幾丁質(zhì)脫乙酰酶的特點(diǎn)及應(yīng)用

朱先玉，叢海花，尹 恒

(1.大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 大連 116023；2.中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所，天然產(chǎn)物與糖工程課題組，遼寧省碳水化合物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023)

幾丁質(zhì)是漁業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中蝦蟹殼的主要組成部分，每年全球產(chǎn)生約(600～800)×104t廢棄的蟹和蝦殼，這些廢棄的蝦蟹殼通常是被傾倒在垃圾填埋場(chǎng)或海洋中，造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染[1]。蝦蟹殼中所含的如蛋白質(zhì)、碳酸鈣和幾丁質(zhì)等物質(zhì)被忽略，也造成了資源浪費(fèi)。因此尋找可持續(xù)的方法來(lái)合理利用甲殼類(lèi)動(dòng)物的外殼已經(jīng)引起人們的廣泛關(guān)注。

殼聚糖是幾丁質(zhì)的脫乙?；a(chǎn)物，是由β-1，4-N-氨基葡萄糖組成的線性直鏈聚合物，是自然界唯一存在的堿性多糖[2]。部分乙?；臍す烟?COS)由N-乙酰葡糖胺(GlcNAc，A)和葡糖胺(GlcN，D)組成，是具有多種生物活性和潛在應(yīng)用價(jià)值的結(jié)構(gòu)復(fù)雜的生物聚合物[3]。殼聚糖具有廣譜的抑菌性、保水性、可再生性、良好的生物相容性、可降解性、細(xì)胞膜通透性、較高的載藥性、無(wú)毒副作用等特性，通過(guò)戊二醛交聯(lián)法、接枝、乙酰化等多種化學(xué)物理改性之后，可被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、環(huán)保、食品、農(nóng)業(yè)、造紙、化妝品等領(lǐng)域。部分乙?；臍す烟鞘怯行У纳镏苿?，具有抗炎、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、神經(jīng)保護(hù)和其他重要的藥物活性。它們的生物活性被認(rèn)為是取決于它們的結(jié)構(gòu)，即它們的聚合度、乙?；潭?，以及乙酰化模式[3]。

傳統(tǒng)化學(xué)法生產(chǎn)殼聚糖和殼寡糖需要強(qiáng)酸強(qiáng)堿和高溫等復(fù)雜的處理方法[4]，不僅反應(yīng)條件要求苛刻，而且會(huì)產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物，導(dǎo)致環(huán)境污染嚴(yán)重、分離困難等諸多難題的出現(xiàn)[5]。幾丁質(zhì)脫乙酰酶(CDA)可以直接從幾丁寡糖上脫去乙?；蓺す烟?，該酶廣泛存在于真核生物和原核生物中[6]。生物酶法生產(chǎn)殼聚糖的反應(yīng)條件溫和、無(wú)污染，且產(chǎn)物殼寡糖的聚合度、脫乙酰度、脫乙?；Ｊ絾我唬虼藥锥≠|(zhì)脫乙酰酶引起了人們的廣泛關(guān)注[7]。目前已經(jīng)有報(bào)道把幾丁質(zhì)脫乙酰酶成功構(gòu)建至畢赤酵母或大腸桿菌中進(jìn)行異源表達(dá)，以獲得表達(dá)量高、穩(wěn)定性好、活性高的幾丁質(zhì)脫乙酰酶[8]。本文主要從幾丁質(zhì)脫乙酰酶的來(lái)源、脫乙?；Ｊ?、催化機(jī)制及幾丁脫乙?；傅臐撛趹?yīng)用等方面進(jìn)行了綜述。

1 CDA的來(lái)源

CDA廣泛存在于細(xì)菌、真菌和昆蟲(chóng)基因組中，能催化水解幾丁質(zhì)或幾丁寡糖中N-乙酰氨基葡萄糖胺的乙酰基，形成殼聚糖和殼寡糖，與傳統(tǒng)生產(chǎn)殼聚糖相比，酶法生產(chǎn)殼聚糖反應(yīng)條件溫和、環(huán)保無(wú)污染、耗能低，是近年來(lái)研究生產(chǎn)殼聚糖方法的主要研究對(duì)象。目前已經(jīng)確定了來(lái)自細(xì)菌、真菌和昆蟲(chóng)的CDA，如根瘤菌(Rhizobiummeliloti)[9]、新生隱球菌(Cryptococcusneoformans)[10]、粉紋夜蛾(Mamestraconfigurata)[11]等。

在以上報(bào)道的幾丁質(zhì)脫乙酰酶中，其中已經(jīng)有4個(gè)脫乙酰酶被研究得比較徹底，他們的晶體結(jié)構(gòu)也已經(jīng)被解析。來(lái)源于真菌病原體炭疽病菌(Colletotrichumlindemuthianum)分泌內(nèi)切幾丁質(zhì)脫-N-乙酰化酶(ClCDA，PDB ID：2IW0)能夠在感染期間修飾暴露的菌絲幾丁質(zhì)[12]。來(lái)源于兔腦原蟲(chóng)(Encephalitozooncuniculi)的推定的幾丁質(zhì)脫乙酰酶[13](ECU11_0510，2vyo)定位于質(zhì)膜和內(nèi)生孢子之間的界面，可以修飾孢子中的幾丁質(zhì)，以逃避宿主中幾丁質(zhì)酶的水解，可能對(duì)于兔腦原蟲(chóng)在宿主中的存活是重要的。來(lái)源于口腔病原體變形鏈球菌(Streptococcusmutans)的推定的多糖脫乙酰酶(PgdA，PDB ID：2W3Z)與人黏膜溶菌酶的細(xì)菌防御機(jī)制有關(guān)[14]。來(lái)源于霍亂弧菌(Vibriocholerae)的幾丁質(zhì)脫乙酰酶(VcCDA)的酶與底物共結(jié)晶表明不同來(lái)源的CDA表現(xiàn)出的特定發(fā)脫乙?；Ｊ绞怯申P(guān)鍵環(huán)(Loop)控制[4]。不同來(lái)源的幾丁質(zhì)脫乙酰酶都具有6個(gè)保守的Loop，Loop所在的位置、長(zhǎng)短及其動(dòng)力學(xué)效應(yīng)對(duì)幾丁質(zhì)脫乙酰酶的特定的脫乙酰模式具有重要影響(圖1)。

2 CDA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

幾丁質(zhì)脫乙酰酶(EC 3.5.1.41)與乙酰木聚糖酯酶(EC 3.1.1.72)、殼寡糖脫乙酰酶(EC 3.5.1-)、肽聚糖GlcNAc脫乙酰酶(EC 3.5.1-)、肽聚糖N-乙酰胞壁酸脫乙酰酶(EC 3.5.1-)同屬于糖苷水解酶第四家族(CE4)[15]。Blair等通過(guò)對(duì)來(lái)源于糖苷水解酶第四家族氨基酸進(jìn)行多重序列比對(duì)，顯示CDA家族的序列中含有五個(gè)保守基序(圖2)，這些基序中含有保守的天冬氨酸和組氨酸殘基，這些保守序列構(gòu)成了CDA的活性位點(diǎn)[16]。這五個(gè)基序被分別命名為基序1(TFDD)、基序2(HSWSHP)、基序3(RPPY)、基序4(DSLDW)、基序5(GSIVLMH)?；?(TFDD)包括兩個(gè)天冬氨酸殘基：一個(gè)天冬氨酸殘基與鋅或鈷相互作用，第二個(gè)天冬氨酸殘基與底物結(jié)合，使反應(yīng)生成乙酸。基序2(HSWSHP)中含有兩個(gè)組氨酸，一個(gè)絲氨酸或一個(gè)蘇氨酸，其中組氨酸可以與金屬離子結(jié)合穩(wěn)定酶的結(jié)構(gòu)，絲氨酸或蘇氨酸可以與組氨酸結(jié)合形成氫鍵。基序3(RPPY)形成了活性位點(diǎn)凹槽的一側(cè)，它可以結(jié)合醋酸、鋅，并協(xié)調(diào)天冬氨酸的催化活性，酪氨酸可以與乙酸形成氫鍵，當(dāng)來(lái)源于肺炎鏈球菌的肽聚糖脫乙酰酶中酪氨酸突變?yōu)楸彼釙r(shí)，該酶就會(huì)發(fā)生失活。基序4(DSLDW)構(gòu)成了活性位點(diǎn)溝槽的另一側(cè)，色氨酸是該基序的關(guān)鍵氨基酸?；?(GSIVLMH)包含來(lái)自于疏水口袋的亮氨酸和來(lái)自于和產(chǎn)物乙酸結(jié)合的組氨酸[16]。

3 CDA的催化機(jī)制

CDA是一種金屬酶，因此該酶與大多數(shù)的金屬酶的催化機(jī)制相同，均為金屬輔助的酸/堿催化作用[17]。CDA的催化機(jī)制涉及保守的催化氨基酸(Asp和His)和保守的基序(MT1-5)，金屬離子與保守基序中的酸堿氨基酸殘基結(jié)合形成催化三聯(lián)體[17]。到目前為止，只有四種不同來(lái)源(ColletotrichumAspergillus、Vibrio和Arthrobacter)的幾丁質(zhì)脫乙酰酶的晶體結(jié)構(gòu)被解析，其催化機(jī)制均為金屬輔助的酸堿催化機(jī)制。其中VcCDA是第一個(gè)被用于解析酶和底物復(fù)合體的幾丁質(zhì)脫乙酰酶。通過(guò)研究該酶的無(wú)活性突變體與幾丁二糖、幾丁三糖的共結(jié)晶復(fù)合物結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)底物的幾丁寡糖的羥基也參與了金屬的配位。VcCDA中的Zn2 +與His97和His101的咪唑氮、Asp40的羧酸酯基、N-乙?；难踉雍虶lcNAc環(huán)的羥基氧配位。扭曲的八面體配合由水分子完成。在活化后，該水分子被認(rèn)為是負(fù)責(zé)去除N-乙酰基的親核試劑[4]。因此幾丁寡糖脫乙酰化形成殼寡糖。

4 CDA的特定脫乙酰模式

已經(jīng)被報(bào)道的來(lái)源于細(xì)菌、真菌、昆蟲(chóng)等生物的脫乙酰酶，由于其在這些生物中CDA表達(dá)量低、生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、難以分離純化等難題難以解決，所以通常將CDA在大腸桿菌或者酵母中進(jìn)行異源表達(dá)，因其操作簡(jiǎn)單并能在廉價(jià)的培養(yǎng)基中高密度培養(yǎng)等特征，使其在大多數(shù)科研應(yīng)用中成為高效表達(dá)異源蛋白的方法。

目前已經(jīng)有一些幾丁質(zhì)脫乙酰酶在原核宿主和真核宿主中得以表達(dá)。并且不同來(lái)源的幾丁質(zhì)脫乙酰酶的脫乙酰模式不同，主要被分為單點(diǎn)攻擊[9]和多重攻擊兩種方式[18]。在單點(diǎn)攻擊中幾丁質(zhì)脫乙酰酶結(jié)合幾丁寡糖只發(fā)生單個(gè)位點(diǎn)的脫乙?；痆9，19]。例如來(lái)源于根瘤菌(Rhizobiummeliloti)的脫乙?；竷H在幾丁寡糖的非還原端發(fā)生脫乙?；a(chǎn)生脫乙酰模式為DAn-1的部分乙酰化的殼寡糖[9](圖3A)。而來(lái)源于霍亂弧菌(Vibriocholerae)的幾丁質(zhì)脫乙酰酶(VcCDA)只能水解距離還原端倒數(shù)第二位的乙酰基，即產(chǎn)生An-2DA的乙?；Ｊ降牟糠忠阴；Ｊ降臍す烟荹19](圖3B)。而多重攻擊則是幾丁質(zhì)脫乙酰酶結(jié)合幾丁質(zhì)寡糖鏈之后發(fā)生連續(xù)的或不連續(xù)的脫乙?；痆20]。例如來(lái)源于炭疽病菌(Colletotrichumlindemuthianum)分泌內(nèi)切幾丁質(zhì)脫-N-乙?；?ClCDA)能夠使幾丁寡糖發(fā)生完全的脫乙?；a(chǎn)生不含乙?；臍す烟羌礊镈n(D=GlcN)的脫乙酰模式[12](圖3C)。來(lái)源于禾柄銹菌(Pucciniagraminis)的幾丁質(zhì)脫乙?；竸t不能使位于非還原端的兩個(gè)GlcNAc單元去乙?；?，即產(chǎn)生A2Dn-2(D=GlcN，A=GlcNAc)乙酰化模式的部分乙?；臍す烟荹3](圖3D)。

5 幾丁質(zhì)脫乙酰酶的生物學(xué)功能及應(yīng)用

5.1 幾丁質(zhì)脫乙酰酶被作為藥物靶向受體

細(xì)菌感染嚴(yán)重地威脅著人類(lèi)的健康[21]。隨著抗生素的廣泛使用，耐藥細(xì)菌的種類(lèi)也在不斷地增加。這些耐藥菌所引起的感染率、死亡率也在逐年升高，細(xì)菌耐藥問(wèn)題愈演愈烈，嚴(yán)重威脅醫(yī)療安全。細(xì)菌細(xì)胞膜上的肽聚糖通常被認(rèn)為是宿主先天免疫系統(tǒng)的主要靶標(biāo)，肽聚糖的解離將導(dǎo)致細(xì)菌裂解。而細(xì)菌體內(nèi)的脫乙酰酶參與了肽聚糖的脫乙?；退拗魅芫傅目剐?，因此病原體能夠侵入宿主并引起宿主的感染[4]。例如霍亂弧菌(Vibriocholerae)一種潛在的破壞性腸道感染的人類(lèi)病原體位于海洋、河口和淡水水生環(huán)境中，常常附著在甲殼類(lèi)動(dòng)物上，人們通過(guò)飲用被污染的水或攝入錯(cuò)誤方式烹飪的甲殼類(lèi)動(dòng)物如蝦蟹等，將導(dǎo)致霍亂弧菌進(jìn)入人體引起細(xì)菌感染。一些蠟狀芽孢桿菌對(duì)人類(lèi)有害并能夠引起食源性疾病的革蘭氏陽(yáng)性菌，與高毒力炭疽芽孢桿菌的親緣關(guān)系較近，它的基因組中含有10種多糖脫乙酰酶。其中，肽聚糖N-乙酰葡糖胺脫乙酰酶是引起細(xì)胞毒力所必需的酶并參與對(duì)宿主溶菌酶的抗性[22]。因此鑒定并分析細(xì)菌來(lái)源的幾丁質(zhì)脫乙酰酶結(jié)構(gòu)和底物的特異性相互作用是開(kāi)發(fā)新的抗感染劑的有吸引力的靶標(biāo)。

5.2 調(diào)控昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育

研究發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)脫乙酰酶(CDAs)嚴(yán)格調(diào)節(jié)昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)和發(fā)育，晚期幼蟲(chóng)階段高度表達(dá)轉(zhuǎn)錄物水平與其他生長(zhǎng)時(shí)期相比顯著提高。通過(guò)RNA抑制的方法可以顯著降低幾丁質(zhì)脫乙酰酶的轉(zhuǎn)錄水平，導(dǎo)致幼蟲(chóng)蛹蛻皮困難并產(chǎn)生高的幼蟲(chóng)死亡率[23]。例如Yan Xiaoping等通過(guò)PCR擴(kuò)增克隆了來(lái)自美國(guó)白蛾的幾丁質(zhì)脫乙酰酶的全長(zhǎng)序列，從美國(guó)白蛾的轉(zhuǎn)錄組中搜索了兩個(gè)幾丁質(zhì)脫乙酰酶序列，推導(dǎo)的蛋白質(zhì)序列顯示這兩個(gè)幾丁質(zhì)脫乙酰酶分別含有由18個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽和含有524和518個(gè)氨基酸殘基組成的前蛋白；這兩個(gè)幾丁質(zhì)脫乙酰酶含有幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域、低密度脂蛋白受體A類(lèi)結(jié)構(gòu)域和多糖脫乙酰酶催化結(jié)構(gòu)域；基因表達(dá)分析顯示這兩個(gè)幾丁質(zhì)脫乙酰酶均在頭、體、前腸、中腸、后腸和脂肪體以及第5齡幼蟲(chóng)的第1～5天中進(jìn)行表達(dá)，蛋白質(zhì)印跡分析顯示，頭部和體表中的幾丁質(zhì)脫乙酰酶蛋白表達(dá)量高，并且在第5齡期的發(fā)育表達(dá)結(jié)果顯示幾丁質(zhì)脫乙酰酶在第1～2天高度存在，然而幾丁質(zhì)脫乙酰酶的沉默導(dǎo)致了美國(guó)白蛾蛻皮失敗和死亡[24]。因此幾丁質(zhì)脫乙酰酶對(duì)于昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育是必需的，昆蟲(chóng)來(lái)源的幾丁質(zhì)脫乙酰酶可能是害蟲(chóng)控制的潛在目標(biāo)。

5.3 生產(chǎn)特定結(jié)構(gòu)的殼寡糖

殼聚糖和部分乙?；臍す烟且呀?jīng)被證明具有優(yōu)異的物理化學(xué)性質(zhì)和許多有益的生物活性[25]。例如用殼寡糖處理之后的植物能夠提高抗逆性[26]；殼聚糖被作為醫(yī)用材料，用于胚胎干細(xì)胞的定向分化、燒傷皮膚的恢復(fù)與重生、止血抑菌的生物膜等[27]。然而這些生物學(xué)功能并不穩(wěn)定：有時(shí)這些生物學(xué)功能會(huì)被看到，但并非總是如此。這種穩(wěn)定性的缺乏嚴(yán)重阻礙了殼聚糖和部分乙?；瘹す烟堑纳虡I(yè)應(yīng)用和發(fā)展。殼寡糖及其衍生物的生物活性和理化性質(zhì)被認(rèn)為是取決于它們的乙?；Ｊ?。然而，通過(guò)化學(xué)法生產(chǎn)的殼聚糖和部分乙?；臍ぞ厶峭ǔｏ@示隨機(jī)的乙酰化模式，使得它們的生物活性難以被控制和預(yù)測(cè)。相反，由幾丁質(zhì)脫乙酰酶(CDA)產(chǎn)生的部分乙?；瘹す烟强删哂刑囟ǖ囊阴；Ｊ?。例如來(lái)源于Pucciniagraminisf.sp.tritici的幾丁質(zhì)脫乙酰酶能夠產(chǎn)生具有AADD、AADDD和AADDDD(A，GlcNAc；D，GlcN)的特異性乙?；Ｊ降牟糠忠阴；臍す烟荹3]；來(lái)源于Vibriocholerae的脫乙酰酶能夠產(chǎn)生具有DD、DDA、DDAA、DDAAA、DDAAAA的特異性乙?；Ｊ降牟糠忠阴；臍す烟荹19]；來(lái)源于Colletotrichumlindemuthianum的幾丁質(zhì)脫乙酰酶能夠產(chǎn)生具有DD、DDD、DDDD、DDDDD、DDDDDD的特異性乙?；Ｊ降牟糠忠阴；臍す烟荹20]。因此通過(guò)幾丁質(zhì)脫乙酰酶產(chǎn)生的特定乙?；Ｊ降臍す烟牵磥?lái)能夠被用于闡明部分乙?；瘹す烟堑木酆隙?、乙酰化程度和乙?；Ｊ皆谖⑸?、植物、人體細(xì)胞等方面的具體生物學(xué)活性。