特發(fā)性膜性腎病患者血清CTLA-4水平 及其臨床意義

方華偉，鄭曉榮

（嘉興市第二醫(yī)院 腎內(nèi)科，浙江 嘉興 314000）

特發(fā)性膜性腎病是膜性腎病的主要類型，也是成人腎病綜合征最常見的原因[1-2]。腎小球上皮側(cè)抗體介導(dǎo)免疫復(fù)合物形成，其是特發(fā)性膜性腎病腎組織損傷的主要機(jī)制[3]。細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原4（cytotoxic T lymphocyte antigen-4,CTLA-4）具有多種免疫學(xué)效應(yīng)，具有下調(diào)免疫應(yīng)答作用，與多種免疫性疾病關(guān)系密切[4-5]。本文對(duì)特發(fā)性膜性腎病患者血清可溶性細(xì)胞毒性T細(xì)胞相關(guān)抗原4（soluble cytotoxic T lymphocyte associated antigen 4,sCTLA-4）水平及其臨床意義進(jìn)行研究，為臨床治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年1月—2017年6月嘉興市第二醫(yī)院腎內(nèi)科特發(fā)性膜性腎病患者80例作為膜性腎病組，同期80例健康體檢者作為對(duì)照組。膜性腎病組：男性54例，女性26例；年齡（48.57±13.24）歲。對(duì)照組：男性51例，女性29例；年齡（47.59±14.12）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：特發(fā)性膜性腎病患者均經(jīng)活檢確診為特發(fā)性膜性腎病，對(duì)照組患者經(jīng)體檢身體健康。排除標(biāo)準(zhǔn)：特發(fā)性膜性腎病患者近3個(gè)月內(nèi)使用過(guò)環(huán)磷酰胺、甲基潑尼松龍、他克莫司、環(huán)孢素A及霉酚酸酯等免疫抑制劑；系統(tǒng)性紅斑狼瘡、乙肝病毒相關(guān)性腎炎、過(guò)敏性紫癜及腫瘤等繼發(fā)性膜性腎??；病史中有其他自身免疫性疾病；對(duì)照組患內(nèi)外科等基礎(chǔ)疾病，肝腎功能等體檢檢查結(jié)果異常。兩組性別、年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 特發(fā)性膜性腎病治療方法所有患者入院后再降壓、利尿、抗凝及調(diào)脂等常規(guī)治療的基礎(chǔ)上給予潑尼松龍聯(lián)合環(huán)磷酰胺治療。潑尼松龍的起始劑量為0.8～1.0 mg/（kg·d），維持2個(gè)月后每2個(gè)星期減原始劑量的10%至停用；環(huán)磷酰胺的初始劑量為1～2 g/d，3個(gè)月后開始減量，6個(gè)月時(shí)維持0.75～1.50 g/d，12個(gè)月時(shí)維持0.5～1.0 g/d，直至停藥。

1.2.2 臨床資料收集收集患者性別、年齡及治療情況，治療前和治療后（治療12個(gè)月時(shí)）實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)[血清白蛋白、24 h尿蛋白量及血肌酐（serum creatiroine,Scr）]等資料。

1.2.3 療效評(píng)價(jià)治療12個(gè)月時(shí)判斷療效，完全緩解：患者治療后尿蛋白＜0.3 g/d，腎功能和血清白蛋白恢復(fù)正常；部分緩解：治療后患者血清白蛋白＞ 30 g/l，尿蛋白減少≥50%；無(wú)效：治療后未達(dá)到上述標(biāo)準(zhǔn)者。

1.2.4 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞測(cè)定對(duì)照組患者抽取體檢當(dāng)天清晨外周靜脈血、膜性腎病組患者抽取治療前和治療后（治療12個(gè)月）外周靜脈血，取100μl乙二胺四乙酸抗凝全血，加入流式專用管中，加入CD25-PE和CD4-FITC混勻，孵育30 min標(biāo)記CD4+、CD25+T細(xì)胞，經(jīng)過(guò)穿膜、封閉后，加入APC-抗人Foxp3單抗孵育30 min，用FACS Aria型流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）檢測(cè)調(diào)節(jié)T細(xì)胞（CD4+、CD25+及Foxp3+T細(xì)胞）在外周淋巴細(xì)胞中的數(shù)量（實(shí)驗(yàn)所用所有抗體購(gòu)自美國(guó)Beckman Coulter公司）。

1.2.5 血清sCTLA-4水平測(cè)定對(duì)照組患者抽取體檢當(dāng)天清晨外周靜脈血、膜性腎病組患者抽取治療前和治療后（治療12個(gè)月）外周靜脈血，采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）法測(cè)定血清sCTLA-4水平（ELISA試劑盒購(gòu)自?shī)W地利Bender Medsystems公司）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19．0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗(yàn)或方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；相關(guān)性分析用Pearson法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者各臨床指標(biāo)比較

兩組血清白蛋白、Scr、24 h尿蛋白量、調(diào)節(jié)性細(xì)胞計(jì)數(shù)及sCTLA-4水平比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；膜性腎病組患者血清白蛋白、調(diào)節(jié)性細(xì)胞計(jì)數(shù)及sCTLA-4水平低于對(duì)照組，而Scr和24 h尿蛋白量高于對(duì)照組。見表1。

2.2 膜性腎病不同危險(xiǎn)程度患者各臨床指標(biāo)比較

膜性腎病中高危組和低危組血清白蛋白、Scr、24 h尿蛋白量、調(diào)節(jié)性細(xì)胞計(jì)數(shù)及sCTLA-4水平比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；膜性腎病中高危組患者血清白蛋白、調(diào)節(jié)性細(xì)胞計(jì)數(shù)及sCTLA-4水平均低于低危組，而Scr和24 h尿蛋白量高于低危組。見表2。

2.3 膜性腎病患者治療前后各臨床指標(biāo)比較

膜性腎病患者治療前后血清白蛋白、Scr、24 h尿蛋白量、調(diào)節(jié)性細(xì)胞計(jì)數(shù)及sCTLA-4水平比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；膜性腎病患者治療后血清白蛋白、調(diào)節(jié)性細(xì)胞計(jì)數(shù)及sCTLA-4水平均高于治療前，而Scr和24 h尿蛋白量低于治療前。見表3。

2.4 膜性腎病不同療效組各臨床指標(biāo)比較

不同療效組血清白蛋白、Scr、24 h尿蛋白量、調(diào)節(jié)性細(xì)胞計(jì)數(shù)及sCTLA-4水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。部分緩解和完全緩解患者血清白蛋白、調(diào)節(jié)性細(xì)胞計(jì)數(shù)及sCTLA-4水平均高于無(wú)效患者，而Scr和24 h尿蛋白量低于無(wú)效患者；完全緩解患者血清白蛋白、調(diào)節(jié)性細(xì)胞計(jì)數(shù)及sCTLA-4水平均高于部分緩解患者，而Scr和24 h尿蛋白量均低于部分緩解患者。見表4。

2.5 治療前sCTLA-4水平與各臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析

膜性腎病患者治療前sCTLA-4水平與血清白蛋白、調(diào)節(jié)性細(xì)胞計(jì)數(shù)呈正相關(guān)（r=0584和6.421，均P=0.000），與Scr、24 h尿蛋白量呈負(fù)相關(guān)（r=-0547和-0.628，均P=0.000）。

表1 兩組患者各臨床指標(biāo)比較（n=80，±s）

表1 兩組患者各臨床指標(biāo)比較（n=80，±s）

組別 血清白蛋白/（g/L） Scr/（μmol/L） 24 h尿蛋白量/g 調(diào)節(jié)性細(xì)胞計(jì)數(shù)/（個(gè)/μl） sCTLA-4/（ng/ml）膜性腎病組 25.46±5.42 86.47±15.32 5.13±1.42 21.73±4.65 0.53±0.18對(duì)照組 44.15±6.23 58.35±13.24 0.04±0.01 32.84±5.18 0.98±0.21 t值 20.244 12.421 32.060 14.275 14.552 P值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

表2 膜性腎病不同危險(xiǎn)程度患者各臨床指標(biāo)比較（±s）

表2 膜性腎病不同危險(xiǎn)程度患者各臨床指標(biāo)比較（±s）

組別 n 血清白蛋白/（g/L） Scr/（μmol/L） 24 h尿蛋白量/g 調(diào)節(jié)性細(xì)胞計(jì)數(shù)/（個(gè)/μl） sCTLA-4/（ng/ml）中高危組 63 23.71±5.08 92.16±13.03 5.74±1.06 18.35±4.82 0.49±0.16低危組 17 31.64±5.23 77.25±12.19 2.68±0.77 24.67±4.73 0.64±0.17 t值 5.677 4.241 11.115 4.816 3.386 P值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

表3 膜性腎病患者治療前后各臨床指標(biāo)比較（n=80，±s）

表3 膜性腎病患者治療前后各臨床指標(biāo)比較（n=80，±s）

組別 血清白蛋白/（g/L） Scr/（μmol/L） 24 h尿蛋白量/g 調(diào)節(jié)性細(xì)胞計(jì)數(shù)/（個(gè)/μl） sCTLA-4/（ng/ml）治療前 25.46±5.42 86.47±15.32 5.13±1.42 21.73±4.65 0.53±0.18治療后 38.47±5.83 66.45±14.86 1.21±0.32 27.68±4.82 0.82±0.20差值 -13.01±1.73 20.02±3.26 3.92±0.84 -5.95±0.93 -0.29±0.06 t值 67.263 54.928 41.740 57.224 43.231 P值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

表4 不同療效組血清白蛋白、Scr、24 h尿蛋白量、調(diào)節(jié)性細(xì)胞和sCTLA-4水平比較（±s）

表4 不同療效組血清白蛋白、Scr、24 h尿蛋白量、調(diào)節(jié)性細(xì)胞和sCTLA-4水平比較（±s）

注：1）與無(wú)效比較，P＜0.05，2）與部分緩解比較，P＜0.05

組別 n 血清白蛋白/（g/L） Scr/（μmol/L） 24 h尿蛋白量/g 調(diào)節(jié)性細(xì)胞計(jì)數(shù)/（個(gè)/μl） sCTLA-4/（ng/ml）無(wú)效 21 24.42±5.38 83.24±14.53 4.97±1.23 23.42±4.16 0.56±0.15部分緩解 16 36.47±5.971） 68.69±14.731） 1.53±0.381） 26.75±4.721） 0.77±0.171）完全緩解 43 41.32±6.061）2） 62.14±14.651）2） 0.21±0.071）2） 30.79±4.631）2） 0.93±0.141）2）F值 58.506 14.669 378.08 19.487 44.003 P值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

3 討論

膜性腎病主要的治療為免疫抑制藥物治療，部分患者經(jīng)免疫抑制藥物治療后完全康復(fù)；部分患者經(jīng)免疫抑制藥物治療后尿蛋白轉(zhuǎn)陰；也有部分患者治療無(wú)效，可能發(fā)展為腎臟病末期，需要透析維持治療[6-8]。特發(fā)性膜性腎病在特定條件下抗原暴露，被樹突細(xì)胞識(shí)別并遞呈給CD4+T細(xì)胞，CD4+T細(xì)胞在白細(xì)胞介素4的作用下被激活，并分為呈Th2細(xì)胞。Th2細(xì)胞分泌細(xì)胞因子促進(jìn)Th2分化[9-10]，Th2分泌的細(xì)胞因子激活B淋巴細(xì)胞，促進(jìn)特異性抗體IgG4釋放，形成原位免疫復(fù)合物，激活補(bǔ)體系統(tǒng)，促進(jìn)基底膜增厚，從而引起足細(xì)胞損傷，發(fā)生蛋白尿[11-12]。

CTLA-4是CD28同源分子，CTLA-4可和CD28競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合B7-1分子和B7-2分子，干擾Th1/2的轉(zhuǎn)錄活性，影響Th細(xì)胞亞群發(fā)育，引起T細(xì)胞功能下 降[13]，其主要生物學(xué)活性為下調(diào)T細(xì)胞反應(yīng)，抑制免疫應(yīng)答反應(yīng)[14]。sCTLA-4是膜結(jié)合CTLA-4蛋白的可變剪接物，sCTLA-4序列缺失膜結(jié)合區(qū)氨基酸片段，其表達(dá)量隨著T細(xì)胞的活化而減少，而膜結(jié)合CTLA-4的表達(dá)量則隨著T細(xì)胞的活化而增加[15-16]。本研究發(fā)現(xiàn)，特發(fā)性膜性腎病患者血清sCTLA-4水平下降，血清sCTLA-4水平可為特發(fā)性膜性腎病的診斷提供依據(jù)，其水平下降程度在疾病嚴(yán)重程度、療效判斷及預(yù)后評(píng)估中具有重要意義。分析特發(fā)性膜性腎病時(shí)血清sCTLA-4水平下降，從而對(duì)Th1/2的轉(zhuǎn)錄活性的抑制作用降低，上調(diào)T細(xì)胞反應(yīng)，引起免疫應(yīng)答反應(yīng)，促進(jìn)腎小球上皮細(xì)胞或基底膜免疫復(fù)合物的沉積；促進(jìn)基底膜增厚，引起足細(xì)胞損傷，發(fā)生蛋白尿。sCTLA-4水平越低，對(duì)Th1/2的轉(zhuǎn)錄活性抑制作用越低，引起足細(xì)胞損傷越嚴(yán)重，尿蛋白水平越高。治療后，隨著sCTLA-4水平升高，對(duì)Th1/2的轉(zhuǎn)錄活性抑制作用增強(qiáng)，對(duì)足細(xì)胞損傷減輕，蛋白尿減少。

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（CD4+、CD25+Treg）可 抑 制CD4+T淋巴細(xì)胞增殖，抑制自身反應(yīng)性CD8+細(xì)胞和白細(xì)胞介素2等細(xì)胞因子分泌[17-18]。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞還可抑制抗原遞呈細(xì)胞活化Th細(xì)胞、Th細(xì)胞活化B細(xì)胞及B細(xì)胞產(chǎn)生抗體，從而減弱免疫復(fù)合物對(duì)組織的損傷[19]。研究發(fā)現(xiàn)，在膜性腎病患者外周血中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量也減少，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量異常和膜性腎病的發(fā)生關(guān)系密切[20]。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可表達(dá)CTLA-4，降低CTLA-4水平可抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞活性，減弱其對(duì)免疫反應(yīng)的抑制作用，從而引起自身免疫性疾病的發(fā)生[21-22]。本研究發(fā)現(xiàn)，膜性腎病患者外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量減少，血清sCTLA-4水平和外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)。表明血清sCTLA-4水平在某種程度上可反應(yīng)機(jī)體的免疫狀態(tài)。

綜上所述，特發(fā)性膜性腎病患者血清sCTLA-4水平下降，抑制其對(duì)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的活化，降低調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對(duì)免疫的抑制作用，從而增強(qiáng)免疫復(fù)合物對(duì)腎組織的損傷。