毛建草莖段愈傷組織的誘導(dǎo)及繼代培養(yǎng)試驗(yàn)

宗 越，郭曉紅，田旭平

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，山西太谷030801）

毛建草（Dracocephalum rupestre Hance），又稱(chēng)毛健草，學(xué)名巖青蘭，唇形科青蘭屬植物。根莖直，生出多數(shù)莖。莖不分枝，葉片三角狀卵形，輪傘花序密集，花冠紫藍(lán)色，花期7—9月[1]。全草具香氣，可入藥，也可代茶飲[2]。因其花顏色是藍(lán)紫色，具有一定的觀賞性，在園林綠化中可作花帶、花鏡、花壇栽培。山西毛建草多為野生資源，野生毛建草基本靠莖的伸長(zhǎng)來(lái)繁殖。人工栽培主要通過(guò)種子繁殖，但種子小且成熟時(shí)易脫落，不易采集，所以，毛建草的種子繁殖有一定的局限性。而植物組織培養(yǎng)技術(shù)不僅可以避免自然條件帶來(lái)的限制，還可以在短時(shí)間內(nèi)利用最少的植株材料大規(guī)模的實(shí)現(xiàn)毛建草的組培苗繁殖[3-5]。

本研究選取毛建草莖段為外植體材料，通過(guò)對(duì)其愈傷組織誘導(dǎo)及繼代培養(yǎng)，篩選出毛建草愈傷組織誘導(dǎo)及建立植株再生體系的最適激素濃度組合，從而為毛建草的研究提供理論及實(shí)踐依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為毛建草幼嫩的莖段，毛建草均來(lái)自于太谷縣山西農(nóng)業(yè)大學(xué)林業(yè)站。

1.2 外植體處理

2018年5月21日在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院實(shí)驗(yàn)室將采摘的毛建草莖段清洗干凈后置于流水下沖洗1 h，然后在無(wú)菌條件下用75%的酒精浸泡30 s，無(wú)菌水沖洗3～4次，再用1%的升汞浸泡7 min，之后再用無(wú)菌水沖洗3～4次。在超凈工作臺(tái)上，用手術(shù)刀將毛建草莖段切成1 cm左右的小莖段，用鑷子將小莖段接種至培養(yǎng)基，每個(gè)培養(yǎng)基中放6個(gè)小莖段。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基。愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方：6-BA質(zhì)量濃度分別為0.5，1，2 mg/L，NAA質(zhì)量濃度分別為0.2，0.5，1 mg/L，共9個(gè)處理，5次重復(fù)。35 d后觀察并統(tǒng)計(jì)莖段愈傷組織的誘導(dǎo)情況。繼代培養(yǎng)基配方：6-BA質(zhì)量濃度分別為0.5，1，2 mg/L，NAA 質(zhì)量濃度分別為 0，0.05，0.1 mg/L，共9個(gè)處理，5次重復(fù)。20d后觀察并統(tǒng)計(jì)愈傷組織的繼代培養(yǎng)情況。培養(yǎng)基均添加蔗糖30g/L、瓊脂6.5g/L；pH值5.8～6.0，高壓滅菌鍋滅菌。培養(yǎng)溫度25℃左右，光照時(shí)間15 h/d，光照強(qiáng)度4 000 lx。

2 結(jié)果與分析

2.1 愈傷組織誘導(dǎo)

7 d后愈傷組織形成，呈淺綠色（圖1-A）；15 d后愈傷組織增大，表面覆蓋少許白點(diǎn)（圖1-B）；25 d后愈傷組織繼續(xù)增大，呈深綠色（圖1-C）；35 d后愈傷組織不再增大，表面呈黃綠色（圖1-D）。結(jié)果表明，Y1，Y2處理的愈傷組織的誘導(dǎo)率較高，而且Y2處理的愈傷組織的生長(zhǎng)狀態(tài)最好，所以，6-BA 0.5 mg/L＋NAA 0.5 mg/L為誘導(dǎo)毛建草莖段愈傷組織的最適培養(yǎng)基（表1）。

表1 2種激素配比對(duì)莖段愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.2 繼代培養(yǎng)

選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好的愈傷組織轉(zhuǎn)接到以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，附加6-BA，NAA 2種激素配比的繼代培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)愈傷組織在9種繼代培養(yǎng)基上進(jìn)一步增殖分化出根，而不是芽（圖 2）。

由表2可知，愈傷組織在N2，N3處理中生根率較高，但N2處理中不定根生長(zhǎng)較粗壯且數(shù)量多，所以，6-BA 0.5 mg/L＋NAA 0.05 mg/L為誘導(dǎo)毛建草愈傷組織不定根的最適培養(yǎng)基。

表2 2種激素配比對(duì)愈傷組織繼代培養(yǎng)的影響

3 結(jié)論與討論

3.1 愈傷組織的誘導(dǎo)

誘導(dǎo)毛建草愈傷組織的培養(yǎng)基選擇6-BA與NAA2種激素的配比組合，結(jié)果顯示，6-BA與NAA的濃度均較小時(shí)，其愈傷組織的誘導(dǎo)率高；6-BA質(zhì)量濃度高時(shí)容易造成毛建草莖段的褐變死亡，導(dǎo)致愈傷組織的誘導(dǎo)率降低。蔡漢權(quán)[6]在利用羅勒頂芽和帶腋芽莖段進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)時(shí)發(fā)現(xiàn)，6-BA質(zhì)量濃度為4 mg/L，NAA質(zhì)量濃度為0.1 mg/L時(shí)，羅勒的愈傷組織誘導(dǎo)率最高，達(dá)95%；廖蘇梅等[7]對(duì)薰衣草的種子在6-BA質(zhì)量濃度為2，4 mg/L時(shí)分別進(jìn)行了愈傷組織的誘導(dǎo)，對(duì)比發(fā)現(xiàn)6-BA質(zhì)量濃度高時(shí)，外植體的致死率較高，愈傷組織誘導(dǎo)率低；談?dòng)老糩8]利用百里香莖段誘導(dǎo)愈傷組織時(shí)發(fā)現(xiàn)，6-BA質(zhì)量濃度為1 mg/L時(shí)，該愈傷組織誘導(dǎo)率最高。以上結(jié)果說(shuō)明，唇形科的植物在誘導(dǎo)愈傷組織形成時(shí)，6-BA質(zhì)量濃度相對(duì)較小時(shí)誘導(dǎo)率高。本試驗(yàn)只對(duì)6-BA與NAA這2種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑進(jìn)行了篩選，其他生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的組合有待進(jìn)一步研究。

其次，愈傷組織的誘導(dǎo)率與外植體的選材部位及采集時(shí)間有關(guān)系[9-10]。劉艷芬等[11]對(duì)大葉蒲公英的葉片進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)時(shí)發(fā)現(xiàn)，含葉脈處比不含葉脈處愈傷組織發(fā)生速度快，愈傷組織面積大。劉軍等[12]利用美國(guó)薄荷的莖段及葉片進(jìn)行組織培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，美國(guó)薄荷的莖段出愈率高于葉片。溫琳等[13]對(duì)半夏葉柄進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)時(shí)發(fā)現(xiàn)，材料的采集時(shí)間與愈傷組織的誘導(dǎo)率有明顯關(guān)系，出苗期及生長(zhǎng)旺盛期材料分生能力較強(qiáng)，珠芽成熟期及倒苗期材料分生能力弱。以上結(jié)果說(shuō)明，外植體的選材部位及采集時(shí)間對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)有影響。

3.2 繼代培養(yǎng)

本試驗(yàn)的繼代培養(yǎng)基為芽分化培養(yǎng)基，根據(jù)文獻(xiàn)記載，當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度高、NAA質(zhì)量濃度低時(shí)，有利于芽分化。本研究表明，以毛建草莖段為外植體誘導(dǎo)的愈傷組織只分化出了不定根，未分化出叢生芽。莖段愈傷組織未分化出芽的原因可能是外源激素選擇不當(dāng)或者添加濃度有誤，也可能與溫度、光照等培養(yǎng)條件有關(guān)[14]。梁崢等[15]在微型月季叢芽分化試驗(yàn)中研究發(fā)現(xiàn)，6-BA質(zhì)量濃度在0.1～0.5 mg/L時(shí)，植株生長(zhǎng)緩慢，叢芽分化很少；當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度達(dá)到1 mg/L時(shí)，植株生長(zhǎng)旺盛，叢生芽分化較多。王政等[16]對(duì)非洲菊組培苗進(jìn)行不同光源處理研究發(fā)現(xiàn)，不同光源對(duì)組培苗葉片及根的伸長(zhǎng)都有顯著影響。張海龍等[17]在對(duì)冰燈玉露組培苗進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，光照強(qiáng)度對(duì)于組培苗生長(zhǎng)速度與形態(tài)建成有較大影響。黃冰艷等[18]對(duì)甘薯莖尖分生組織進(jìn)行組織培養(yǎng)時(shí)，叢生芽的誘導(dǎo)率在光照時(shí)間14 h/d條件下要高于10 h/d。

另外一個(gè)原因可能與選材有關(guān)，有些植株在一定程度上可能很難經(jīng)過(guò)愈傷組織分化增殖而成為一個(gè)完整的植株。器官發(fā)生是指植物不同器官直接不定芽及不定根分化進(jìn)而產(chǎn)生完整植株的過(guò)程，包括直接和間接2種途徑。前者是外植體直接不定芽及根誘導(dǎo)，后者則需先產(chǎn)生愈傷組織，再不定芽及根誘導(dǎo)[19]。最適宜作為毛建草組織培養(yǎng)及快速繁殖的外植體可能是其帶腋芽的莖段，劉俊等[3]利用毛建草帶腋芽的莖段建立了毛建草的快繁體系；張樹(shù)河等[20]利用迷迭香帶腋芽的莖段實(shí)現(xiàn)了迷迭香的組培快繁技術(shù)。以上研究表明，適宜毛建草快繁體系建立的方式可能是器官發(fā)生的直接途徑。該結(jié)論有待進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證。

本研究表明，毛建草莖段愈傷組織誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基配方為MS＋6-BA0.5 mg/L＋NAA0.5 mg/L＋蔗糖30 g/L＋瓊脂6.5 g/L，誘導(dǎo)率高達(dá)97%；莖段愈傷組織繼代培養(yǎng)時(shí)更容易生根。植物組織培養(yǎng)可以對(duì)植物進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)，不占用耕地，在完全人工控制的情況下不斷進(jìn)行生產(chǎn)，不受地區(qū)、季節(jié)、土壤及有害生物的影響。所以，利用組織培養(yǎng)可以實(shí)現(xiàn)毛建草的大規(guī)模生產(chǎn)。