內(nèi)蒙古五個環(huán)柄菇形態(tài)學(xué)及rDNA-ITS鑒定

田慧敏 張亞男 李曉東 呂曉娜

（赤峰學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古赤峰024000）

環(huán)柄菇屬（Lepiota）隸屬擔(dān)子菌門（Basidiomycotina），層菌綱（Hymenomycetes），傘菌目（Agaricales），傘菌科（Agaricaceae）。該屬的主要特征是所有種都腐生于地上，菌蓋小或中等，菌蓋具鱗片，菌柄著生菌環(huán)，菌褶色淺，白色或乳白色，離生或彎生，孢子橢圓形，卵圓形，無色、光滑，類糊精質(zhì)，褶側(cè)囊體無，褶緣囊體豐富，棒狀或倒梨形[1-2]。據(jù)真菌索引統(tǒng)計(jì)，該屬真菌大約1500多種（包括變種和原變種）。近些年來，微觀形態(tài)及分子生物學(xué)技術(shù)在分類學(xué)上的廣泛應(yīng)用，該類真菌的分類發(fā)生了很大變化，許多種如囊皮菌屬Cystoderma和粘傘屬Limacella一些種從其相應(yīng)的屬分離出來獨(dú)立成屬[3-4]，同時白鬼傘屬Leucocoprinus、大環(huán)柄菇屬M(fèi)acrolepiota、白環(huán)菇屬Leucoagaricus、Cystolepiota和 Echinoderma從環(huán)柄菇屬分離獨(dú)立成屬[5-6]。這些屬因其外形特征相似，同環(huán)柄菇屬（Lepiota）合稱環(huán)柄菇類“Lepiotoid”[7]。筆者采用形態(tài)學(xué)和ITS片段測序技術(shù)相結(jié)合的鑒定方法對赤峰市不同地區(qū)的四個有毒環(huán)柄菇類真菌進(jìn)行鑒定，力求為環(huán)柄菇類快速識別提供依據(jù)，為其開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試標(biāo)本來源

供試標(biāo)本CFSZ11339、CFSZ11379由田慧敏等于2015-2017年采集于內(nèi)蒙古赤峰市翁牛特旗，CFSZ10575采集于赤峰市新城區(qū)，CFSZ11356采集于赤峰市紅山區(qū)動物園。采集的標(biāo)本在拍攝生境照片、觀察形態(tài)、測量數(shù)據(jù)、自然干燥、編寫號碼、超低溫冷凍等系列處理之后存放于赤峰學(xué)院生命科學(xué)院菌物本標(biāo)室（CFSZ）。

1.2 形態(tài)鑒定

采用傳統(tǒng)鑒定方法，宏觀特征采用肉眼觀察、游標(biāo)卡尺測量等方法，測量供試樣本的新鮮子實(shí)體大小、菌柄長度以及直徑、菌蓋直徑，觀察顏色。查閱文獻(xiàn)進(jìn)行檢索、比對、定種；顯微結(jié)構(gòu)在光學(xué)顯微鏡（奧特BED203）下觀察和測量孢子、擔(dān)子、菌蓋表皮、菌柄表皮菌絲形態(tài)及大小，所有數(shù)據(jù)均測量20個，用顯微照相系統(tǒng)（Olympus BX53）拍攝顯微結(jié)構(gòu)相片，孢子測量Q1（長寬比范圍）和Q2（長寬比平均值），Q2=Qa±Qsd（標(biāo)準(zhǔn)誤）。

1.3 ITS鑒定

1.3.1 DNA的提取

取干子實(shí)體菌蓋的一小部分研磨，稱量30 mg，用基因組DNA提取試劑盒完成對基因組DNA的提取。

1.3.2 PCR擴(kuò)增、純化及測序

PCR擴(kuò)增反應(yīng)在PCR擴(kuò)增儀（eppendorf 5331）上進(jìn)行。

經(jīng)引物ITS1/ITS4進(jìn)行50μL體系經(jīng)PCR擴(kuò)增后，在1.0%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。樣品PCR擴(kuò)增之后的產(chǎn)物用Takara膠純化試劑盒純化后，交由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成測序。

圖1 肉褐鱗環(huán)柄菇子實(shí)體形態(tài)及微觀結(jié)構(gòu)

1.3.3 ITS序列比對分析

將得到的ITS序列，通過Chromas軟件拼接，在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行ITS序列的Blast比對，從檢索的結(jié)果里挑選出同源性比較高的ITS序列，利用MEGA5.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)育樹的每個分支的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性分析以最大似然法進(jìn)行檢驗(yàn)，重復(fù)次數(shù)為1000次。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定，CFSZ11379為肉褐鱗環(huán)柄菇Lepiota brunneoincarnata Chodat&C.Martín，CFSZ11356為冠狀環(huán)柄菇 Lepiota cristata（Bolton）P.Kumm.，CFSZ10575為紅蓋白環(huán)菇Leucoagaricus rubrotinctus（Peck）Singer，CFSZ11339 為粉褶白環(huán)菇Leucoagaricus leucothites（Vittadini）P.D.Orton。

2.1.1 肉褐鱗環(huán)柄菇LepiotabrunneoincarnataChodat&C.Martín

子實(shí)體小，菌蓋直徑1.6～2.4 cm，鐘形，開傘后平展，白色，密被褐色或黑褐色鱗片，中部鱗片較密色深呈黑褐色，邊緣有短條紋。菌褶白色，厚，較寬，有短菌褶，離生。菌肉污白色或肉色。菌柄長2.4～5.2 cm，直徑0.3～0.6 cm，圓柱形，基部稍膨大，淺肉色至肉粉色，菌環(huán)位于菌柄中下部，白色或淺肉色，往往邊緣變褐或變黑，菌環(huán)以下具有黑褐色顆粒狀附屬物（圖1A、B）。

擔(dān)孢子（6.5～8.4）μm×（4.3～5.8）μm，[Q1=1.29～1.70，Q2=1.59±0.16]，卵圓形，有油滴，無色，光滑，非淀粉質(zhì)，類糊精質(zhì)，在KOH溶液中變?yōu)殇P紅色（圖1C、D）；擔(dān)子（20～30）μm×（6～7）μm，無色，棒狀，黃色顆粒狀物，具四個小梗，基部未見鎖狀聯(lián)合（圖1E）；褶緣囊體（24～36）μm×（7.2～12）μm，棒狀（圖1F），菌蓋表皮由無色菌絲組成，菌絲直徑7.0～12μm，無色，膨大，絲狀，分枝少（圖1G），蓋表鱗片由近似柵欄狀排列的菌絲組成，菌絲生長常倒伏，分枝，有隔膜，無色，具棕褐色色素，末端細(xì)胞（72～247.2）μm×（9.6～14.4）μm，紡錘形，長棒狀，圓柱形，頂端稍細(xì)，鎖狀聯(lián)合缺。

該種典型特點(diǎn)是菌蓋密被褐色鱗片，菌柄肉褐色，菌環(huán)以下密被黑褐色顆粒狀附屬物[8]。菌蓋表皮有膨大的菌絲，菌蓋鱗片由柵欄狀排列的菌絲組成，菌絲具棕褐色色素，菌絲頂端稍尖，屬于卵孢環(huán)柄菇組sec.Ovisporae[9]。該種在我國分布廣泛，富含鵝膏毒肽、鬼筆毒肽、鵝膏肽類毒素，可致肝腎損害、呼吸循環(huán)衰竭，誤食后發(fā)病危害肝腎，煩躁、抽搐、昏迷，死亡率高[10-11]。

研究標(biāo)本為CFSZ11379，2016年7月31日由田慧敏、柳艷斌采自于內(nèi)蒙古赤峰市，翁牛特旗五分地鎮(zhèn)巴林橋北，西拉沐淪河北岸道邊草地上。

2.1.2 冠狀環(huán)柄菇Lepiota cristata（Bolton）P.Kumm.

子實(shí)體小，菌蓋1.4～2.5 cm，近鐘形，后平展，乳白色，中央凸起，具淺棕色、紅棕色或黃褐色纖毛狀鱗片，中央密，向蓋緣鱗片逐漸稀疏，邊緣有短條紋；菌蓋遇KOH漸變黃色，菌褶白色，薄，直生或稍延生；菌肉白色，具淀粉香味；菌柄長1.4～4.2 cm，直徑0.1～0.2 cm，圓柱形，白色至淺灰色，中空，基部膨大呈球形，菌環(huán)上位，白色，膜質(zhì)（圖2A、B）。

圖2 冠狀環(huán)柄菇子實(shí)體形態(tài)及微觀結(jié)構(gòu)

孢子（6.7～9.1）μm×（4.3～6.2）μm，[Q1=（1.2～2.6，Q2=1.68±0.37]，楔形或瓜籽形，光滑，無色，非淀粉質(zhì)，類糊精質(zhì)（圖 2C、D）；擔(dān)子（19.2～31）μm×（6.0～7.2）μm，棒狀，無色，四個小梗，很短，基部具鎖狀聯(lián)合；褶側(cè)囊體缺失，褶緣囊體（19.2～39.0）μm×（8.4～12.0）μm，倒梨形或棒狀，無色（圖2E）。菌蓋表皮由膠化菌絲和無色菌絲組成，無色菌絲直徑7.2～12μm，分枝，頂端稍膨大，鈍圓，具鎖狀聯(lián)合；膠化菌絲直徑3.6～5μm，黃棕色，少，分枝；菌柄表皮菌絲排列整齊，直徑7.2～10.0μm，無色，（圖2F、G）。蓋表鱗片由長橢圓形、棒狀的菌絲細(xì)胞首尾相接組成，菌絲直徑9～12.0μm，無色，具隔膜，分枝少，末端細(xì)胞鈍圓（圖2H），菌柄表皮由排列整齊的菌絲組成，菌絲直徑7～9μm，無色，隔膜均勻，分枝少，排列整齊（圖2I）。

該種主要特征為子實(shí)體很小，菌蓋具紅棕色或黃鱗片，遇KOH變黃，菌柄光滑，具有楔形孢子，輕微的類糊精質(zhì)，菌蓋表皮菌絲不成柵欄狀，無色，稍膨大，屬于環(huán)柄菇組 sec.Lepiota[9，12-14]，該種在我國分布廣泛，具腸胃性毒素，含有高濃度重金屬[10，15]。

研究標(biāo)本為CFSZ11356，2016年7月31日由田慧敏、柳艷斌采自于內(nèi)蒙古赤峰市新城區(qū)機(jī)場路西側(cè)葡萄采摘園地上。

2.1.3 紅蓋白環(huán)菇Leucoagaricus rubrotinctus（Peck）Singer（內(nèi)蒙古新記錄種）

子實(shí)體中等大，菌蓋直徑2～4 cm，初期球形后平展，中央凸起，白色，具暗紅褐色纖毛狀鱗片，呈輻射狀，后期邊緣破裂或不破裂呈縱向纖毛狀。蓋面遇KOH漸變灰綠色，菌肉薄，白色，表皮下帶紅色。菌褶離生，稍密，不等長，白色。菌柄長約2.5 cm，粗0.2～0.3 cm，圓柱形，基部稍膨大，菌環(huán)以上淺米白色，菌環(huán)以下淺黃褐色，光滑，內(nèi)部空心，干后變深。菌環(huán)膜質(zhì)，白色，生菌柄的上部（圖3A）。

擔(dān)孢子（6.5～～9.6）μm×（3.0～5.3）μm，[Q1=（1.5～2.12），Q2=1.98±0.31]近卵圓形、長橢圓形，無色，光滑，類糊精質(zhì)，在Melzer中變紅（圖3B、C）。擔(dān)子（19.0～33.6）μm×（5.3～9.4）μm，棒狀，無色，四個小梗（圖3D）；褶側(cè)囊狀體缺失，褶緣囊體（30～36）μm×（9～12）μm，棒狀或倒梨形（圖3E）。菌蓋表皮由兩種菌絲組成，一種是膠化菌絲，直徑5～9μm，金黃色，表面光滑，隔膜很少，不分枝，另一種菌絲直徑7.7～16.8μm，無色，具顆粒狀物，頂端鈍圓，稍膨大（圖3F）；蓋表鱗片由柵欄狀排列菌絲組成 ，有 隔 膜 ，末 端 細(xì) 胞（67～156）μm ×（14.4～26.4）μm，頂端鈍圓，基部狹細(xì)，無色，有的具淺棕色色素（圖3G），菌柄由排列整齊的無色菌絲組成，有的菌絲頂端稍膨大，直徑10.1～14.4μm。

該種主要特點(diǎn)是菌蓋密被酒紅色、紅褐色或橘紅色纖毛狀附屬物，中央色深呈乳頭狀，邊緣色淺，受傷不變色[16]。該種于1882由Peck描述命名Lepiota rubrotincta Peck[17]，1948年Singer將其歸入白環(huán)菇屬（Leucoagaricus），紅色組 sec.Rubrotincti[17]，該種為內(nèi)蒙古新記錄種。

研究標(biāo)本為CFSZ10575，2015年9月6日由田慧敏、柳艷斌等采自于內(nèi)蒙古赤峰市紅山區(qū)動物園道邊雜草上。

圖3 紅蓋白環(huán)菇子實(shí)體形態(tài)及微觀結(jié)構(gòu)

圖4 粉褶白環(huán)菇子實(shí)體形態(tài)及微觀結(jié)構(gòu)

2.1.4 粉褶白環(huán)菇Leucoagaricus leucothites（Vittad.）Wasser=Lepiota leucothites（Vittadini）P.D.Orton

子實(shí)體小，菌蓋直徑2.2～3.6 cm，初鐘形或半球形，后平展，白色，中央有淺黃棕色平伏鱗片，干后邊緣有條紋，規(guī)則開裂。菌肉薄，白色，菌褶直生或彎生，稍密，不等長，白色，干后米黃色。菌柄長2～3 cm，粗0.2～0.3 cm，圓柱形，基部膨大，光滑，淺棕色，內(nèi)部空心，老后變深至灰棕色。菌環(huán)膜質(zhì)，白色，位于菌柄的上部（圖4A）。

圖5 球孢青褶傘子實(shí)體形態(tài)及微觀結(jié)構(gòu)

擔(dān)孢子（6.5～10）μm×（3.6～4.8）μm，[Q1=（1.47～2.2），Q2=1.72±022]，長橢圓形，瓜子形，無色，光滑，類糊精質(zhì)（圖 4B）。擔(dān)子（19.0～27.6）μm×（5.3～8.4）μm，棒狀，無色，四個小梗（圖4D），褶側(cè)囊狀體缺失，褶緣囊體（14.4～26.4）μm×（7.2～9.6）μm，倒梨形，無色（圖4E）。菌蓋表皮由無色菌絲組成，具無色顆粒狀物，（28.8～40.8）μm×（9.6～13.2）μm（圖4F）。菌蓋鱗片由無色菌絲首尾相接組成，菌絲直徑（9.6～18）μm，長橢圓形（圖4C）。菌柄表皮由排列整齊的菌絲組成，菌絲直徑7～10μm，隔膜均勻，淺棕色（圖4G）。

該種主要特點(diǎn)是子實(shí)體純白色，菌環(huán)白色，表面幼時光滑，有時菌蓋中央具淺黃棕色或米黃色鱗片，且菌蓋中央幼時會龜裂[18-19]。該種幼時與致命毒性的白毒傘Amanita verna相似，但是該種沒有菌托，注意區(qū)別，在我國分布廣泛，具胃腸道反應(yīng)毒素，疑似有毒，慎食[20-21]。

研究標(biāo)本為CFSZ11339，2016年7月30日由田慧敏、柳艷斌采自內(nèi)蒙古赤峰市境內(nèi)西拉沐淪河北岸巴林橋北草地。

2.1.5 球孢青褶傘Chlorophyllum sphaerosporum Z.W.Ge&Zhu L.Yang（內(nèi)蒙古特有種）

子實(shí)體小到中等。菌蓋直徑2.3～5.2 cm，半球形，中間凸出，表面白色至污白色，附棕色至紅棕色的叢毛狀小鱗片，老后易脫落，邊緣有微弱的短條紋。干燥時，菌褶密，白色至奶油色，離生，不等長。菌柄長3～5 cm，粗0.3～0.8 cm，圓柱形基部上膨大，白色，受傷不變色，菌環(huán)位于菌柄上部，膜質(zhì)，白色，可移動，易脫落（圖5A、B）。菌肉白色，薄，味溫和。

擔(dān) 孢 子（7.5～10.4）μm ×（7.0～9.6）μm，（Q1=1.02～1.25），Q2=1.18±0.05）近球形，寬橢圓形，光滑，透明，厚壁（約0.5μm），有小短柄，易脫落，糊精質(zhì)（圖5D）；擔(dān)子（29～41）μm×（9.5～12.5）μm，棒狀，薄壁，4個孢子，透明，有的基部鎖狀聯(lián)合。褶側(cè)囊體無，褶緣囊體（24～36）μm×（8～10）μm，棒狀或?qū)挵魻?，無色透明，薄壁。菌蓋表皮由特化的柵欄狀排列的菌絲組成，菌絲末端細(xì)胞（74～120）μm×（14.4～24.0）μm，形狀各異，棒狀、瓶形、腹鼓狀，無色。蓋表鱗片由柵欄形排列的菌絲組成，菌絲無色，具隔膜，分枝，末端細(xì)胞（21.6～31.2）μm×（6～10.1）μm，短棒狀或倒梨形。

球孢青褶傘外形與庭院青褶傘Ch.hortense相似，都具有白色菌蓋和棕色鱗片，孢子沒有芽孔，但是后者擔(dān)子著生2孢子，孢子橢圓形，菌柄受傷變色。而球孢青褶傘具有球形的孢子，孢子較小，在蓋表皮鱗片菌絲末端細(xì)胞呈短棒狀，頂端稍膨大[22]。分子檢索與Ch.lusitanicum相似度較高97%，但是二者形態(tài)差異很大，Ch.Lusitanicum子實(shí)體呈亞球形，孢子有臍狀附屬物[23]，該種首次發(fā)現(xiàn)于內(nèi)蒙古[22]，但未見詳細(xì)描述，后期也沒有相關(guān)報道，為內(nèi)蒙古特有種，食毒不明，甚食。

研究標(biāo)本為CFSZ10555，2015年9月6日由田慧敏、柳艷斌等采自于內(nèi)蒙古赤峰市紅山區(qū)動物園道邊雜草上。

2.2 rDNA-ITS測序鑒定結(jié)果

2.2.1 四個環(huán)柄菇樣品的ITS測序結(jié)果

四個樣品DNA的ITS序列，經(jīng)檢測CFSZ11379長度為704 bp（登錄號為MG367257），CFSZ11356為710 bp（登錄號為MG367255），CFSZ 10575為698 bp（登錄號為MG367253），CFSZ11339為725 bp（登錄號為MG367254），CFSZ10555為720 bp。

2.2.2 五個環(huán)柄菇樣品ITS序列對比結(jié)果

將測得的五個標(biāo)本ITS序列在GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast比對分析，每個標(biāo)本選擇具有較高相似度的序列，共獲得30個真菌DNA序列（表1）。

表1 與供試環(huán)柄菇5個標(biāo)本rDNA-ITS序列最相似的物種

2.2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果

對五個樣本CFSZ11339、CFSZ11356、CFSZ11379、CFSZ10575、CFSZ10555的ITS序列及與其高度相似的序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明：所有序列一共三大分支，第一支白環(huán)菇屬（Leucoagaricus），第二支青褶傘屬（Chlorophyllum），第三支環(huán)柄菇屬Lepiota。其中CFSZ 11379與Lepiota brunneoincarnata聚在一起，結(jié)合宏觀特征和微觀結(jié)構(gòu)將標(biāo)本CFSZ11379鑒定為肉褐鱗環(huán)柄菇L.brunneoincarnata Chodat&C.Martín，CFSZ11356與 L.cristata聚在一起，結(jié)合宏觀特征和微觀結(jié)構(gòu)將標(biāo)本CFSZ11356鑒定為冠狀環(huán)柄菇Lepiota cristata（Bolton）P.Kumm.，CFSZ10575與La.rubrotinctus（Peck）Singer聚在一起，結(jié)合宏觀特征和微觀結(jié)構(gòu)將標(biāo)本CFSZ10575鑒定為紅蓋白環(huán)菇La.rubrotinctus（Peck）Singer，11339 與 La.leucothites聚在一起，結(jié)合宏觀特征和微觀結(jié)構(gòu)將標(biāo)本CFSZ 11339 鑒 定為 粉 褶 白 環(huán)菇 La.leucothites（Vittad.）Wasser，CFSZ10555 與 Chlorophyllum sphaerosporum聚在一起，結(jié)合宏觀特征和微觀結(jié)構(gòu)將標(biāo)本CFSZ10575鑒定為球孢青褶傘Chlorophyllum sphaerosporum Z.W.Ge&Zhu L.Yang。

3 小 結(jié)

圖6 系統(tǒng)發(fā)育樹

環(huán)柄菇類真菌分類復(fù)雜，種類多，很多種外形特征極其相似，很多種都有毒，有的種為劇毒，如褐鱗環(huán)柄菇（L.helveola Bres.）、酒紅環(huán)柄菇（L.josserandii Bon&Boiffard）等，誤食常會危及生命[10-11，22]。而且該類真菌往往分布在公園、農(nóng)田、林緣、道邊、草地等地，被采食的概率極高，存在潛在的危險。詳細(xì)介紹了內(nèi)蒙古境內(nèi)的四種有毒環(huán)柄菇，并進(jìn)行了鑒定驗(yàn)證，四種菇均有不同程度的毒性，其中肉褐鱗環(huán)柄菇 L.brunneoincarnata Chodat&C.Martín為極毒菌，誤食后會導(dǎo)致肝腎、呼吸衰竭，死亡率極高，其他三種誤食后均表現(xiàn)為胃腸型中毒癥狀。冠狀環(huán)柄菇L.cristata（Bolton）P.Kumm.重金屬含量高，對人體有害[15]，所以不宜食用。該結(jié)果為有毒環(huán)柄菇的識別提供方便，為菌物資源的鑒定及安全開發(fā)提供依據(jù)。