等電點(diǎn)沉淀法提取牡蠣蛋白及其蛋白組成分析

姜燕蓉，張亞飛，齊筱瑩，王丹妮，田茂鴻，趙 慧

(大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 大連 116623)

牡蠣(又稱海蠣子)是軟體動(dòng)物門(mén)、瓣鰓綱、異柱目、牡蠣科的雙殼貝類，是世界第一大養(yǎng)殖貝類，也是中國(guó)養(yǎng)殖產(chǎn)量最大的經(jīng)濟(jì)貝類[1]。牡蠣含有糖原、維生素、?；撬岷豌~、鐵、鋅等微量元素，其營(yíng)養(yǎng)成分豐富。而且牡蠣中蛋白質(zhì)含量較高，可以作為良好蛋白質(zhì)來(lái)源[2-3]。但是，目前我國(guó)對(duì)牡蠣各部分的加工利用研究較少，對(duì)其蛋白質(zhì)的相關(guān)性質(zhì)也尚不清楚，使得牡蠣的合理加工和高值化應(yīng)用受到一定的限制。

等電點(diǎn)沉淀法是通過(guò)在較低pH值或較高pH值條件下使蛋白質(zhì)溶解，通過(guò)離心或過(guò)濾將其與不溶性物質(zhì)(骨骼、皮膚或脂質(zhì))分離，然后使其在等電點(diǎn)下沉淀獲得高含量蛋白質(zhì)的過(guò)程[4]。蛋白質(zhì)中的氨基酸在pH值變化時(shí)會(huì)發(fā)生一定程度的電離，導(dǎo)致其在溶液中的溶解度發(fā)生變化[5]。相比較鹽析法、有機(jī)溶劑萃取法和酶水解法等其他蛋白質(zhì)提取分離方法，等電點(diǎn)沉淀法具有蛋白質(zhì)回收率高、蛋白質(zhì)變性程度小、安全性較好等優(yōu)點(diǎn)[6]。不同來(lái)源的分離蛋白因含有的氨基酸不同導(dǎo)致其溶解和沉淀pH值不相同。魷魚(yú)和鳙魚(yú)蛋白在pH值為3和11的條件下溶解，當(dāng)pH值為5.5時(shí)沉淀獲得的分離蛋白提取率分別高達(dá)75%和79%[7-8]。在料液比1∶9、溶解pH值2.0～3.0和12.0～13.0、沉淀pH值5.5條件下，斑節(jié)對(duì)蝦蛋白提取率為75.67%～82.72%[9]。

本研究以牡蠣為原料，將等電點(diǎn)沉淀法應(yīng)用于牡蠣蛋白的制備，通過(guò)優(yōu)化提取溫度、溶解pH、提取時(shí)間和沉淀pH四個(gè)主要影響因素，確定牡蠣蛋白制備的最佳堿溶工藝條件，并對(duì)牡蠣中各蛋白組分進(jìn)行了分析，通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)測(cè)定了其分子質(zhì)量分布，以期為進(jìn)一步加工利用牡蠣蛋白提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料處理與試劑

牡蠣(大連灣牡蠣，Ostreamtailienwhanensis)，購(gòu)于大連黑石礁海鮮市場(chǎng)，新鮮貝肉去殼去內(nèi)臟，清洗干凈，勻漿后冷凍干燥得到牡蠣凍干粉；混合蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品：Takara寶生物工程有限公司；NaOH、乙醇、三氯乙酸等試劑：均為分析純。

1.2 儀器設(shè)備

BS-224S分析天平：賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；BL25B36勻漿機(jī)：廣東美的生活電器制造有限公司；SYG-2恒溫水浴鍋：常州朗越儀器制造有限公司；H-1850R離心機(jī)：湘儀離心機(jī)儀器有限公司；SCIENTZ-10ND冷凍干燥機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司；SP-721E 721分光光度計(jì)：上海光譜儀器公司；KDN-08消化爐：金壇市指前鎮(zhèn)旭日實(shí)驗(yàn)儀器廠；馬弗爐；JJ-1磁力攪拌：常州國(guó)華電器有限公司；PHS-25 pH計(jì)：上海雷磁儀器有限公司；MD 77透析袋(MW：12～14 kDa)：美國(guó)聯(lián)合碳化物公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 基本成分的測(cè)定

水分含量的測(cè)定：GB 5009.3—2016《食品中水分的測(cè)定》，直接干燥法；

灰分含量的測(cè)定：GB 5009.4—2010《食品中灰分的測(cè)定》，灼燒稱重法；

粗蛋白質(zhì)含量的測(cè)定：GB 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》，微量凱氏定氮法；

粗脂肪含量的測(cè)定：GB 5009.6—2016《食品中脂肪的測(cè)定》，索氏抽提法；

總糖含量的測(cè)定：GB 5009.7—2016《食品中總糖的測(cè)定》，苯酚硫酸法；

1.3.2 最佳堿溶工藝優(yōu)化

對(duì)Palafox H等[7]的方法稍作修改，進(jìn)行牡蠣分離蛋白的制備。

稱取一定質(zhì)量牡蠣凍干粉，加入蒸餾水溶解后(料液比1∶3)均質(zhì)化，加入0.1 mol/L NaOH溶液提取分離蛋白，4℃、9 000 r/min離心20 min，收集上清液，測(cè)定蛋白質(zhì)含量。固定堿溶提取條件為提取溫度25℃、溶解pH值11.0、提取時(shí)間1.5 h。本文考察了提取溫度(10、20、30、40、50、60、70、80℃)、溶解pH值(9.0、10.0、11.0、12.0、13.0)和提取時(shí)間(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h)三種因素對(duì)堿溶過(guò)程中牡蠣分離蛋白溶解性的影響。

1.3.3 最佳沉淀pH值工藝優(yōu)化

通過(guò)1.3.2條件制備蛋白提取液后，用0.1 mol/L HCl調(diào)節(jié)溶液將pH值調(diào)節(jié)為3.2、3.6、4.0、4.4、4.8、5.2、5.6、6.0，在4℃下放置1 h后，4℃、8 000 r/min離心15 min，分別收集沉淀和上清液，上清液采用100 mL容量瓶定容，進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測(cè)定，從而確定最佳酸沉pH值。

1.3.4 牡蠣蛋白組分分離

參照Osborne分級(jí)法[10]對(duì)牡蠣勻漿中四種蛋白質(zhì)進(jìn)行分級(jí)分離。

1)采用500 mL蒸餾水溶解100 g牡蠣凍干粉→室溫?cái)嚢? h→4℃、8 000 r/min離心20 min→沉淀重復(fù)水提2次，合并2次上清液→冷凍干燥→水溶性蛋白。

2)在1)所得的沉淀中加入1 000 mL 50 mmol/L pH 8.0的Tris-HCl緩沖液(含500 mL 0.5 mol/ L NaCl)進(jìn)行溶解→室溫?cái)嚢? h→4℃、8 000 r/min離心20 min→沉淀中加500 mL 0.5 mol/L NaCl提取→合并2次上清液→4℃、去離子水中透析(MWCO：8 000 Da)72 h→蛋白質(zhì)離心→沉淀進(jìn)行冷凍干燥→鹽溶性蛋白。

3)在2)所得的沉淀中加入1 000 mL 45%的乙醇進(jìn)行溶解→室溫?cái)嚢? h→ 4℃、8 000 r/min離心20 min→沉淀加入500 mL 45%的乙醇后離心→合并2次上清液→濃縮→冷凍干燥→醇溶性蛋白。

4)在3)所得的沉淀中加入1 000 mL 0.05 mol/L NaOH進(jìn)行溶解→室溫?cái)嚢? h→4℃、8 000 r/min離心20 min→沉淀中加入500 mL 45% NaOH后離心→合并上清液，邊攪拌邊向其中滴加20%(W/V)三氯乙酸，至三氯乙酸的最終濃度為5%(W/V)→4℃、10 000 r/min離心20 min→沉淀用預(yù)冷的丙酮洗滌三次→熱風(fēng)干燥→堿溶性蛋白。

1.3.5 牡蠣各蛋白組分分析

蛋白質(zhì)含量的測(cè)定根據(jù)GB 5009.5—2016，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換系數(shù)為6.25，其中：

1.3.6 牡蠣各蛋白組分SDS-PAGE電泳測(cè)定

用5% SDS將1.3.3和1.3.4得到的蛋白質(zhì)溶解，然后用上樣緩沖液(β-巰基乙醇)處理樣品，采用R250考馬斯亮藍(lán)進(jìn)行染色。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳條件為5%濃縮膠、12%分離膠。通過(guò)Gel-Pro Analyzer分析軟件對(duì)電泳圖譜進(jìn)行分析。

1.3.7 統(tǒng)計(jì)與分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差的方式進(jìn)行表述。數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0和Excel進(jìn)行處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 牡蠣基本成分組成

牡蠣的基本成分組成結(jié)果如表1所示。新鮮牡蠣中水分含量為81.42%，牡蠣凍干粉中粗蛋白含量達(dá)到57.21%，總糖含量為33.09%，粗脂肪含量為3.08%，灰分含量為6.48%。結(jié)果顯示牡蠣中含有豐富的蛋白質(zhì)，這與邱娟等[11]研究的結(jié)果一致。在去內(nèi)臟牡蠣中，還含有較高含量的灰分，是因?yàn)槟迪犞泻邢喈?dāng)含量的礦物質(zhì)元素，如Mg、Ca、Fe、Zn和Al等。

表1 牡蠣基本成分分析(干基)

2.2 等電點(diǎn)沉淀法提取牡蠣蛋白工藝優(yōu)化

2.2.1 提取溫度對(duì)牡蠣蛋白含量的影響

提取溫度對(duì)牡蠣蛋白含量的影響如圖1所示。由圖所知，在10～80℃的溫度范圍內(nèi)，牡蠣蛋白含量隨提取溫度的增加變化并不顯著。并且在高溫條件下提取蛋白質(zhì)的含量并無(wú)顯著變化，與董淑華等[12]在4～50℃提取鳶烏賊蛋白結(jié)果一致。這可能是由于牡蠣蛋白并未發(fā)生變性，高溫可能只是使其部分蛋白質(zhì)失活，所以對(duì)分離蛋白含量影響不大。因此，在室溫條件下進(jìn)行提取操作即可。

2.2.2 溶解pH值對(duì)牡蠣蛋白含量的影響

溶解pH值對(duì)牡蠣蛋白含量的影響如圖2所示。由圖2可知，牡蠣蛋白的含量隨pH值的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)pH值為12.0時(shí)，牡蠣蛋白含量達(dá)到2.8%，之后蛋白質(zhì)含量下降，可能是過(guò)高的pH值造成蛋白質(zhì)變性，使其沉淀析出，從而使最后上清液中蛋白質(zhì)含量降低。由此可知，pH值為12.0時(shí)，牡蠣蛋白溶解性較好，pH值過(guò)高、過(guò)低都會(huì)造成蛋白含量下降。因此根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取pH值為12.0為最佳提取pH值。

2.2.3 提取時(shí)間對(duì)牡蠣蛋白含量的影響

提取時(shí)間對(duì)牡蠣蛋白含量的影響如圖3所示。根據(jù)圖3可知，當(dāng)提取時(shí)間為0.5～1.0 h時(shí)，延長(zhǎng)提取時(shí)間，溶液中牡蠣蛋白含量增加。當(dāng)提取時(shí)間延長(zhǎng)至1.0 h以后，其對(duì)牡蠣蛋白含量并無(wú)明顯影響。說(shuō)明堿提1.0 h，堿溶體系達(dá)到平衡。因此選擇溶解時(shí)間為1.0 h。

2.2.4 沉淀pH值對(duì)牡蠣蛋白含量的影響

沉淀pH值對(duì)牡蠣蛋白含量的影響如圖4所示。當(dāng)pH值為3.2～4.0時(shí)，溶液中蛋白質(zhì)含量隨著pH值的增加呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，并在pH 值達(dá)到4.0時(shí)分離蛋白含量最低(0.66%)，pH值在4.0～6.5范圍內(nèi)時(shí)，蛋白含量隨pH值增加而增加。以上結(jié)果說(shuō)明蛋白最佳酸沉范圍在4.0～4.4之間。綜合考慮，選擇最佳酸沉pH值為4.0。

2.2.5 提取驗(yàn)證試驗(yàn)

綜合上述結(jié)果確定堿溶提取工藝：在室溫條件下，調(diào)整溶解pH值為12.0，堿提時(shí)間為1.0 h，離心后將上清液pH值調(diào)整至4.0，再次離心取沉淀。將沉淀通過(guò)8～12 kDa透析袋透析除鹽，冷凍干燥后得到牡蠣蛋白。在此條件下制備得到的牡蠣蛋白提取率為65.6%，蛋白純度為84.3%。陳麗等[13]采用有機(jī)溶劑萃取法提取12 h，得到褶牡蠣蛋白提取率僅為21.15%，遠(yuǎn)低于等電點(diǎn)沉淀法提取牡蠣蛋白的提取率。等電點(diǎn)沉淀法可以有效提高牡蠣蛋白的提取率，為牡蠣產(chǎn)品高附加值加工和利用提供理論依據(jù)。

2.3 牡蠣蛋白的分離

去內(nèi)臟牡蠣肉中富含蛋白質(zhì)，為明確牡蠣蛋白各組分的含量特點(diǎn)及功能特性，利用傳統(tǒng)的Osborne蛋白分級(jí)方法，根據(jù)每種蛋白組分溶解特性的區(qū)別，提取得到四種蛋白組分結(jié)果如表2所示。

鹽溶性蛋白在肌肉中種類豐富，含量較多。主要由肌原纖維蛋白組成，包括肌球蛋白重鏈(MHC)、輕鏈(MYL)、肌動(dòng)蛋白(Actin)和軟體動(dòng)物特有的副肌球蛋白(PM)和相對(duì)分子質(zhì)量較小的原肌球蛋白等[14]。在牡蠣蛋白中，鹽溶性蛋白提取率為49.82%，純蛋白組分占原料的18.51%，是牡蠣蛋白中優(yōu)勢(shì)蛋白組分。水溶性蛋白主要指存在于肌肉細(xì)胞肌漿中的肌漿蛋白，主要成分是代謝相關(guān)的酶蛋白，如乳酸脫氫酶、醛縮酶、TG酶等，其成分較為復(fù)雜[15]。牡蠣肌肉中水溶性蛋白純蛋白組分占原料的8.82%，提取率為12.03%，相比較魚(yú)臺(tái)魚(yú)蛋白中水溶性蛋白的含量(76.12%)，牡蠣蛋白中水溶性蛋白含量較少[16]。堿溶性蛋白和醇溶性蛋白提取率分別為14.64%和7.42%，其純蛋白組分分別占原料的10.49%和1.44%。因此，牡蠣蛋白各級(jí)組分中含量依次為鹽溶性蛋白>堿溶性蛋白>水溶性蛋白>醇溶性蛋白。將該結(jié)果與張晶晶等對(duì)近江全牡蠣蛋白各組分含量分析結(jié)果[17]進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，全牡蠣蛋白中水溶性蛋白含量較高(37.79%)，而鹽溶性蛋白含量(31.10%)低于去內(nèi)臟牡蠣(49.82%)，這可能是由于在去除內(nèi)臟的過(guò)程中造成了內(nèi)源性蛋白酶的大量損失，從而造成水溶性蛋白含量較低。

表2 牡蠣各蛋白組分的提取結(jié)果

注：提取率為3次提取得率平均值±SD。

Note：Values were shown as mean±standard deviation of three determinations.

2.4 牡蠣各級(jí)蛋白分子量分布

目前，SDS-PAGE技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)蛋白質(zhì)分子量分布的研究[17-18]。本研究以β-巰基乙醇為上樣液，比較了經(jīng)上樣液處理和未經(jīng)上樣液處理的樣品差異性，并對(duì)等電點(diǎn)沉淀法提取的分離蛋白、鹽溶性蛋白、水溶性蛋白、堿溶性蛋白和醇溶性蛋白的分子量分布進(jìn)行了分析，結(jié)果如圖5所示。

注：泳道M：Marker標(biāo)準(zhǔn)蛋白；泳道 1～5(經(jīng)β-巰基乙醇處理的樣品)，依次為pH調(diào)節(jié)法制備的分離蛋白、水溶性蛋白、鹽溶性蛋白、醇溶性蛋白和堿溶性蛋白；泳道 6～10(未經(jīng) β-巰基乙醇還原處理的蛋白樣品)，依次為pH調(diào)節(jié)法制備蛋白、水溶性蛋白、鹽溶性蛋白、醇溶性蛋白和堿溶性蛋白。

Notes：Lane M：Marker standard protein；Lane 1 to 5(Samples were treated with β-mercaptoethanol)：isoelectric precipitation of protein，water-soluble protein，salt-soluble protein，alcohol-soluble protein and alkali-soluble protein，respectively；Lane 6 to 10(Samples were not treated with β-mercaptoethanol)：isoelectric precipitation of protein，water-soluble protein，salt-soluble protein，alcohol-soluble protein and alkali-soluble protein,respectively.

β-巰基乙醇能夠打開(kāi)蛋白質(zhì)的二硫鍵，使蛋白質(zhì)中的亞基游離出來(lái)，所以通常經(jīng)過(guò)β-巰基乙醇處理后的樣品電泳條帶比未經(jīng)處理的樣品電泳條帶多[19]。通過(guò)等電點(diǎn)沉淀法制備的蛋白質(zhì)樣品分子量分布比較分散，經(jīng)上樣液處理后的蛋白在44.3 kDa處有明顯的條帶，而未經(jīng)上樣液處理后的蛋白在97.2 kDa處有明顯的條帶。這可能是由于β-巰基乙醇使97.2 kDa處蛋白質(zhì)二硫鍵打開(kāi)釋放出亞基。

β-巰基乙醇處理后牡蠣鹽溶性蛋白分布范圍為200.0～250.0 、97.2～200.0、44.3 kDa三部分，所對(duì)應(yīng)的蛋白種類為MHC、PM和Actin。這一結(jié)果與貽貝蛋白的電泳條帶分布情況[20]相似。但MHC和PM的電泳條帶顏色比較淺，說(shuō)明蛋白含量不高。而未經(jīng)上樣液處理的樣品中蛋白主要分布在20.1～40.3 kDa，且經(jīng)上樣液處理的樣品中含有分子質(zhì)量為14.3 kDa的泳道，在同類研究中發(fā)現(xiàn)類似特征的蛋白條帶，此條帶可能是貝類所具備的獨(dú)特蛋白結(jié)構(gòu)[17]。

水溶性蛋白的分子量分布比較分散，此結(jié)果與曹文紅等[21]脊尾白蝦水溶性蛋白電泳分布結(jié)果類似，未經(jīng)上樣液處理的水溶性蛋白在200.0～250.0、97.2與14.3 kDa處有明顯條帶，與之相比，上樣液處理后水溶性蛋白在200.0～250.0、44.3和14.3 kDa處有明顯的蛋白條帶；上樣液處理后醇溶性蛋白在44.3 kDa處有明顯的蛋白條帶，而未經(jīng)上樣液處理的樣品在97.2 kDa存在蛋白條帶，推測(cè)可能由于β-巰基乙醇處理后蛋白質(zhì)二硫鍵被打開(kāi)，生成了新的結(jié)構(gòu)。但醇溶性蛋白在泳道中顏色淺，說(shuō)明其含量所占比例較??；堿溶性蛋白的分子量分布比較分散，此結(jié)果與鄭惠娜等[22]研究結(jié)果類似。經(jīng)β-巰基乙醇處理后堿溶性蛋白在200.0、44.3與20.1 kDa處有明顯的蛋白條帶，而不經(jīng)β-巰基乙醇處理后堿溶性蛋白在97.2和200.0 kDa處有明顯的蛋白條帶。

3 結(jié)論

本研究采用等電點(diǎn)沉淀法對(duì)牡蠣蛋白提取條件進(jìn)行了優(yōu)化，并系統(tǒng)地探索了牡蠣各蛋白組分及其分布特性。在室溫、溶解pH 12.0、提取時(shí)間1 h、酸沉pH 4.0條件下提取牡蠣蛋白，得到牡蠣蛋白純度高達(dá)84.3%，且該牡蠣蛋白中鹽溶性蛋白含量最高，為18.5%，水溶性蛋白、醇溶性蛋白和堿溶性蛋白含量分別為8.8%、1.4%和10.5%。對(duì)牡蠣蛋白各組分分子量分布進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，牡蠣蛋白中鹽溶性蛋白和水溶性蛋白種類豐富，且各組分經(jīng)β-巰基乙醇處理后出現(xiàn)新的條帶，這可能是由于蛋白質(zhì)二硫鍵被打開(kāi)，使亞基游離出來(lái)。值得注意的是在同類研究中發(fā)現(xiàn)與分子量分布在14.3 kDa蛋白條帶特征類似的條帶，推測(cè)可能是貝類特有的蛋白質(zhì)，但該蛋白結(jié)構(gòu)和功能尚不清楚，下一步將對(duì)其進(jìn)行更深入地研究與討論。