變化（3、7、C、G泳道），說(shuō)明四種核酸產(chǎn)物均為雙鏈DNA［13］。用限制性內(nèi)切酶HindⅢ對(duì)DNA進(jìn)行酶切處理后，估算基因組大?。?、6、D、K泳道），四株噬菌體YSZ1、 YSZ1R、YSZ5、YSZ5K基因組分別約為57 Kb、54 Kb、59 Kb和51 Kb。

2.4 噬菌體最佳感染復(fù)數(shù)

最佳感染復(fù)數(shù)是表征噬菌體裂解能力的重要指標(biāo)。從表1可知，當(dāng)MOI為1∶1 000時(shí)噬菌體YSZ1子代產(chǎn)出量最高，達(dá)到5.5×108PFU·mL-1，即噬菌體YSZ1的OMOI為0.001；當(dāng)MOI為10∶1時(shí)噬菌體YSZ1R子代產(chǎn)出量最高，達(dá)到1.8×108PFU·mL-1，YSZ1R的OMOI為10；當(dāng)MOI為1∶1 000時(shí)噬菌體YSZ5子代產(chǎn)出量最高，達(dá)到5.4×109PFU·mL-1，YSZ5的OMOI為0.001；當(dāng)MOI為1∶10時(shí)噬菌體YSZ5K子代產(chǎn)出量最高，達(dá)5.8×106PFU·mL-1，YSZ5K的OMOI為0.1。

圖3 噬菌體基因組酶切電泳圖Fig. 3 Electrophorogram of phages genome

表1 最佳感染復(fù)數(shù)的測(cè)定Table1 Determination of optimal multiplicity of infection (OMOI)

2.5 一步生長(zhǎng)曲線的繪制

潛伏期是指從噬菌體侵染宿主細(xì)菌到細(xì)菌開始裂解時(shí)為止的周期；爆發(fā)期是指從細(xì)菌裂解開始到所有被感染細(xì)菌完全裂解的周期；裂解量=爆發(fā)末期噬菌體滴度/感染初期宿主細(xì)菌數(shù)量［18］。YSZ1感染宿主菌的潛伏期為13 min，爆發(fā)期為47 min，裂解量為365（圖4 A）；YSZ1R感染宿主菌的潛伏期為20 min，爆發(fā)期為51 min，裂解量為47（圖4 B）；YSZ5感染宿主菌的潛伏期為12 min，爆發(fā)期為49 min，裂解量為418（圖4 C）；YSZ5K感染宿主菌的潛伏期為18 min，爆發(fā)期為42 min，裂解量為24（圖4 D）。由此可知，四株噬菌體的潛伏期和爆發(fā)期相對(duì)較短，具有潛在的修復(fù)應(yīng)用價(jià)值。

2.6 專一型噬菌體對(duì)單一宿主菌的滅活能力

對(duì)上述分離得到的兩株專一型裂解性噬菌體在水相中進(jìn)行滅活能力驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。由圖5 A可知，單獨(dú)添加噬菌體YSZ1，能顯著抑制K12生長(zhǎng)（P＜0.05）；相較于對(duì)照組K12的生長(zhǎng)曲線，添加噬菌體YSZ1培養(yǎng)12 h后，K12數(shù)量下降至8.9個(gè)數(shù)量級(jí)。此外，由圖5 B可知，YSZ5對(duì)PAO1(RFP)也具有顯著的滅活作用（P＜0.05），相較于對(duì)照組PAO1(RFP)的生長(zhǎng)曲線，添加噬菌體YSZ5培養(yǎng)12 h后，PAO1(RFP)下降至9.2個(gè)數(shù)量級(jí)。

圖4 噬菌體一步生長(zhǎng)曲線Fig. 4 One step growth curve of phage

圖5 噬菌體滅活能力Fig. 5 Inactivation ability of phage

2.7 水相中檢驗(yàn)噬菌體療法滅活混合病原菌的效果

為了探究噬菌體靶向滅活病原菌的能力，本研究將上述獲得的四株噬菌體添加到K12和PAO1(RFP)的混合菌液中，并測(cè)定其細(xì)菌數(shù)量衰減變化。由圖6 A可知，專一型噬菌體YSZ1對(duì)K12的滅活效果非常顯著（P＜0.05），與原始CK相比，K12下降約1.5個(gè)數(shù)量級(jí)；而PAO1(RFP)呈現(xiàn)先快速增長(zhǎng)，28 h后再緩慢下降的趨勢(shì)，下降了約0.5個(gè)數(shù)量級(jí)，這可能是由于專一型噬菌體YSZ1在混合病原菌體系中，優(yōu)先攻擊K12宿主菌，隨著共培養(yǎng)的自然進(jìn)化過(guò)程，逐漸形成并具備了一定攻擊PAO1(RFP)的能力［12］。處理2（圖6 B）中添加了多價(jià)噬菌體YSZ1R之后，K12生長(zhǎng)抑制率相較于圖6 A結(jié)果略有下降，下降了約1.1個(gè)數(shù)量級(jí)；而PAO1(RFP)生長(zhǎng)抑制率則相較于圖6 A結(jié)果出現(xiàn)一定程度的上升，整體下降了約1.0個(gè)數(shù)量級(jí)。處理3（圖6 C）中，添加了專一型噬菌體YSZ5之后，PAO1(RFP)數(shù)量呈現(xiàn)顯著下降的趨勢(shì)（P＜0.05），下降了約1.9個(gè)數(shù)量級(jí)，同樣K12在0～24 h期間出現(xiàn)穩(wěn)定增長(zhǎng)后，呈下降趨勢(shì)，截止48 h時(shí)，共下降了約0.4個(gè)數(shù)量級(jí)，這可能是由于隨混合體系中宿主密度增加噬菌體的同時(shí)具備較高的吸附速率，其中部分YSZ5噬菌體也進(jìn)化出攻擊K12的廣譜滅活能力［12,19］。處理4（圖6 D）中，多價(jià)噬菌體YSZ5K對(duì)K12和PAO1(RFP)的協(xié)同滅活效果相較于其他三組處理，最為顯著（P＜0.05），K12下降約1.0個(gè)數(shù)量級(jí)，PAO1(RFP)下降約1.7個(gè)數(shù)量級(jí)。由此可知，多價(jià)噬菌體YSZ5K相對(duì)其他種類噬菌體滅活效果具有更加廣譜性的捕食范圍，可為后續(xù)靶向滅活污染土壤中復(fù)合病原菌的修復(fù)技術(shù)研發(fā)，提供高效的噬菌體菌種資源。

圖6 混合菌懸液中不同種噬菌體滅活效果Fig. 6 Inactivation effect of different phages in mixed bacteria suspension

2.8 噬菌體療法滅活污染土壤中復(fù)合病原菌的驗(yàn)證研究

在病原菌復(fù)合污染土壤中，病原菌豐度的變化是決定土壤污染程度和修復(fù)效果的重要參考。本研究中使用的土壤樣品采集自奶牛場(chǎng)牛糞堆積池附近的污染土壤，其中多種病原菌的背景豐度較高，在培養(yǎng)24 d時(shí)，糞腸桿菌（Fecal coliform）細(xì)菌豐度為8.2×106CFU·mL-1，假單胞菌屬（Pseudomonas）細(xì)菌豐度為6.8×105CFU·mL-1（圖7 A）。在第24天時(shí)，處理1中專一型噬菌體YSZ1對(duì)土壤中糞腸桿菌系列病原菌的滅活效果高于假單胞菌屬的相應(yīng)滅活效果。在該處理中，糞腸桿菌細(xì)菌豐度下降至8.7×105CFU·mL-1，而假單胞菌屬細(xì)菌豐度下降至6.1×104CFU·mL-1，這一結(jié)果可能是由于在實(shí)際污染土壤中，YSZ1也逐漸進(jìn)化出針對(duì)PAO1的協(xié)同滅活能力［12］；處理2（圖7 B）中，多價(jià)噬菌體YSZ1R對(duì)兩類病原菌都有明顯的滅活能力（P＜0.05），糞腸桿菌細(xì)菌豐度下降至9.6×105CFU·mL-1，假單胞菌屬細(xì)菌豐度下降至3.2×104CFU·mL-1；處理3（圖7 C）中，專一型噬菌體YSZ5對(duì)于假單胞屬細(xì)菌的滅活效果呈現(xiàn)整體呈下降趨勢(shì)，在第24天時(shí)已下降至1.8×104CFU·mL-1，而對(duì)于糞腸桿菌細(xì)菌的滅活影響，則呈現(xiàn)出0～15 d之內(nèi)略有升高，第15天后逐漸下降，第24天下降至2.2×106CFU·mL-1；處理4（圖7 D）中，添加了多價(jià)噬菌體YSZ5K之后，糞腸桿菌細(xì)菌和假單胞屬細(xì)菌豐度均呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，第24天，糞腸桿菌細(xì)菌豐度下降至6.5×105CFU·mL-1；假單胞屬細(xì)菌豐度下降至1.2×104CFU·mL-1。多價(jià)噬菌體（YSZ1R/YSZ5K）對(duì)污染土壤中復(fù)合病原菌綜合協(xié)同滅活能力均顯著高于專一型噬菌體（YSZ1/YSZ5），并且噬菌體YSZ5K在實(shí)際污染土壤中的滅活效果要大于噬菌體YSZ1R的相應(yīng)滅活效果。上述滅活土壤中復(fù)合病原菌的效果趨勢(shì)與水相中相關(guān)驗(yàn)證結(jié)果規(guī)律一致，盡管滅活土壤中病原菌群的效果略低于純水相中的效果，這可能是由于實(shí)際污染土壤中不僅存在復(fù)合病原菌群，同樣也存在大量益生菌群，抵消或削減了實(shí)際土壤滅活修復(fù)的效果［20-21］。然而，該結(jié)果仍然對(duì)于靶向修復(fù)高豐度病原菌污染土壤具有顯著的指示意義。

圖7 污染土壤中糞腸桿菌和假單胞菌屬細(xì)菌豐度的動(dòng)態(tài)變化Fig. 7 Dynamic of fecal coliform and Pseudomonas bacterial abundance in contaminated soil

2.9 噬菌體療法對(duì)土壤微生物群落多樣性的影響

噬菌體療法在靶向滅活土壤中復(fù)合病原菌的同時(shí)，可能也會(huì)對(duì)土壤其他益生菌群或整體微生物群落結(jié)構(gòu)和功能多樣性造成一定程度的影響［22］。因此，對(duì)施用過(guò)噬菌體療法的污染土壤進(jìn)行生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估十分必要。AWCD數(shù)值的變化可以反映土壤微生物整體代謝活性的波動(dòng)；香農(nóng)豐富度指數(shù)H反映的是群落的豐富度, 其值越大說(shuō)明群落多樣性越高；辛普森優(yōu)勢(shì)度指數(shù)D可反映土壤微生物群落常見種的優(yōu)勢(shì)度變化, 數(shù)值越大表明得到同一物種的幾率越大, 其微生物多樣性越低。

如圖8所示，0～120 h 內(nèi)AWCD值快速增長(zhǎng)，進(jìn)入對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期；在培養(yǎng)的120 h后，AWCD值隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)趨于緩慢并達(dá)到穩(wěn)定。AWCD值在0.1～0.7之間，AWCD值表現(xiàn)為YSZ5K＞YSZ1R＞CK＞YSZ5＞YSZ1。

此外，從表2可知，不同處理之間，多價(jià)噬菌體的豐富度指數(shù)H顯著高于單一性噬菌體的豐富度指數(shù)，而優(yōu)勢(shì)度指數(shù)D則為多價(jià)噬菌體處理顯著低于專一型噬菌體處理（P＜0.05）。在這些指數(shù)的變化過(guò)程中均具有類似規(guī)律，即分別單獨(dú)添加多價(jià)噬菌體YSZ5K處理和YSZ1R處理，均可在一定程度上顯著促進(jìn)修復(fù)后土壤微生物功能多樣性和穩(wěn)定性（P＜0.05），而分別單獨(dú)添加專一型噬菌體YSZ5處理和YSZ1處理，土壤微生物多樣性出現(xiàn)了一定程度的降低。

由此說(shuō)明，多價(jià)噬菌體療法對(duì)于維持或改善土壤微生物群落代謝活性具有一定的良性作用；而專一型的裂解性噬菌體對(duì)于土壤微生物群落代謝活性的影響，則存在一定負(fù)面風(fēng)險(xiǎn)。這可能是由于多價(jià)噬菌體的捕食范圍較廣，其自身進(jìn)化和拓展捕食宿主細(xì)菌的能力較強(qiáng)，因而有助于提升土壤微生物群落的多樣性和穩(wěn)定性。相反專一型宿主噬菌體在實(shí)際污染土壤環(huán)境中靶向滅活宿主菌的專屬性過(guò)強(qiáng)，則有可能導(dǎo)致某一屬種的宿主細(xì)菌大幅度滅活，致使土壤微生物群落系統(tǒng)中某一類細(xì)菌出現(xiàn)生態(tài)位的缺失，造成土壤微生物群落代謝活性降低的短期現(xiàn)象。因而，在實(shí)際噬菌體療法的應(yīng)用中，使用多價(jià)噬菌體同步滅活多種病原菌的技術(shù)具有廣譜性高、生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)低、環(huán)境友好的優(yōu)點(diǎn)。

圖8 不同處理方式下AWCD值的變化Fig. 8 Variation of AWCD value relative to different treatment

表2 不同處理方式土壤微生物群落功能多樣性指數(shù)Table 2 Diversity indices of soil microbial communities relative to different treatment

3 結(jié) 論

針對(duì)當(dāng)前病原菌復(fù)合污染土壤的環(huán)境問(wèn)題，本研究提出了基于噬菌體療法靶向滅活土壤中多種病原菌的修復(fù)技術(shù)。研究分離篩選出的多價(jià)噬菌體在水相和實(shí)際污染土壤中同步滅活糞腸桿菌和假單胞菌屬細(xì)菌的能力顯著高于專一型噬菌體的相應(yīng)滅活能力，同時(shí)使用多價(jià)噬菌體療法也有助于維護(hù)和改善修復(fù)后土壤微生物生態(tài)功能多樣性與穩(wěn)定性。