枯草芽孢桿菌與鉀聯(lián)用對黑腐皮菌的抑制作用

翟世玉 ，殷 輝 ，周建波 ，唐秀麗 ，呂 紅 ，韓巨才 ，趙曉軍

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷030801；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所，山西太原030031；3.農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理山西省重點實驗室，山西太原030031）

蘋果樹腐爛病在我國蘋果產(chǎn)區(qū)發(fā)生普遍[1]，是由黑腐皮殼屬病菌（Valsa spp.）引起的一種毀滅性真菌病害[2-4]。生產(chǎn)中通過提高蘋果樹體內(nèi)的鉀含量[5-6]、保持適宜的土壤水分條件[7]及利用生防菌劑[8]等來防治蘋果樹腐爛病。孫廣宇等[5]研究表明，蘋果樹葉片鉀含量與腐爛病的發(fā)病程度呈極顯著的負相關(guān)關(guān)系，即腐爛病發(fā)生越嚴重的果樹，葉片內(nèi)含鉀量越低。季蘭等[9]研究表明，生產(chǎn)中施鉀較少是我國蘋果樹腐爛病發(fā)生嚴重的原因之一。王金友[10]研究提出，適當增加蘋果樹皮中的鉀含量，能提高蘋果樹體的抗病能力，有效減輕病害的發(fā)生。然而，生產(chǎn)中只通過施用鉀肥防治腐爛病有其局限性，通常輔以其他措施來防治。

生物防治措施具有環(huán)境兼容性好、不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點，符合現(xiàn)代社會對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的要求且越來越受到人們的關(guān)注[11]?？莶菅挎邨U菌（Bacillus subtilis）作為黑腐皮菌（Valsa mali）的生防菌目前已成為國內(nèi)外研究的熱點，其對黑腐皮菌具有較好的抑制作用[12-14]。但是枯草芽孢桿菌在抑制黑腐皮菌的過程中會出現(xiàn)退化現(xiàn)象，隨著時間推移抑菌率降低[15]。

為提高生防菌的穩(wěn)定性，國內(nèi)外研究者將生防菌與化學(xué)藥劑[16-17]聯(lián)用后發(fā)現(xiàn)有協(xié)同增效的作用。如馬志強等[18]將哈茨木霉菌與啶酰菌胺聯(lián)用后對番茄灰霉病菌表現(xiàn)出協(xié)同增效作用。畢秋艷等[19]研究表明，枯草芽孢桿菌與氟環(huán)唑聯(lián)用對禾谷鐮孢霉表現(xiàn)出持效和增效作用。姚克兵等[20]提出將枯草芽孢桿菌制劑BCA與吡唑醚菌酯（PS）聯(lián)用，發(fā)現(xiàn)可以提高生防菌的存活率，同時增加對病害的防治效果。谷春艷等[21]將解淀粉芽孢桿菌與咪鮮胺聯(lián)用，發(fā)現(xiàn)其對草莓炭疽病的防治效果極顯著高于施用2個單劑。除生防菌劑和化學(xué)藥劑聯(lián)用表現(xiàn)協(xié)同作用外[22-23]，胡清玉等[24]以枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）為主要菌群和肥料聯(lián)用，通過根施該菌肥能顯著降低腐爛病的發(fā)生。

菌肥聯(lián)用在生產(chǎn)上有一定防效[25-26]，但生防菌和肥聯(lián)用后對生防菌的影響及其抑菌率等的研究尚無相關(guān)報道。本研究擬將對黑腐皮病菌有較好抑制作用的枯草芽孢桿菌和鉀聯(lián)用，探索枯草芽孢桿菌和鉀聯(lián)用后對黑腐皮菌的抑菌效果，以期提高枯草芽孢桿菌的抑菌率和保持其抑菌的穩(wěn)定性，為使用菌肥防治蘋果樹腐爛病提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試菌株：病原菌為蘋果黑腐皮菌（Valsa mali），YC90；生防菌為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），LF17。菌株于山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所植物病害研究室保存[27]。

試劑：99.5%磷酸二氫鉀（KH2PO4）原藥（天津市博迪化工有限公司）；99.5%氯化鉀（KCl）原藥（天津市天大化工實驗廠）；99.0%硫酸鉀（K2SO4）原藥（天津市凱通化學(xué)試劑有限公司）。

供試培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基[28]；NB培養(yǎng)基[29]。

儀器：WFZUV-2800H型紫外可見分光光度計（尤尼柯上海儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵液母液的制備 將枯草芽孢桿菌菌株LF17在PDA上活化后，用打孔器取2個菌餅，接種至100 mL NB液體培養(yǎng)基中，28℃，180 r/min搖培72 h后得到枯草芽孢桿菌種子液。將種子液按1%（5.6×109cfu/mL）的接種量接入100 mL NB培養(yǎng)基中，于28℃，180 r/min搖培72 h制成發(fā)酵液母液于4℃保存?zhèn)溆肹30-31]。

1.2.2 枯草芽孢桿菌菌體生長量的測定 配制系列質(zhì)量濃度為 300，150，100，20，1 mg/mL 的 KH2PO4及KCl母液，系列質(zhì)量濃度為100，20，1 mg/mL的K2SO4母液，4℃保存?zhèn)溆?。將上述母液與NB培養(yǎng)基按體積比1∶10充分混勻后制成含鉀的NB培養(yǎng)基，滅菌待用。每毫升含鉀的NB培養(yǎng)基接種0.01mL發(fā)酵液母液，28℃，180 r/min的條件下培養(yǎng)72 h，測定發(fā)酵液OD600值，每個處理重復(fù)3次，以含鉀質(zhì)量濃度0 mg/mL的發(fā)酵液為對照。以未接菌含不同濃度鉀的NB培養(yǎng)基為背景，采用比濁法[32]測定OD600值，并計算枯草芽孢桿菌活菌數(shù)，計算公式[27]如下。

1.2.3 枯草芽胞桿菌和鉀的協(xié)同作用測定 參考畢秋艷等[19]采用的固體平板擴散法-打孔法測定抑菌活性，測定不同濃度含鉀發(fā)酵液對黑腐皮菌的影響。在PDA平板中心畫2條十字交叉線，每條線等分3份，等分點處用打孔器打4個直徑為5 mm的孔，分別注入30 μL含不同濃度KH2PO4，KCl的枯草芽孢桿菌發(fā)酵液后，在平板中心接種5 mm黑腐皮菌菌餅，將培養(yǎng)皿正面朝上，于28℃恒溫放置3 h后倒置培養(yǎng)，發(fā)酵液和含不同濃度KH2PO4，KCl的含鉀發(fā)酵液為處理，以只接黑腐皮菌為對照，3次重復(fù)。分別于3，5，10 d后測定黑腐皮菌落直徑，計算菌絲生長抑制率，公式如下。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2003，SPSS 17.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行分析處理，其中，用SPSS 17.0進行數(shù)據(jù)方差分析；用Excel 2003和HemI對數(shù)據(jù)進行整理繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同質(zhì)量濃度 KH2PO4，KCl，K2SO4對枯草芽孢桿菌活菌數(shù)的影響

枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中加入不同質(zhì)量濃度KH2PO4，隨著質(zhì)量濃度增加活菌數(shù)呈上升趨勢，與活菌數(shù)為5.6×109cfu/mL的對照相比，增幅范圍為 2.2×108～1.5×109cfu/mL，KH2PO4質(zhì)量濃度為10 mg/mL時，活菌數(shù)最多，達7.1×109cfu/mL；發(fā)酵液中加入不同質(zhì)量濃度KCl，活菌數(shù)呈緩慢上升趨勢，增幅范圍為 9.0×107～1.4×108cfu/mL，KCl質(zhì)量濃度為30 mg/mL時，活菌數(shù)最多，達5.74×109cfu/mL；發(fā)酵液中加入不同質(zhì)量濃度K2SO4，質(zhì)量濃度為2 mg/mL時相比對照活菌數(shù)增加了2.7×108cfu/mL，其他質(zhì)量濃度相比對照活菌數(shù)呈降低趨勢，K2SO4質(zhì)量濃度為10 mg/mL時，活菌數(shù)量最少，比對照降低了 1.72×109cfu/mL（圖 1）。

2.2 枯草芽孢桿菌發(fā)酵液與KH2PO4聯(lián)用對黑腐皮菌的抑菌效果

發(fā)酵液中KH2PO4質(zhì)量濃度增加，對黑腐皮菌的抑菌率升高。各個處理的抑菌率有差異，其中，10，15 mg/mLKH2PO4發(fā)酵液抑菌效果最佳。隨著時間的推移，各個處理的抑菌率明顯提高，10 d時達到最佳抑菌效果且趨于穩(wěn)定（圖2）。

結(jié)果顯示，培養(yǎng)3d，當KH2PO4質(zhì)量濃度為15mg/mL時，抑菌率最高，達80.22%，高于對照（58.27%），增幅為5.47～19.78百分點，與對照相比差異顯著（P＜0.05）；培養(yǎng)5 d時，KH2PO4質(zhì)量濃度為10 mg/mL的抑菌率最高，達到91.11%，高于對照（88.16%），但差異不顯著；培養(yǎng)10 d時抑菌率值達到最高，其中，KH2PO4質(zhì)量濃度為15 mg/mL時抑菌率最高，達到96.33%，各處理與對照相比增幅為2.22～4.11百分點，差異顯著（P＜0.05）。抑菌率總趨勢隨時間的推移而提高（圖3）。

2.3 枯草芽孢桿菌與KCl聯(lián)用對黑腐皮菌的抑菌效果

隨著發(fā)酵液中KCl質(zhì)量濃度升高，含鉀發(fā)酵液的抑菌值隨KCl質(zhì)量濃度增加逐漸增大，后又呈下降趨勢，其中，2 mg/mL質(zhì)量濃度的抑菌效果最佳。隨時間的推移，對黑腐皮菌的抑菌率趨于穩(wěn)定，當KCl質(zhì)量濃度為2 mg/mL，培養(yǎng)10 d時的抑菌效果最好（圖 4）。

結(jié)果顯示，培養(yǎng)3 d時KCl質(zhì)量濃度為2 mg/mL的發(fā)酵液抑菌率最高，達92.48%，比對照增加7.77百分點，與各處理相比差異顯著（P＜0.05）；培養(yǎng)5 d，KCl質(zhì)量濃度為2 mg/mL的發(fā)酵液抑菌率最高，達93.33%，高于對照（89.72%），與各處理相比差異顯著（P＜0.05），且其余各質(zhì)量濃度抑菌率均低于對照；10d時的抑菌率最高，當KCl質(zhì)量濃度為2mg/mL時抑菌率最高，達到95.56%，高于對照（90.96%），與各處理相比差異顯著（P＜0.05）。隨時間的推移，對黑腐皮菌的抑菌率提高，發(fā)酵液中KCl質(zhì)量濃度為2 mg/mL時的抑菌率最好（圖5）。

3 結(jié)論與討論

枯草芽孢桿菌主要通過拮抗物質(zhì)、誘導(dǎo)植物抗性、競爭作用和溶菌作用等機制同時或分別作用達到對病原菌的抑制作用[33-34]。如何使枯草芽孢桿菌抑菌率提高、抑菌效果穩(wěn)定是研究的重點[35]。KH2PO4和KCl與枯草芽孢桿菌聯(lián)用直接或間接影響枯草芽孢桿菌的生防功能[36]。本研究在枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中加入不同鉀肥，發(fā)現(xiàn)含KH2PO4的發(fā)酵液中活菌數(shù)明顯增加，當質(zhì)量濃度為10 mg/mL時，活菌數(shù)最多。相比對照，含KH2PO4的發(fā)酵液對黑腐皮菌的抑菌效果表現(xiàn)為穩(wěn)定、抑菌率提高。其中，培養(yǎng)10 d時，含不同KH2PO4質(zhì)量濃度的發(fā)酵液的抑菌率達到最高且趨于穩(wěn)定，各處理差異不顯著。因此，混用二者時KH2PO4的質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL即可起到增效作用。在發(fā)酵液中加入KCl后對枯草芽孢桿菌生長影響較小。當發(fā)酵液中KCl的質(zhì)量濃度為2 mg/mL時抑菌效果最佳。

本研究中含KH2PO4的發(fā)酵液中的活菌數(shù)明顯增加，提高了枯草芽孢桿菌離體競爭的能力，進而表現(xiàn)為增效作用。KCl沒有顯著提高發(fā)酵液中的活菌數(shù)，但是提高了發(fā)酵液抑菌的穩(wěn)定性，可能其對枯草芽孢桿菌拮抗物質(zhì)有影響，其增效機制還需深入研究。此外，由于K2SO4在發(fā)酵液中的溶解性較低，試驗僅設(shè)置了3個質(zhì)量濃度梯度，有一定局限性；結(jié)果表明，發(fā)酵液中加入K2SO4活菌數(shù)呈顯著減少趨勢，尚無法明確K2SO4和枯草芽孢桿菌之間的相互關(guān)系，還需進一步研究。

通過研究枯草芽孢桿菌和鉀聯(lián)合作用機制，可以使二者達到優(yōu)勢互補，發(fā)揮多位點、多途徑的特點，從而達到增強抑菌和防病效果[37-38]。胡清玉等[24]研究發(fā)現(xiàn)，以枯草芽孢桿菌為主要菌群和鉀肥聯(lián)用可增強蘋果樹的樹勢，顯著降低腐爛病病疤復(fù)發(fā)率；推測協(xié)同增效機制是鉀肥能夠提高枯草芽孢桿菌的競爭力和樹體組織抗腐爛病菌擴展能力，從而增強了防治效果。然而，不同類型的鉀肥與枯草芽孢桿菌聯(lián)用后對黑腐皮菌的抑菌效果直接影響著枯草芽孢桿菌的生防潛力[39]。本研究結(jié)果表明，KH2PO4和枯草芽孢桿菌的協(xié)同增效作用、兼容性最好，KCl提高了發(fā)酵液抑菌的穩(wěn)定性。本試驗測定鉀和枯草芽孢桿菌聯(lián)用對黑腐皮菌的抑菌效果，針對鉀和枯草芽孢桿菌聯(lián)用后拮抗物質(zhì)、植物抗病性及寄主體內(nèi)物質(zhì)競爭能力等問題，現(xiàn)階段還沒有相關(guān)的研究報道，結(jié)論尚無法明確，還需下一步進行深入研究。