重組雞Ex-FABP蛋白對福美雙誘導(dǎo)的TD肉雞血清中Bcl-2含量的影響

賈云飛，楊世雄，田志雄，張陽陽，牛 勝，孫 巨，寧官保，張 鼎，趙宇軍，田文霞

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山西太谷030801）

肉雞脛骨軟骨發(fā)育不良（Tibial dyschondroplasia，TD）是肉雞生長過程中常見的腿病之一，是LEACH和NESHEIM在1965年初次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道[1]，以軟骨內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、軟骨鈣化受阻和脛骨近端過渡期軟骨細(xì)胞大量增生為特征，可引起肉雞腿部變形、生長性能下降等一系列不良影響[2]。有研究表明，在飼料中提高鈣磷比例或添加維生素D和1，25（OH）2-VD3能有效減少肉雞 TD 的發(fā)生率[3]。ROBINSON等[4]研究指出，2周齡肉雞生長速度過快時，TD的發(fā)生率更高。自然發(fā)生和人工誘發(fā)的TD，在1～2周齡的肉雞和火雞群中可明顯觀察到特征性癥狀[5]，脛骨關(guān)節(jié)處的縱切面可見異常增厚的色如白玉的軟骨栓，軟骨內(nèi)無血管且質(zhì)脆[6]，顯微鏡觀察可發(fā)現(xiàn)，軟骨細(xì)胞大且排列緊密，細(xì)胞間未發(fā)現(xiàn)血管、破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞[7]。

福美雙作為一種低毒抑菌殺蟲劑，廣泛用于植物殺蟲劑和工業(yè)橡膠的促進(jìn)劑，現(xiàn)已被廣泛用于高精度TD模型的誘導(dǎo)，并用于TD研究[8-9]。B細(xì)胞淋巴瘤因子 2（B-cell lymphoma gene 2，Bcl-2）蛋白家族是細(xì)胞凋亡中重要的調(diào)控因子，它們大多自然分布于線粒體外膜上，或在凋亡信號刺激后轉(zhuǎn)移到線粒體外膜發(fā)揮作用[10]。有研究發(fā)現(xiàn)，在受損傷的腦中Bcl-2表達(dá)上調(diào)并在一定程度上抑制神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡[10]。Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2-associated X protein，Bax）是與 Bcl-2相互拮抗的重要調(diào)控基因，細(xì)胞凋亡取決于Bax和Bcl-2自身的表達(dá)水平和比值。Bax表達(dá)量的相對增加，會形成Bax-Bax同源二聚體，可促進(jìn)細(xì)胞凋亡；Bcl-2相對表達(dá)量的增加，形成的Bax-Bcl-2異源二聚體，則會抑制細(xì)胞凋亡。它們的作用機(jī)制是通過改變線粒體膜通透性來實(shí)現(xiàn)抑制或促進(jìn)釋放凋亡相關(guān)因子（如Cytc），從而決定是否激活半胱氨酸蛋白酶類依賴性細(xì)胞凋亡途徑而控制細(xì)胞凋亡[10]。細(xì)胞外脂肪酸結(jié)合蛋白（extracellularfattyacid-bindingprotein，Ex-FABP）是在軟骨細(xì)胞分化后期合成和分泌的低分子量蛋白，最初在靜止期的雞胚成纖維細(xì)胞和心肌心間干細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，被稱為20K轉(zhuǎn)化敏感蛋白[11]。Ex-FABP可以抑制細(xì)胞分裂[12]，參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)，還具有抗菌功能[13]。同時Ex-FABP也可以發(fā)揮細(xì)胞存活蛋白維持細(xì)胞活力，它可以抑制軟骨細(xì)胞凋亡，故也稱作軟骨相關(guān)蛋白[14]。山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院生物制品實(shí)驗(yàn)室前期由TIAN等[15]利用基因芯片技術(shù)和抑制消減雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)Ex-FABP在肉雞TD中存在差異性表達(dá)。

本試驗(yàn)通過將重組Ex-FABP蛋白注射入試驗(yàn)肉雞體內(nèi)，以探究重組Ex-FABP蛋白對肉雞血清中Bcl-2含量的影響，為TD的防治奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)動物

90羽1日齡艾維茵（AA）肉雛雞，購自山西大象農(nóng)牧集團(tuán)有限公司。

1.2 試驗(yàn)試劑

IPTG、硫酸卡那霉素，購于北京索萊寶生物科技有限公司；福美雙（JL131223002），購自美國Amresco公司；Bcl-2酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，購于南京建成生物工程有限公司；含Ex-FABP基因的重組大腸桿菌，由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物制品實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 Ex-FABP重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)純化 試驗(yàn)在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物制品實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，該實(shí)驗(yàn)室前期已成功構(gòu)建含Ex-FABP基因的重組大腸桿菌，將其在含卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基和大錐形瓶LB培養(yǎng)液中使其大量繁殖表達(dá)Ex-FABP蛋白。在細(xì)菌培養(yǎng)液OD600值達(dá)0.4～0.7時，每升培養(yǎng)液中加入8 mL誘導(dǎo)劑IPTG，37℃誘導(dǎo)培養(yǎng)21 h，在4℃條件下用PBS緩沖液離心洗滌得到重組大腸桿菌。將得到的目的菌在冰上進(jìn)行超聲波碎菌、離心，取其上清液通過0.45 μm過濾器過濾收集過濾液，再利用鎳柱親和層析方法，透析、濃縮得到純化的Ex-FABP蛋白。

1.3.2 試驗(yàn)動物分組及處理 本試驗(yàn)在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心進(jìn)行，將90羽1日齡AA肉雞預(yù)飼養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為9組，每組10羽，其中，4組為添加福美雙的日糧組（福美雙組，1～4組），在8，9日齡時將含100 mg/kg福美雙的日糧連續(xù)飼喂2d以誘導(dǎo)TD模型，并在10，12，15日齡時每組分別于腿部肌肉注射低（20 μg/kg，第1 組）、中（50 μg/kg，第2組）、高（100 μg/kg，第3組）劑量的重組Ex-FABP蛋白和等體積PBS緩沖液（第4組）；另外4組為健康組（5～8組），飼喂正常日糧，在10，12，15日齡時每組分別腿部肌肉注射低（20 μg/kg，第 5 組）、中（50 μg/kg，第 6 組）、高（100 μg/kg，第 7組）劑量的重組Ex-FABP蛋白和等體積PBS緩沖液（第8組）；另設(shè)一組為空白對照組（第9組），正常飼喂，不做任何處理。

1.3.3 試驗(yàn)雞血清的采集 將飼喂福美雙日糧的最后一天（9日齡）作為試驗(yàn)第1天，分別在試驗(yàn)第6天（14日齡）、第10天（18日齡）、第15天（23日齡），每組隨機(jī)選取3只雞進(jìn)行心臟采血，待血液自然凝固后，使用離心機(jī)3 000 r/min離心15 min，小心吸取血清，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 Bcl-2含量測定 通過競爭ELISA法測定Bcl-2含量，并嚴(yán)格按照Bcl-2酶聯(lián)免疫檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，在Excel軟件中創(chuàng)建一個對數(shù)坐標(biāo)圖，標(biāo)準(zhǔn)物的濃度取對數(shù)值為縱坐標(biāo)，OD值取對數(shù)值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并得出回歸方程，將待測樣品的OD值代入回歸方程即可計(jì)算出每個樣本的Bcl-2蛋白濃度。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Bcl-2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

利用標(biāo)準(zhǔn)孔濃度和OD值得到標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）和回歸方程：y＝0.113x＋0.215 7，R2＝0.996。

2.2 樣品血清中的Bcl-2濃度

由圖2可知，試驗(yàn)第6天時，與福美雙組中的對照組（處理4）相比，中劑量、高劑量福美雙組血清中Bcl-2蛋白濃度較高（P＜0.05）；低劑量、高劑量健康組相比健康對照組（處理8）血清中Bcl-2蛋白濃度顯著較高（P＜0.05）；福美雙各組和低劑量、高劑量健康組與空白對照組相比，血清中Bcl-2蛋白濃度顯著升高（P＜0.05）。

由圖3可知，試驗(yàn)第10天時，中劑量、高劑量福美雙組與福美雙對照組相比，血清中Bcl-2蛋白濃度無明顯差異（P＞0.05）；中劑量、高劑量健康組與健康對照組相比，血清中Bcl-2蛋白濃度顯著升高（P＜0.05）；中劑量、高劑量的福美雙組和健康組與空白對照組相比，血清中Bcl-2蛋白濃度顯著升高（P＜0.05）。

由圖4可知，試驗(yàn)第15天時，低劑量福美雙組與福美雙對照組相比，血清中Bcl-2蛋白濃度顯著升高（P＜0.05），高劑量組則顯著降低（P＜0.05）；中劑量福美雙組與福美雙對照組相比，血清中Bcl-2蛋白濃度無明顯差異（P＞0.05）；低、中、高劑量健康組血清中Bcl-2蛋白濃度與健康對照組相比顯著升高（P＜0.05），除高劑量福美雙組外，其余福美雙組與健康組和空白對照組相比，血清中Bcl-2蛋白濃度顯著升高（P＜0.05）。

3 討論

Ex-FABP蛋白作為一類重要的軟骨相關(guān)蛋白，在正常情況下，關(guān)節(jié)軟骨分泌量少且只出現(xiàn)于肥大軟骨細(xì)胞，而在TD肉雞的生長板中有大量前肥大細(xì)胞堆積，進(jìn)一步分化、成熟受阻，不能分化為成熟的肥大細(xì)胞，在這些前肥大細(xì)胞中異常出現(xiàn)大量Ex-FABP蛋白[16]，這表明Ex-FABP蛋白對TD的恢復(fù)可能起到非常重要的作用。根據(jù)TD的發(fā)病特點(diǎn)，得知TD的發(fā)生過程中存在軟骨生長板細(xì)胞發(fā)生凋亡，無法為軟骨細(xì)胞鈣化提供所需要的營養(yǎng)與氧氣而導(dǎo)致軟骨細(xì)胞鈣化異常從而發(fā)生TD。Bcl-2作為一類極其重要的抗凋亡因子，可能在TD的恢復(fù)過程中起到重要的作用，所以，本試驗(yàn)通過細(xì)胞凋亡途徑來探究重組雞Ex-FABP蛋白對TD肉雞的治療機(jī)制。

試驗(yàn)結(jié)果顯示，在試驗(yàn)第6天，誘導(dǎo)TD發(fā)生后血清中Bcl-2的蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，這表明在誘導(dǎo)TD發(fā)生初期，機(jī)體中Bcl-2的蛋白表達(dá)受到誘導(dǎo)，從而增強(qiáng)軟骨生長板細(xì)胞的抗凋亡作用。張寧等[17]研究發(fā)現(xiàn)，在誘導(dǎo)的TD發(fā)生后，肉雞血清中促凋亡蛋白Bax的含量顯著升高[17]，這可能是通過促進(jìn)促凋亡因子的表達(dá)造成了凋亡現(xiàn)象的發(fā)生，機(jī)體通過誘導(dǎo)抗凋亡因子Bcl-2的表達(dá)，以抵抗凋亡現(xiàn)象的惡化[18]。除此之外，對TD肉雞注射中劑量和高劑量重組Ex-FABP蛋白后，血清中Bcl-2的蛋白表達(dá)顯著升高，而對健康肉雞注射低劑量和高劑量重組Ex-FABP蛋白后，Bcl-2的蛋白表達(dá)顯著升高，這表明在TD發(fā)生初期中劑量和高劑量的重組Ex-FABP蛋白對血清中Bcl-2的蛋白表達(dá)有顯著的促進(jìn)作用。在TD發(fā)生各階段，TD肉雞與健康肉雞相比，Bcl-2的蛋白表達(dá)基本呈顯著上調(diào)趨勢，這表明在TD的發(fā)展過程中血清中Bcl-2的蛋白表達(dá)有顯著增強(qiáng)作用，這可能是在抑制TD的進(jìn)一步發(fā)展。在試驗(yàn)的第15天，注射低劑量的重組Ex-FABP蛋白組，與第6，10天相比，血清中Bcl-2的蛋白表達(dá)量顯著增高，說明低劑量對促進(jìn)Bcl-2蛋白表達(dá)的作用相對遲緩，而高劑量組Bcl-2的蛋白表達(dá)水平顯著降低，這可能與后期TD恢復(fù)有關(guān)，充分說明Ex-FABP蛋白可以通過促進(jìn)抗凋亡因子Bcl-2表達(dá)來抑制脛骨軟骨生長板細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

4 結(jié)論

本研究表明，重組雞Ex-FABP蛋白可以通過促進(jìn)機(jī)體血清中抗凋亡因子Bcl-2的表達(dá)來抑制脛骨軟骨生長板細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮治療作用，這將為研制Ex-FABP生物制劑防治肉雞TD奠定理論基礎(chǔ)。