李慧穎,陸潭麗,王 進(jìn)
(廣西醫(yī)科大學(xué),廣西 南寧 530021)
帕金森?。≒D)是第二大神經(jīng)退行性疾病,多發(fā)于65歲以上人群[1]。大多數(shù)PD患者為散發(fā)的特發(fā)性PD,其發(fā)生考慮與環(huán)境、遺傳因素之間的相互作用有關(guān)。PD的神經(jīng)病理特征包括中腦黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元的丟失和含有α-突觸核蛋白的路易小體的蓄積[2]。廣西具有豐富的錳礦資源,然而過量的錳暴露是一種公認(rèn)的環(huán)境健康危險(xiǎn)因素,可誘導(dǎo)類似帕金森病的錐體外系功能異常[3]。環(huán)境錳污染及其引起的中毒性帕金森綜合征是一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問題,但其發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚。線粒體通過不斷分裂和融合,可控制細(xì)胞的大小、形態(tài)和數(shù)量,以維持細(xì)胞的正?;顒?dòng)[4]。線粒體的穩(wěn)態(tài)被破壞和線粒體功能紊亂在神經(jīng)退行性疾病的病理生理過程中起著重要作用,進(jìn)一步凸顯了這些細(xì)胞器的重要性,特別是在神經(jīng)元中的重要性[5]。而在神經(jīng)組織中,錳對(duì)線粒體具有特殊親和力,會(huì)特異性蓄積在富含線粒體的神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)突觸中,最終導(dǎo)致神經(jīng)元功能障礙和病理損傷。本研究旨在探討錳中毒對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞多巴胺分泌以及線粒體動(dòng)力學(xué)的影響,為錳中毒性帕金森綜合征的病理機(jī)制提供理論依據(jù)。
1.1 主要試劑及儀器 氯化錳 (MnCl2)購于美國Sigma公司(批號(hào):WXBC7094V);胎牛血清(FBS)購于美國Gibco公司(批號(hào):1982158C);DMEM基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基購于美國Corning公司(批號(hào):08018008);胰酶(批號(hào):20180506)、1%青-鏈霉素(批號(hào):20180602)、磷酸鹽緩沖液(PBS,批號(hào):20180807)均購于北京索萊寶科技有限公司;人多巴胺酶聯(lián)免疫試劑盒購于CUSABIO技術(shù)有限公司(批號(hào):C123060148);β-actin(14)、LC3(11)、Mfn1(1)、Mfn2(3)、Drp1(3)抗體及熒光二抗(9)均購于美國CST公司;BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司(批號(hào):P0012S);CCK-8試劑盒購于日本同仁化學(xué)研究所(批號(hào):LQ732)。ELX800型酶標(biāo)儀產(chǎn)于美國Bio-Tek公司;PowerPac Basic型電泳儀產(chǎn)于美國Bio-Rad公司;9120型Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)產(chǎn)于美國LI-COR Biosciences公司。
1.2 細(xì)胞株及細(xì)胞培養(yǎng) 人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y獲贈(zèng)于中山大學(xué)肖友生博士。細(xì)胞置于含有10%FBS及1%青-鏈霉素的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,放入37℃、5%CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
1.3 實(shí)驗(yàn)分組及給藥 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,取對(duì)數(shù)生長期SH-SY5Y細(xì)胞(500μmol/L為預(yù)實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞自噬的最佳濃度),加入含500μmol/LMnCl2的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h作為MnCl2組,而用不含MnCl2的普通培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h的細(xì)胞作為正常對(duì)照組[6]。
1.4 細(xì)胞毒性測(cè)定 采用CCK-8法檢測(cè)不同濃度MnCl2作用于SH-SY5Y細(xì)胞的細(xì)胞活力。將SHSY5Y細(xì)胞接種于96孔板中,待細(xì)胞貼壁后,用含不同濃度MnCl2(0μmol/L、125μmol/L、250μmol/L、500 μmol/L、1000μmol/L和2000μmol/L)的培養(yǎng)基處理細(xì)胞24h。干預(yù)結(jié)束后,每孔加入含10μl CCK-8溶液的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基,置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2h。最后使用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測(cè)定吸光度值。細(xì)胞存活率計(jì)算公式為 IC(%)=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100%。As:實(shí)驗(yàn)孔(含有細(xì)胞的培養(yǎng)基、CCK-8、MnCl2);Ac:對(duì)照孔(含有細(xì)胞的培養(yǎng)基、CCK-8,不含 MnCl2);Ab:空白孔(不含細(xì)胞和 MnCl2的培養(yǎng)基、CCK-8)。
1.5 ELISA檢測(cè)多巴胺(DA)含量 將SH-SY5Y細(xì)胞在冰上清洗后移入離心管中,用1×PBS(pH7.2~7.4)稀釋至濃度 100 million/ml,將 SH-SY5Y 細(xì)胞懸液放入-20℃冰凍24 h后經(jīng)室溫解凍,經(jīng)2輪反復(fù)凍融破壞細(xì)胞膜后,于2~8℃5 000 g離心5 min,取上清液即刻進(jìn)行ELISA檢測(cè),嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。
1.6 Western Blot法檢測(cè) LC3、Mfn1、Mfn2 及 Drp1蛋白表達(dá) SH-SY5Y細(xì)胞用冰PBS清洗2次,冰上裂解并收集細(xì)胞,離心后收集上清液即為組織蛋白,BCA法進(jìn)行蛋白定量,煮沸使蛋白變性;用SDSPAGE 分離蛋白(美國 Bio-Rad,恒壓 140 V,1 h),將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜,5%脫脂奶粉封閉0.5 h;TBST洗膜3次,分別加入相應(yīng)一抗,4℃孵育過夜;TBST洗膜3次,加入二抗于室溫下孵育1 h,免疫印跡顯色。
1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,組間比較采用組間差異經(jīng)單因素方差分析及兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 MnCl2對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響 見表1。檢測(cè)結(jié)果顯示,125~2 000μmol/L的 MnCl2對(duì)SH-SY5Y的增殖抑制作用呈濃度依賴性,不同濃度MnCl2對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的增殖均起到明顯抑制作用。MnCl2作用24 h抑制SH-SY5Y增殖的IC50濃度為 587.21±15.02 μmol/L。
表1 MnCl2對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響 (x±s)
2.2 MnCl2對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞多巴胺的影響 與正常對(duì)照組相比較,MnCl2組的多巴胺分泌量顯著減少(P<0.05),見表 2。
表2 MnCl2對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞多巴胺的影響 (x±s)
2.3 MnCl2對(duì) SH -SY5Y 細(xì)胞 Mfn1、Mfn2、Drp1及 LC3蛋白表達(dá)的影響 與正常對(duì)照組相比較,Mn-Cl2組的LC3-Ⅱ表達(dá)明顯增加 (P<0.05),Drp1表達(dá)明顯降低(P<0.05),Mfn1 及Mfn2表達(dá)明顯增加(P<0.05),見圖 1、表3。
圖1 WB檢測(cè)各蛋白含量結(jié)果
表 3 MnCl2對(duì) SH-SY5Y 細(xì)胞 Mfn1、Mfn2、Drp1及 LC3蛋白表達(dá)的影響 (%,x±s)
慢性過量的錳暴露可促進(jìn)中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的丟失,因此錳中毒被認(rèn)為與帕金森病有關(guān)。與其他類型的細(xì)胞相比,神經(jīng)元的高能量需求不成比例,盡管大腦神經(jīng)元只占身體總量約2%,但其可以消耗多達(dá)20%的人體總能量[7]。這些不尋常的能量需求是由神經(jīng)傳遞及其相關(guān)細(xì)胞過程(維持靜息膜電位、恢復(fù)突觸后受體的離子平衡、通過Na+和Ca2+泵在動(dòng)作電位后恢復(fù))以及一系列其他間接相關(guān)的內(nèi)務(wù)過程(如脂質(zhì)和蛋白質(zhì)合成和周轉(zhuǎn)、小泡運(yùn)輸或微管和肌動(dòng)蛋白動(dòng)力學(xué))造成的[8]。這些廣泛的能量需求主要是通過TCA循環(huán)和線粒體中的OXPHOS產(chǎn)生ATP來滿足的,因此,這些通路的紊亂可能對(duì)神經(jīng)元產(chǎn)生特別的影響。生物化學(xué)證據(jù)表明,腦ATP的大部分用于神經(jīng)元的神經(jīng)電活動(dòng)[9]。因此,線粒體提供足夠的能量對(duì)神經(jīng)元的興奮性和存活至關(guān)重要。與其它細(xì)胞器相比,線粒體在生理和病理?xiàng)l件下經(jīng)常發(fā)生形態(tài)變化[10]。具體而言,線粒體動(dòng)力學(xué)(融合和分裂)調(diào)節(jié)線粒體網(wǎng)絡(luò)連接,這取決于細(xì)胞的具體代謝需要。
帕金森病的神經(jīng)生化改變?yōu)橹心X黑質(zhì)致密部、藍(lán)斑神經(jīng)元脫失致上述部位及其神經(jīng)末梢處多巴胺減少,多巴胺減少≥70%時(shí)會(huì)產(chǎn)生帕金森綜合征臨床表現(xiàn)[11]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的多巴胺分泌量進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)經(jīng)錳處理過的SH-SY5Y細(xì)胞多巴胺分泌量顯著減少,提示錳中毒會(huì)導(dǎo)致多巴胺神經(jīng)元受損,導(dǎo)致錳中毒后的類似帕金森病的錐體外系功能異常。
線粒體融合/分裂平衡的改變尚未在PD中直接顯示。盡管對(duì)錳中毒的分子機(jī)制已有許久,但目前調(diào)控機(jī)制中仍有大片空白。正常情況下,損傷的線粒體由自噬體識(shí)別,分離后與溶酶體融合形成自體溶酶體,最終降解。本實(shí)驗(yàn)對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的線粒體自噬標(biāo)記蛋白LC3、線粒體分裂蛋白Drp1、線粒體融合蛋白Mfn1、Mfn2的表達(dá)水平進(jìn)行了研究。微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3/Atg8)是自噬體膜上的標(biāo)記蛋白。細(xì)胞內(nèi)存在兩種形式的LC3蛋白,LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ。細(xì)胞內(nèi)新合成的LC3其C端被Atg4蛋白酶剪切,成為胞質(zhì)可溶形式的LC3-Ⅰ。當(dāng)自噬體形成后,LC3-Ⅰ經(jīng)剪切和泛素化加工修飾,與自噬體膜表面的磷脂酰乙醇胺(PE)偶聯(lián),成為膜結(jié)合形式的LC3-Ⅱ并定位于自噬體內(nèi)膜和外膜。與其他一些定位于自噬體膜上的Atg蛋白不同(僅在自噬過程的某一階段發(fā)揮作用),LC3-Ⅱ始終穩(wěn)定地保留在自噬體膜上直到與溶酶體融合,因此被用來作為自噬體的標(biāo)記分子[12]。LC3-Ⅱ的含量或 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比例與自噬體的數(shù)量成正相關(guān),在某種程度上反映了細(xì)胞的自噬活性。而Mfn1和Mfn2共同介導(dǎo)線粒體的外膜融合[11]。線粒體分裂的關(guān)鍵蛋白Drp1,它控制著線粒體的外膜的分裂[13]。本研究的結(jié)果顯示,在細(xì)胞經(jīng)錳處理后,Drp1的表達(dá)降低,提示線粒體的分裂減少;Mfn1及Mfn2表達(dá)增加,提示線粒體的融合增多;LC3-Ⅱ的表達(dá)增加,提示細(xì)胞自噬增多,自噬活性上升。
綜上所述,在神經(jīng)細(xì)胞中,錳對(duì)線粒體具有特殊親和力,容易聚集在富含線粒體的神經(jīng)元中,錳中毒抑制了線粒體的分裂并促進(jìn)線粒體的融合,從而導(dǎo)致線粒體自噬的增多,這意味著錳積累的受損線粒體過度自噬導(dǎo)致線粒體功能紊亂也許是錳中毒性帕金森綜合征的病因之一,這可為錳中毒性帕金森綜合征提供新的治療靶點(diǎn)并對(duì)帕金森病的治療提供一定的幫助。
廣西中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)2019年1期