荊州博物館文物展陳環(huán)境空氣中真菌數(shù)量及其群落特征

雷 瓊，肖 璇，馬立安，章 俊，詹亞斌，方 芳， 邱祖明

(1． 湖北省荊州文物保護(hù)中心，湖北荊州 434020； 2． 荊州博物館，湖北荊州 434020；3． 長(zhǎng)江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北荊州 434025； 4． 廣東省微生物研究所，廣東廣州 510070)

0 引 言

存在于空氣中的微生物種類(lèi)很多，僅真菌就有40 000余種[1]。博物館展陳環(huán)境作為相對(duì)密閉空間的總體[2]，既有陳列的可移動(dòng)文物，又有前來(lái)參觀的游客，若發(fā)生空氣微生物嚴(yán)重污染，不僅會(huì)導(dǎo)致有機(jī)質(zhì)文物的霉變，還會(huì)對(duì)游客的健康構(gòu)成威脅[3]，因此很有必要對(duì)博物館內(nèi)空氣微生物展開(kāi)研究，國(guó)內(nèi)外博物館均開(kāi)展了這項(xiàng)工作[4-8]。目前對(duì)博物館環(huán)境中空氣微生物研究多集中在室內(nèi)和室外空氣微生物的對(duì)比，以及展廳內(nèi)微生物動(dòng)態(tài)變化方面，且側(cè)重分析這些微生物對(duì)人體健康的影響，對(duì)小環(huán)境如展柜內(nèi)空氣微生物，以及這些微生物對(duì)文物的潛在危害研究和分析較少。

為調(diào)查荊州博物館文物展陳環(huán)境中潛在的微生物病害，研究空氣中真菌數(shù)量及分布特征，采用自然沉降法對(duì)展柜和展廳空氣中真菌進(jìn)行采樣，統(tǒng)計(jì)真菌數(shù)量，進(jìn)行形態(tài)和分子鑒定，并分析真菌群落分布特征。該研究可為館藏文物的預(yù)防性保護(hù)提供科學(xué)依據(jù)，對(duì)了解館內(nèi)空氣污染現(xiàn)狀，保護(hù)游客健康和文物安全具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1．1 調(diào)查對(duì)象

以荊州博物館3處展廳及其中的展柜為調(diào)查對(duì)象，對(duì)文物陳列展柜、展柜所在的展廳進(jìn)行空氣微生物采樣，分別為青銅器展廳、青銅器展柜；木漆器展廳、木漆器展柜；紡織品展廳、紡織品展柜，具體信息如表1所示，展廳和展柜全年溫度，相對(duì)濕度(RH)如圖1所示。由圖1可知，除紡織品展柜相對(duì)濕度相對(duì)穩(wěn)定之外，其他展廳和展柜全年相對(duì)濕度起伏不定，大部分在50%以上，木漆器展廳和展柜相對(duì)濕度不低于60%。各展廳和展柜全年溫度變化趨于一致，7月份溫度最高，在30 ℃左右。

表1 采樣展柜、展廳詳細(xì)信息

注： 表中溫度、相對(duì)濕度值為采樣時(shí)所測(cè)值。

1．2 空氣真菌采樣、培養(yǎng)及計(jì)數(shù)

參照醫(yī)院消毒衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)[9]和館藏文物保存環(huán)境質(zhì)量檢測(cè)技術(shù)規(guī)范[10]，于2014年7月14日博物館閉館日，選取最具代表性的3個(gè)展廳展柜為采樣點(diǎn)，每個(gè)采樣點(diǎn)依據(jù)空間大小依次放置4～6個(gè)直徑9 cm的馬丁-孟加拉紅培養(yǎng)基平板。除陰性對(duì)照不開(kāi)蓋，其它培養(yǎng)皿暴露在空氣中10 min后，蓋上皿蓋，所有取樣過(guò)程在1 h內(nèi)完成。將平皿放入培養(yǎng)箱28 ℃倒置培養(yǎng)5 d，逐日觀察，于第5 d計(jì)數(shù)?？諝庵姓婢倲?shù)(單位CFU/m3)按以下公式進(jìn)行計(jì)算：m=N×5 000/(A×t)。其中m為空氣中真菌總數(shù)，單位為CFU/m3；N為平皿平均菌落數(shù)，單位為CFU；A為平皿面積，cm2；t為平皿的暴皿時(shí)間，單位為min。

1．3 菌種鑒定

1．3．1真菌形態(tài)鑒定 挑取馬丁-孟加拉紅培養(yǎng)基上所有單菌落，轉(zhuǎn)接至馬鈴薯培養(yǎng)基中進(jìn)行純化培養(yǎng)，依據(jù)展陳位置進(jìn)行編號(hào)(青銅器展廳分離到的真菌編號(hào)為A開(kāi)頭，木器漆展廳為B，紡織品展廳為C，青銅器展柜為Q，木漆器展柜為M，紡織品展柜為F)。通過(guò)觀察菌落形態(tài)，結(jié)合分生孢子、菌絲等顯微形態(tài)特征，對(duì)照工具書(shū)[11-12]將部分真菌鑒定到屬。不能鑒定到屬的真菌，將形態(tài)特征相同的歸為一類(lèi)，每一類(lèi)選取一個(gè)代表菌株進(jìn)行下一步分子鑒定。

1．3．2真菌分子鑒定 采用微波裂解法[13]，得到真菌DNA模板，以真菌ITS區(qū)域通用引物ITS5(5’-GGAAGGTAAAAGTCAAGG-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)[14-15]進(jìn)行PCR擴(kuò)增。使用生工快速擴(kuò)增試劑盒，反應(yīng)體系為50 μL，PCR反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性1 min，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃終延伸10 min。PCR擴(kuò)增完畢，產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，PCR產(chǎn)物直接送上海生工進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序返回的真菌ITS序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)上進(jìn)行同源性搜索比對(duì)，進(jìn)行序列嵌合體檢測(cè)，將獲得的序列上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得序列號(hào)。然后利用MEGA5軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，獲得基于ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié) 果

2．1 展柜、展廳空氣中真菌數(shù)量

展柜、展廳中空氣中真菌數(shù)量見(jiàn)圖2，真菌數(shù)量在12～74 CFU/m3之間，從高到低依次為木漆器展廳(74 CFU/m3)、青銅器展廳(38 CFU/m3)、青銅器展柜(21 CFU/m3)、紡織品展廳(17 CFU/m3)、紡織品展柜(16 CFU/m3)、木漆器展柜(12 CFU/m3)。青銅器和木漆器的展柜中真菌數(shù)量顯著低于展廳(P<0.05)；紡織品中展柜和展廳中真菌數(shù)量無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

2．2 真菌鑒定結(jié)果

2．2．1形態(tài)鑒定 通過(guò)觀察土豆培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)，并用石碳酸棉蘭染色鏡檢，初步鑒定出部分枝孢屬、青霉屬、鏈格孢屬等真菌，如圖3所示。其中，鐮刀菌在馬丁-孟加拉紅培養(yǎng)基生長(zhǎng)5 d，其他菌在土豆培養(yǎng)基生長(zhǎng)12 d；曲霉在1 000倍油鏡下觀察，其他菌400倍。

2．2．2分子鑒定結(jié)果分析 將各菌株ITS序列在GenBank中進(jìn)行同源性比對(duì)，結(jié)果如表2所示。

除了菌株B4-14，其余菌株與最相近菌株同源性大于99%(表2)，且在系統(tǒng)發(fā)育中處于同一分支(圖4)，由此可確定菌株C6-1、B1-3、B4-11均為枝孢霉屬，B5-9為Valsaria，B5-2為青霉屬，A2-5為鐮刀菌，B4-16為Hansfordia，B4-5為彎孢聚殼屬，B4-14與彎孢聚殼屬菌株同源性為97%，結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育地位，推斷其為彎孢聚殼屬中的疑似新種，值得進(jìn)一步做鑒定，以上菌屬均劃入半知菌類(lèi)(FungiImperfecti)。同樣可知，B4-10、A4-4為小球腔菌屬，B3-3、B3-5為暗球腔菌屬，B5-6為Phaeosphaeriopsis，以上3屬屬于子囊菌綱(Ascomycetes)。此外，A4-1被鑒定為鬼傘屬，B2-3亦為鬼傘屬，C5-1為木耳屬，B1-1為Agaricaceaesp．，以上4屬為擔(dān)子菌綱(Basidiomycetes)。

2．3 真菌種群分布

如表3所示，共分離到105株真菌，除了6株菌鑒定失敗，其他99株真菌分別屬于19個(gè)屬。木漆器展廳空氣中分離出14屬，青銅器展廳空氣中分離出8屬，紡織品展廳空氣中分離出6屬，紡織品展柜空氣中分離出4屬，青銅器展柜空氣中分離出6屬，木漆器展柜空氣中分離出6屬。枝孢屬和小球腔菌屬分別占真菌總數(shù)的24.76%、22.86%，為優(yōu)勢(shì)真菌。在展柜和展廳中均發(fā)現(xiàn)有枝孢屬存在，小球腔菌屬主要存在于展廳環(huán)境中。在展柜中分離到卵形孢霉屬和鏈格胞屬，在青銅器展廳和展柜中分離到酵母菌，鬼傘屬、木耳屬等擔(dān)子菌綱真菌只分布于展廳中。

菌株編號(hào)分離菌序列編號(hào)參考序列編號(hào)參考序列分離源種屬相似性指數(shù)/%B1-3MG732979KX527874Cladosporium cladosporioides voucher BJ1-10芽枝狀枝孢霉(Cladosporium cladosporioides)99C6-1MG732980KX349488Cladosporium tenuissimum isolate Fck-3-45極細(xì)枝孢霉(Cladosporium tenuissimum)99B4-11MG732981KY498319Cladosporium sp. strain KACC 48134枝孢屬(Cladosporium sp.)99B3-3MG732982KT224848Phaeosphaeria papayae isolate S70Phaeosphaeria papayae99B3-5MG732983KF143800Phaeosphaeria sp. XJ25暗球腔菌屬(Phaeosphaeria sp.)99B4-5MG732984KP743030Eutypella sp. ZZ2彎孢聚殼屬(Eutypella sp.)100B4-14MG732985KU320618Eutypella sp. 416彎孢聚殼屬(Eutypella sp.)97B5-2MG732986KT189507Penicillium sp. H11-2青霉屬(Penicillium sp.)99A2-5MG732987KU847854Fusarium graminearum isolate 110鐮刀菌(Fusarium)99B5-6MG732988KX527871Phaeosphaeriopsis musae voucher BJ1-6Phaeosphaeriopsis99B5-9MG732989NR_138403Valsaria insitiva CBS 127882Valsaria99A4-1MG732990FJ478115Coprinopsis atramentaria strain xsd08072鬼傘屬(Coprinopsis)99B4-16MG732991KP772241Hansfordia pulvinata voucher HMQAU130012Hansfordia99B1-1MG732992KM268691Agaricaceae sp. GWY1(1)Agaricaceae sp.99C5-1MG732993FJ617293Auricularia polytricha voucher Dai10451木耳屬(Auricularia)99A4-4MG732994KX611651Leptosphaeria sp. isolate DOF-28小球腔菌屬(Leptosphaeria sp.)99B4-10MG732995KJ531966Leptosphaeria sp. LCC1-2小球腔菌屬(Leptosphaeria sp.)99B2-3MG732996KJ028784Coprinellus xanthothrix isolate NEFU33鬼傘屬(Coprinellus)99

真菌屬名分離真菌菌株數(shù)量/CFU青銅器展柜青銅器展廳木漆器展柜木漆器展廳紡織品展柜紡織品展廳總計(jì)百分比/%枝孢霉屬24210442624.76小球腔菌屬07114022422.86鬼傘屬(Coprinellus)05030198.57彎孢聚殼屬00040376.67酵母菌(Saccharomyces)23000054.76

(續(xù)表3)

注： 菌株數(shù)量為采用自然沉降法在培養(yǎng)基上形成的CFU數(shù)量。

除未知真菌外，其他真菌按其所屬綱類(lèi)被分為4類(lèi)，分別為半知菌類(lèi)(FungiImperfecti)、子囊菌綱(Ascomycetes)、擔(dān)子菌綱(Basidiomycetes)及藻狀菌綱(Phycomycetes)，各占真菌總數(shù)的50.48%、30.48%、12.38%及0.95%。

3 討 論

雖然紡織品的中展柜和展廳中真菌數(shù)量無(wú)顯著性差異，但是青銅器和木漆器的展柜中真菌數(shù)量顯著低于展廳，總體而言，展廳空氣中分離到的真菌數(shù)量整體多于展柜，木漆器展廳空氣中分離到的真菌數(shù)量和種類(lèi)最多，可能與其所處位置、空氣溫度和濕度以及人流量有關(guān)系[16]。木漆器展廳位于一樓，且離樓房出口較近，樓外又有綠水環(huán)繞，導(dǎo)致展廳內(nèi)濕度偏高，霉菌生長(zhǎng)的最佳條件為溫度22～32 ℃，相對(duì)濕度90%～100%[17]，較高的相對(duì)濕度能夠增加空氣細(xì)菌和真菌的水平[18]。紡織品展柜和展廳中霉菌較少，除了溫濕度的原因外，還可能與其入口放置的鼓風(fēng)裝置有關(guān)，可在一定程度上阻止室外的空氣微生物進(jìn)入展廳。展柜相對(duì)于展廳，是一個(gè)更加密閉獨(dú)立的空間，人流量對(duì)其影響較小，且溫濕度變化相對(duì)較小，這些可能是展柜內(nèi)真菌數(shù)量相對(duì)較少的原因。據(jù)研究，展柜特有菌卵形孢霉屬和鏈格孢屬，主要對(duì)植物產(chǎn)生侵害，多以植物內(nèi)生菌的形式存在于植物組織內(nèi)部[19]，可能會(huì)對(duì)木質(zhì)文物有危害作用。在青銅器展廳和展柜中分離到酵母菌，可能與青銅器文物有關(guān)，具體原因，還有待進(jìn)一步研究。

從博物館館藏環(huán)境空氣中分離到的真菌中，空氣真菌優(yōu)勢(shì)菌群為半知菌類(lèi)，其次是子囊菌綱，國(guó)外研究人員從西伯利亞南部大氣環(huán)境中主要分離到子囊菌、半知菌、接合菌等真菌[20]，與本研究結(jié)果基本相似。從屬水平來(lái)看，優(yōu)勢(shì)真菌依次為枝孢屬和小球腔菌屬。據(jù)報(bào)道，國(guó)內(nèi)外空氣中優(yōu)勢(shì)真菌里經(jīng)常出現(xiàn)枝孢屬。馬燕天等研究敦煌莫高窟空氣中微生物的種群動(dòng)態(tài)和群落，發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)真菌為枝孢屬，無(wú)孢菌，青霉屬等。方治國(guó)等[21]對(duì)北京市夏季空氣微生物的群落結(jié)構(gòu)和分布特征開(kāi)展研究，發(fā)現(xiàn)的優(yōu)勢(shì)真菌中就有枝孢屬，為總數(shù)的47.2%，占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。符春蘭等[22]對(duì)國(guó)內(nèi)4座大城市空氣真菌的研究表明，優(yōu)勢(shì)菌屬為枝孢屬、鏈格孢屬等。此外，國(guó)外研究[23-24]也將空氣中的優(yōu)勢(shì)菌屬歸于枝孢菌屬、鏈格孢屬等。小球腔菌屬極少出現(xiàn)在空氣中優(yōu)勢(shì)菌屬中。

據(jù)報(bào)道，枝孢屬真菌中存在條件致病菌，在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中可能會(huì)產(chǎn)生潛在毒素枝孢霉素，危害人體健康[25]。馮清平等從莫高窟洞窟內(nèi)分離得到枝孢霉和黑曲霉，這兩種真菌在一定程度上加速了壁畫(huà)紅色顏料變色和膠結(jié)材料的老化進(jìn)程。枝孢霉可以分解壁畫(huà)顏料中的骨膠，并利用其生長(zhǎng)和形成草酸等代謝產(chǎn)物，促進(jìn)了鉛丹向鉛白的轉(zhuǎn)變[26]。小球腔菌屬一般在沼澤草地中比較常見(jiàn)[27]，在中國(guó)報(bào)道的小球腔菌屬以病原菌為主[28]。另外，分離出的鬼傘屬、木耳屬等擔(dān)子菌綱真菌，雖然只發(fā)現(xiàn)于展廳中，但若發(fā)生大范圍污染，對(duì)木質(zhì)文物危害性比較大。據(jù)報(bào)道[29]，西安市高陵縣院張村明代墓考古發(fā)掘現(xiàn)場(chǎng)出土木質(zhì)棺槨表面大量生長(zhǎng)的白色病害微生物，經(jīng)鑒定為擔(dān)子菌綱真菌。

枝孢屬，小球腔菌屬及擔(dān)子菌綱真菌對(duì)文物和人體健康具有一定危害。根據(jù)全年溫度和相對(duì)濕度曲線，推測(cè)4～9月份可能是誘發(fā)真菌萌發(fā)的時(shí)間段。經(jīng)常開(kāi)窗通風(fēng)可有效控制室內(nèi)微生物污染，除塵、凈化及紫外線照射等物理消毒法也可降低空氣微生物污染程度。此外，化學(xué)消毒法和中藥消毒法在空氣消毒領(lǐng)域也得到一定的應(yīng)用[30]。

4 結(jié) 論

通過(guò)對(duì)荊州博物館文物展陳環(huán)境展廳和展柜空氣中真菌的數(shù)量和種類(lèi)進(jìn)行了初步調(diào)查，對(duì)展廳和展柜空氣中真菌的數(shù)量和種類(lèi)差異進(jìn)行了比較分析，發(fā)現(xiàn)展廳空氣中的真菌數(shù)量和種類(lèi)普遍多于展柜，木漆器展廳真菌數(shù)量最高，種類(lèi)最豐富。枝孢屬和小球腔菌屬為展陳環(huán)境中優(yōu)勢(shì)菌屬，在6月和7月溫濕度適宜的條件下，容易大規(guī)模生長(zhǎng)，對(duì)文物或人體具有一定危害，應(yīng)采取空氣消毒措施。本研究只取一次樣，擬對(duì)荊州博物館文物展陳環(huán)境中的真菌進(jìn)行初步調(diào)查分析，研究?jī)?nèi)容不夠深入。在以后的工作中，將不間斷取樣，分析不同時(shí)段真菌的種屬和數(shù)量的差異，對(duì)真菌的種屬和數(shù)量進(jìn)行動(dòng)態(tài)研究，密切關(guān)注空氣微生物污染狀況?？偠灾撗芯拷Y(jié)果對(duì)了解館內(nèi)空氣污染現(xiàn)狀，保護(hù)游客健康和文物安全具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。