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    特發(fā)性心房顫動(dòng)患者Th17細(xì)胞及其細(xì)胞因子的表達(dá)水平及相關(guān)性研究

    2019-04-24 06:07:38謝文超劉明鄒光新林智海姚光
    關(guān)鍵詞:百分率房顫外周血

    謝文超,劉明,鄒光新,林智海,姚光

    (1.玉林市第一人民醫(yī)院 心內(nèi)科,廣西 玉林 537000;2.玉林市第四人民醫(yī)院 心內(nèi)科,廣西 玉林 537012)

    心房顫動(dòng)(atrial fibrillation,AF)是臨床常見(jiàn)的心律失常,往往與腦卒中、心力衰竭密切相關(guān)?,F(xiàn)有的成果表明AF與炎癥有密切關(guān)系[1-2]。AF患者心房組織有炎癥浸潤(rùn),炎癥反應(yīng)導(dǎo)致心房、心室纖維化,形成炎癥-纖維化惡性循環(huán),促進(jìn)AF的進(jìn)展[3]。有研究證實(shí),AF炎癥浸潤(rùn)表現(xiàn)為淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞在心房組織募集并釋放相關(guān)細(xì)胞因子[4]。

    輔助性T淋巴細(xì)胞亞群17(helper T cell 17,Th17)是CD4+T淋巴細(xì)胞的一個(gè)亞群,主要分泌白細(xì)胞介素-17(Interleukin 17,IL-17)。Th17和IL-17廣泛參與心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展。然而,Th17與特發(fā)性AF的關(guān)系如何,目前研究不多,故筆者設(shè)計(jì)本研究,以期為治療AF提供新的靶點(diǎn)。

    1 資料與方法

    1.1 一般資料

    選取2016年2月—2018年2月于玉林市第一人民醫(yī)院心內(nèi)科就診的特發(fā)性AF患者80例。根據(jù)2010年歐洲心臟病學(xué)會(huì)指南對(duì)AF患者進(jìn)行診斷分型及分組[5]。其中,陣發(fā)性心房顫動(dòng)(paroxysmal atrial fibrillation,PAF)患者34例作為PAF組,慢性心房顫動(dòng)患者46例作為慢性房顫組。選取年齡匹配的同期健康體檢者80例作為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn):根據(jù)心電圖或者動(dòng)態(tài)心電圖提示為AF。排除標(biāo)準(zhǔn):①器質(zhì)性心臟病合并AF,包括冠狀動(dòng)脈硬化性心臟病合并AF、先天性心臟病合并AF、瓣膜性心臟病合并AF、肺源性心臟病合并AF及心肌病合并AF;②急性或者慢性炎癥;③自身免疫性疾病如心肌炎、風(fēng)濕熱及類風(fēng)濕性疾病等;④甲狀腺功能異常;⑤嚴(yán)重肝、腎功能不全;⑥惡性腫瘤;⑦近期開(kāi)放性手術(shù)及創(chuàng)傷史。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò),患者均遵循自愿原則。

    1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

    PAF診斷:AF患者在發(fā)病7 d內(nèi)自行終止或進(jìn)行干預(yù)后終止;慢性心房顫動(dòng)診斷:包括持續(xù)性或永久性AF,指患者AF持續(xù)時(shí)間>7 d,或患者和臨床醫(yī)生共同決定放棄恢復(fù)和/或維持竇性心律的治療。

    1.3 主要試劑及儀器

    CD4-FITC抗體、IL-17-PE抗體及IgG1-PE同型對(duì)照抗體購(gòu)自美國(guó)BD公司。IL-17酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒、IL-6 ELISA試劑盒、IL-22 ELISA試劑盒及基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase 9,MMP-9)ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)RayBiotech公司,F(xiàn)C-500型流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)貝克曼公司。

    1.4 方法

    1.4.1 標(biāo)本處理所有患者在清晨抽取靜脈血,分別置于普通干燥管5 ml、抗凝管2 ml。2 h內(nèi)將5 ml外周血在4℃、以2 000 r/min離心20 min取上層血清,-80℃保存。2 ml抗凝血按照Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)。用RPMl 1640培養(yǎng)液+胎牛血清重懸PBMCs,加入刺激劑50μg/L佛波酯、500μg/L離子霉素及1.7μg/ml莫能霉素在37℃、5%二氧化碳CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h,PBS清洗后離心備用。加入CD4-FITC抗體,4℃避光孵育30 min,固定和破膜后均分為2管,對(duì)照管加入IgG1-PE 10μl,測(cè)定管加入IL-17-PE 10μl,避光孵育30 min,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

    1.4.2 Th17細(xì)胞檢測(cè)Th17細(xì)胞數(shù)量以IL-17+細(xì)胞數(shù)量表示,Th17細(xì)胞百分率以IL-17+細(xì)胞數(shù)量除以CD4+T細(xì)胞數(shù)量表示,用前向散射光及側(cè)向散射光圈出淋巴細(xì)胞,以CD4+T細(xì)胞設(shè)門,檢測(cè)IL-17-PE+細(xì)胞數(shù)量。流式結(jié)果分析使用FlowJo軟件(美國(guó) Tree Star公司)。

    1.4.3 ELISA檢 測(cè)血 清IL-17、IL-6、IL-22及MMP-9表達(dá)水平按照ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)。

    1.4.4 超聲心動(dòng)圖檢測(cè)心臟彩超測(cè)量左心房?jī)?nèi)徑(left atrial dimension,LAD)、右房?jī)?nèi)徑(right atrial dimension,RAD)、左心室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end diastolic dimension,LVDd)及左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction,LVEF)。

    1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,比較用單因素方差分析,進(jìn)一步兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以率(%)表示,比較用χ2檢驗(yàn),相關(guān)性分析用Spearman相關(guān)分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 3組患者一般資料比較

    3組患者在年齡、男性比例、高血壓、糖尿病及吸煙方面比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

    2.2 3組患者Th17細(xì)胞及其細(xì)胞因子比較

    2.2.1 Th17細(xì)胞百分率對(duì)照組、PAF組、慢性房顫組患者Th17細(xì)胞百分率分別為(0.95±0.22)%、(2.98±0.38)%和(3.17±0.52)%,經(jīng)單因素方差分析,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=695.000,P=0.000);進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)SNK-q檢驗(yàn),PAF組、慢性房顫組高于對(duì)照組(P<0.05),慢性房顫組高于PAF組(P<0.05)。見(jiàn)圖1、2。

    2.2.2 IL-17對(duì)照組、PAF組、慢性房顫組外周血IL-17濃度分別為(11.42±5.67)、(33.64±8.95)和(38.16±11.88)pg/ml,經(jīng)單因素方差分析,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=170.400,P=0.000);進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)SNK-q檢驗(yàn),PAF組、慢性房顫組高于對(duì)照組(P<0.05),慢性房顫組高于PAF組(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

    2.2.3 IL-6對(duì)照組、PAF組、慢性房顫組外周血IL-6濃 度 分 別 為(11.66±6.85)、(21.94±9.02)和(26.05±9.89)pg/ml,經(jīng)單因素方差分析,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=48.910,P=0.000);進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)SNK-q檢驗(yàn),PAF組、慢性房顫組高于對(duì)照組(P<0.05),慢性房顫組高于PAF組(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

    2.2.4 IL-22對(duì)照組、PAF組、慢性房顫組外周血IL-22濃 度 分 別 為(0.33±0.24)、(0.79±0.22)和(0.91±0.38)pg/ml,經(jīng)單因素方差分析,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=71.230,P=0.000);進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)SNK-q檢驗(yàn),PAF組、慢性房顫組高于對(duì)照組(P<0.05),慢性房顫組與PAF組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖3。

    2.3 3組患者M(jìn)MP-9水平比較

    對(duì)照組、PAF組及慢性房顫組患者M(jìn)MP-9水平 分 別 為(194.71±86.95)、(386.52±132.41)和(541.86±200.68)ng/ml,經(jīng)單因素方差分析,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=95.450,P=0.000);進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)SNK-q檢驗(yàn),PAF組、慢性房顫組高于對(duì)照組(P<0.05),慢性房顫組高于PAF組(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

    表1 3組患者一般資料比較

    圖1 3組患者Th17細(xì)胞表達(dá)流式圖

    圖2 3組患者Th17細(xì)胞百分率比較(±s)

    圖3 3組患者IL-17、IL-6及IL-22濃度比較(±s)

    圖4 3組患者M(jìn)MP-9水平比較(±s)

    2.4 AF患者Th17細(xì)胞百分率與超聲心動(dòng)圖參數(shù)的相關(guān)性

    AF患者Th17細(xì)胞百分率與LAD呈正相關(guān)(rs=0.387,P=0.028),與LVEF呈負(fù)相關(guān)(rs=-0.268,P=0.035),與RAD和LVDd無(wú)相關(guān)性(rs=0.045和0.156,P=0.827和0.581)。

    3 討論

    本研究發(fā)現(xiàn),AF患者外周血中Th17細(xì)胞及其分泌的IL-17、IL-6及IL-22較對(duì)照組升高,而Th17細(xì)胞是一類強(qiáng)烈促炎細(xì)胞,表明AF與Th17細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥浸潤(rùn)相關(guān)。Th17細(xì)胞是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的CD4+T淋巴細(xì)胞亞群,其主要通過(guò)分泌的IL-17在心血管疾病中起著重要的作用。WU等[6]研究表明Th17細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子在AF患者中高表達(dá),提示Th17細(xì)胞參與AF的病理進(jìn)程。HE等[7]發(fā)現(xiàn)在冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)后出現(xiàn)AF的患者Th17/Treg比例失衡,其可以作為預(yù)測(cè)術(shù)后AF的準(zhǔn)確性、特異性的指標(biāo)。葛衛(wèi)力等[1]的研究提示在持續(xù)性AF患者中,Th17及其細(xì)胞因子IL-17升高。這些研究都表明Th17細(xì)胞及IL-17與AF密切相關(guān)。而筆者的研究對(duì)象是特發(fā)性AF患者,排除器質(zhì)性心臟病,減少臨床混雜因素影響,提供更加直接的證據(jù)表明AF與炎癥相關(guān)。既往研究表明,持續(xù)性或永久性AF患者的CRP水平明顯高于PAF患者,提示較高的炎癥因子可能與AF程度有關(guān)[8]。本研究也發(fā)現(xiàn)慢性心房顫動(dòng)患者Th17細(xì)胞及IL-17、IL-6較PAF升高,提示慢性心房顫動(dòng)的炎癥水平高于PAF,表明炎癥與AF進(jìn)程相關(guān)。

    本研究還發(fā)現(xiàn),外周血IL-6在PAF及慢性心房顫動(dòng)患者中高表達(dá),與AULIN等發(fā)現(xiàn)血清中的CRP和IL-6在AF期間顯著增加的結(jié)果是一致的[9]。CANPOLAT等[10]報(bào)道稱血清IL-6水平升高與電復(fù)律和導(dǎo)管消融后AF復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)。在長(zhǎng)期隨訪中,血清IL-6水平與接受抗凝治療的永久或者陣發(fā)性AF患者的不良事件和死亡率有關(guān)[11]。這些證據(jù)表明,IL-6與AF有密切聯(lián)系,而IL-6是Th17細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子之一,也就是表明,Th17細(xì)胞可以通過(guò)分泌IL-6引起心房炎癥浸潤(rùn)導(dǎo)致AF。但是IL-6來(lái)源不只是Th17細(xì)胞,最近的研究表明,活化的B細(xì)胞可以通過(guò)分泌IL-6促進(jìn)CD4+T細(xì)胞分化為Th17細(xì)胞[12]。所以,在免疫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中,IL-6在不同的作用靶點(diǎn)扮演不同的角色,而IL-6如何發(fā)揮不同的生物學(xué)效應(yīng)還需進(jìn)一步研究。

    結(jié)構(gòu)重構(gòu)、電重構(gòu)在AF的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用,其中結(jié)構(gòu)重塑與細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)有關(guān)。而ECM的組成和變化又由MMPs調(diào)節(jié)。IYER等[13]研究發(fā)現(xiàn)MMP-9在心肌梗死后ECM重塑中起關(guān)鍵作用。本研究發(fā)現(xiàn),MMP-9在PAF及慢性心房顫動(dòng)患者中升高,并且在慢性心房顫動(dòng)患者較PAF患者增高,提示AF與心肌重構(gòu)有關(guān)。進(jìn)一步研究表明,持續(xù)性AF患者血清纖維蛋白炎癥生物標(biāo)志物MMP-9、Ⅲ型膠原及hs-CRP水平高于無(wú)AF對(duì)照組,并且與左房容積、心房重構(gòu)指數(shù)呈正相關(guān)[14]。但Th17或者IL-17如何影響MMP-9還需進(jìn)一步的研究。

    綜上所述,PAF及慢性心房顫動(dòng)患者Th17細(xì)胞激活,其分泌的IL-17、IL-6及IL-22升高,并且纖維化標(biāo)志物MMP-9也高表達(dá),與AF的進(jìn)程有關(guān),炎癥和纖維化共同作用于AF的發(fā)生與發(fā)展。本研究樣本量偏小,且為單中心研究,今后還需要多中心、大樣本量研究進(jìn)一步證實(shí)。

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