CSN4基因干擾對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖和凋亡的影響

余同露，蔡棟梁，朱根鳳，葉曉娟，閔太善，陳紅巖，盧大儒，陳浩明

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基因干擾對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖和凋亡的影響

余同露1,2，蔡棟梁1,2，朱根鳳1,2，葉曉娟1,2，閔太善1,2，陳紅巖1,2，盧大儒1,2，陳浩明1,2

1. 復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200438 2. 復(fù)旦大學(xué)現(xiàn)代人類學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200438

乳腺癌目前是危害女性常見的惡性腫瘤，研究發(fā)現(xiàn)COP9復(fù)合體中的各個(gè)亞基與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，且CSN4亞基對(duì)整個(gè)復(fù)合體具有很重要的調(diào)節(jié)作用。為探討基因在乳腺癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能及其分子作用機(jī)制，本研究首先在乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231中，成功建立了慢病毒介導(dǎo)的基因的干擾表達(dá)體系，并通過細(xì)胞表型實(shí)驗(yàn)、CCK8實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)證實(shí)基因表達(dá)的干擾能顯著抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的增殖速率和克隆形成能力。流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果表明，干擾的表達(dá)能顯著增加Sub G1期乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞比例；凋亡檢測(cè)結(jié)果表明，干擾的表達(dá)能顯著增加早期凋亡和晚期凋亡細(xì)胞的比例，這證明干擾的表達(dá)能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡。最后，通過Western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)能調(diào)控CDK6和Caspase3蛋白的表達(dá)，激活Caspase3切割PARP，揭示可調(diào)控CDK6和Caspase3的表達(dá)從而影響乳腺癌細(xì)胞的增殖和凋亡。本研究結(jié)果進(jìn)一步加深了人們對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡和細(xì)胞生長(zhǎng)的分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)，同時(shí)也進(jìn)一步揭示了CSN4在腫瘤生物學(xué)中的作用和機(jī)制。

乳腺癌；；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡；CDK6；Caspase3

乳腺癌是危害女性健康最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率逐年上升。據(jù)GLOBOCAN (global can-cer observatory)的數(shù)據(jù)顯示，乳腺癌高居中國(guó)女性癌癥發(fā)病率首位，發(fā)病率為21.6/10萬[1]。2015年，中國(guó)新發(fā)乳腺癌高達(dá)27萬例，嚴(yán)重威脅女性健康[2]。乳腺癌細(xì)胞的惡性增殖和轉(zhuǎn)移是患者死亡的主要原因，尤其是乳腺癌中惡性程度最高的三陰性乳腺癌[3]，具有高轉(zhuǎn)移性、強(qiáng)侵襲性和致死性強(qiáng)等特點(diǎn)，因此，揭示乳腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制對(duì)于科學(xué)研究和臨床治療均具有十分重要的意義。

基因編碼COP9信號(hào)復(fù)合體(COP9 signa-losome complex, CSN)第4亞基。COP9信號(hào)復(fù)合體在真核生物中高度保守，對(duì)于細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)和生存都具有重要作用[4~8]。COP9復(fù)合體參與蛋白質(zhì)泛素化過程，對(duì)泛素降解的蛋白質(zhì)如p27、p53、Mdm2、Smad7和Skp2等具有一定的調(diào)控作用[9~16]，同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)COP9復(fù)合體中的各個(gè)亞基的表達(dá)與很多惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[17~24]。

基因曾被發(fā)現(xiàn)在前列腺癌細(xì)胞中，干擾的表達(dá)能夠抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖[25]。亞基對(duì)整個(gè)復(fù)合體的穩(wěn)定性以及復(fù)合體的其它亞基都具有重要的調(diào)節(jié)作用。本實(shí)驗(yàn)室前期通過TCGA數(shù)據(jù)庫分析基因在腫瘤和正常組織樣本的mRNA存在差異。在本實(shí)驗(yàn)室的前期研究工作中初步探索了在三陰性乳腺癌TNBC (triple- negative breast cancer)中的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，且大量文獻(xiàn)也揭示確實(shí)影響乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。文獻(xiàn)中報(bào)道，在CSN復(fù)合體的結(jié)構(gòu)中，CSN復(fù)合物在泛素化途徑中需要連接cullin-RING E3連接酶發(fā)揮作用，而和在泛素化途徑中共同發(fā)揮去NEDD化作用是需要協(xié)同作用。因此，為進(jìn)一步探討是否在三陰性乳腺癌中發(fā)揮重要作用，本研究在高轉(zhuǎn)移性的三陰性乳腺癌細(xì)胞系MDA- MB-231中建立穩(wěn)定干擾的表達(dá)體系，通過慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)(RNA interference，RNAi)，探討了在三陰性乳腺癌細(xì)胞中抑制表達(dá)后，對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響，初步揭示參與調(diào)控CDK6和Caspase3的分子機(jī)制，為進(jìn)一步制定基因的臨床治療方案提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和293T細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存；慢病毒包裝相關(guān)質(zhì)粒VSVG、PLP1和PLP2為本實(shí)驗(yàn)室保存；Trizol和Lipofectamin2000試劑購自Invitrogen公司(美國(guó))；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和定量PCR試劑購自南京諾維贊生物科技有限公司；HRP標(biāo)記的Western blot二抗均購自上海碧云天公司；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒Annexin V-PE/7- AAD購自美國(guó)BD公司；抗體購自美國(guó)Novus公司，Caspase3、β-actin和CDK6抗體均購自美國(guó)Cell signaling公司；細(xì)胞培養(yǎng)試劑均購自Gibco品牌賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

MDA-MB-231和293T細(xì)胞培養(yǎng)使用DMEM高糖培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中含有10%胎牛血清(FBS)和1%的青霉素-鏈霉素雙抗，37℃置于CO2培養(yǎng)箱。

1.3 慢病毒包裝

干擾表達(dá)的慢病毒shRNA (對(duì)照)，sh1和sh3 (干擾組)慢病毒包裝時(shí)，在10 cm培養(yǎng)皿的生長(zhǎng)狀態(tài)較好的293T細(xì)胞中，加入40 μL的Lipofectin2000轉(zhuǎn)染試劑、7.5 μg表達(dá)shRNA的慢病毒載體質(zhì)粒以及3種輔助質(zhì)粒VSVG、PLP1和PLP2各2.5?μg，12 h后換新鮮培養(yǎng)基，再培養(yǎng)48 h后收集病毒上清，2 000 r/min離心10 min，上清用0.45 μm濾器過濾分裝保存在-80℃冰箱；感染時(shí)，取適量慢病毒加入到懸浮的乳腺癌細(xì)胞中，并按照(1∶1000)體積加入10 mg/mL polybrene。

干擾基因表達(dá)的慢病毒shRNA序列：sh1：5￠-GCCCAAGTGTTGGTGGGAATTT-3￠；sh3：5￠-GCTCTCTTACAAGACAATAGT-3￠。對(duì)照組慢病毒shRNA序列：5￠-cgtacgcggaata-cttcga-3￠。

1.4 實(shí)時(shí)定量PCR

收集慢病毒感染的細(xì)胞，棄去上層培養(yǎng)基后用PBS洗滌3次，加入TRIzol裂解5 min，加入三氯甲烷震蕩15 s后靜置2 min，4℃離心后取上清，再加入等量異丙醇充分混勻后放置-20℃靜置10 min，棄上清后留下沉淀并用75%乙醇洗滌2次，4℃離心棄上清后晾干10~20 min，加入適量DEPC水溶解并測(cè)完濃度后保存于?80℃冰箱。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，實(shí)時(shí)熒光定量采用SYBR Green I熒光染料檢測(cè)，在ABI公司7900HT的定量PCR儀檢測(cè)。GAPDH基因作為內(nèi)參，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3組重復(fù)；上游引物：5￠-GTAAGCCTCTGCCTGGACTG-3￠，下游引物：5￠-AGGAGCAGGTTGCTTCCATA- 3￠。根據(jù)樣本的Ct值計(jì)算2-ΔΔCt值，計(jì)算每個(gè)腫瘤樣品中的目的基因?qū)τ谡悠返谋稊?shù)差異。首先計(jì)算出每個(gè)樣品每個(gè)基因的Ct平均值，然后計(jì)算ΔCt = Ct (目標(biāo)基因) ? Ct(管家基因)。本實(shí)驗(yàn)采取作為管家基因，首先計(jì)算每個(gè)樣品中目的基因的相對(duì)Ct值，然后用公式ΔΔCt=ΔCt(實(shí)驗(yàn)樣本) ? ΔCt(對(duì)照樣本)。重復(fù)3次試驗(yàn)計(jì)算值。

1.5 Western blot

收集慢病毒感染后的細(xì)胞，加入RIPA裂解液冰上裂解1 h，4℃、12 000 r/min離心15 min。吸上清轉(zhuǎn)移入新的Eppendorf管，測(cè)定蛋白濃度，然后加入適量的蛋白上樣緩沖液混勻后煮沸5~10 min，上樣30~100 μg的總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，恒流轉(zhuǎn)膜2 h，轉(zhuǎn)膜條件：250 V，0.3 A。封閉1 h后一抗二抗孵育，加入Thermo顯色劑，在G-BOX顯影儀曝光顯影。

1.6 CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

將慢病毒感染后的各組細(xì)胞，計(jì)數(shù)細(xì)胞后調(diào)整細(xì)胞密度，按每孔1000個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，每組6個(gè)重復(fù)，細(xì)胞培養(yǎng)一定時(shí)間后CCK-8處理，利用美國(guó)Bio-Rad公司酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)值。

1.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期

收集慢病毒感染后的狀態(tài)較好的細(xì)胞，1 000 r/min離心3 min收集細(xì)胞，PBS洗滌2次。每組細(xì)胞加入500 μL PBS，包含10 μg/mL碘化丙啶(PI) 5 μL，0.2% Tritonx-100 75 μL和1 μg/mL RNase A的染色液，室溫避光染色15 min后檢測(cè)細(xì)胞Sub G1期，通過DNA含量分析法分析結(jié)果。

1.8 克隆形成實(shí)驗(yàn)

將慢病毒感染后的細(xì)胞計(jì)數(shù)后，按同等數(shù)目1000個(gè)細(xì)胞每孔傳代到六孔板，7~15 d左右隨時(shí)觀察。待細(xì)胞長(zhǎng)成肉眼可見的細(xì)胞集落，開始處理細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞2次，再用甲醇容易固定細(xì)胞20 min，PBS洗凈，加上Gimasa染色液染色30 min。然后統(tǒng)計(jì)集落數(shù)。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

本研究中數(shù)值用“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上，組間通過SPSS17.0軟件進(jìn)行檢驗(yàn)，用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法檢測(cè)差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 慢病毒介導(dǎo)的CSN4基因shRNA穩(wěn)定干擾體系的構(gòu)建

首先，將基因的shRNA干擾慢病毒(sh1和sh3)和對(duì)照慢病毒(shLuc)分別感染MDA-MB-231細(xì)胞，96?h后用熒光顯微鏡觀察慢病毒感染效率。然后，分別提取感染后的細(xì)胞總RNA和總蛋白質(zhì)，通過實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的mRNA和蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果表明，根據(jù)可見光視野和熒光視野對(duì)比，對(duì)照組和干擾組慢病毒感染乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231，感染效率達(dá)到90%以上，表明感染效率高(圖1A)；實(shí)時(shí)定量PCR分析結(jié)果顯示，相比較對(duì)照組shLuc，干擾后的實(shí)驗(yàn)組的mRNA表達(dá)量顯著低于用shLuc對(duì)照慢病毒感染的乳腺癌細(xì)胞，檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析差異極顯著，即<0.001 (圖1B)。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，干擾組的蛋白表達(dá)翻譯水平顯著低于對(duì)照組慢病毒感染的乳腺癌細(xì)胞(圖1C)。上述研究結(jié)果表明，慢病毒介導(dǎo)的shRNA干擾能有效抑制基因的mRNA 和蛋白水平的表達(dá)，本研究成功構(gòu)建了乳腺癌細(xì)胞 MDA-MB-231中的表達(dá)干擾系統(tǒng)。

2.2 CSN4表達(dá)干擾對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響

使用對(duì)照組慢病毒和干擾組慢病毒分別感染MDA-MB-231細(xì)胞，確認(rèn)感染效率后，使用CCK-8細(xì)胞生長(zhǎng)速率試劑盒檢測(cè)對(duì)照組和干擾組的細(xì)胞增殖速率。結(jié)果顯示，在MDA-MB- 231乳腺癌細(xì)胞中，相比較對(duì)照組，干擾組的生長(zhǎng)速率均顯著低于對(duì)照shLuc。統(tǒng)計(jì)分析表明，干擾組和對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(< 0.001) (圖2)。這表明MDA-MB-231細(xì)胞中基因的表達(dá)干擾使得細(xì)胞的增殖能力發(fā)生了顯著的下降，即基因?qū)τ贛DA-MB-231的細(xì)胞增殖能力具有重要作用。

2.3 CSN4表達(dá)干擾對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞克隆形成能力的影響

為進(jìn)一步檢測(cè)對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖能力的影響，本研究檢測(cè)了干擾后對(duì)乳腺癌細(xì)胞克隆形成能力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，基因干擾實(shí)驗(yàn)組的克隆細(xì)胞數(shù)相比對(duì)照組細(xì)胞數(shù)目少(圖3A)；重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)后的統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，差異具有極其顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3B)。這說明基因表達(dá)被干擾后能夠抑制了乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的細(xì)胞克隆形成能力，進(jìn)一步證明對(duì)于乳腺癌細(xì)胞的增殖起到很重要的作用。

圖1 MDA-MB-231細(xì)胞中慢病毒介導(dǎo)的CSN4干擾表達(dá)的檢測(cè)

A：慢病毒感染MDA-MB-231細(xì)胞熒光拍攝圖。左側(cè)為可見光視野圖片，右側(cè)為熒光視野圖片。B：乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231中干擾后的mRNA的相對(duì)表達(dá)水平變化。檢驗(yàn)方法分析差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，***表示<0.001，存在極顯著差異。C：MDA-MB-231細(xì)胞中慢病毒介導(dǎo)的干擾表達(dá)后的CSN4蛋白的表達(dá)水平。β-actin蛋白為內(nèi)參。

圖2 CCK8試劑盒檢測(cè)CSN4表達(dá)干擾對(duì)MDA-MB- 231細(xì)胞增殖的影響

各組細(xì)胞在CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中450 nm處的平均吸光值±SD (=6)，代表細(xì)胞相對(duì)的增殖能力。兩組干擾組(sh1和sh3)與對(duì)照組相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，***表示<0.001，存在極顯著差異。

2.4 CSN4表達(dá)干擾對(duì)于MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響

將干擾表達(dá)實(shí)驗(yàn)組和shLuc對(duì)照組的乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞進(jìn)行PI染色后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)Sub G1期比例，結(jié)果顯示，干擾表達(dá)實(shí)驗(yàn)組的Sub G1期細(xì)胞比例相較于shLuc對(duì)照組顯著增加，sh3組細(xì)胞相比對(duì)照組shLuc細(xì)胞上調(diào)近50%，統(tǒng)計(jì)分析表明兩者差異極顯著(<0.001)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4，A和B)。這表明在乳腺癌細(xì)胞中干擾的表達(dá)會(huì)明顯增加細(xì)胞凋亡的比例。

同時(shí)，將干擾實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組shLuc的乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行Annexin V-PE/7-AAD細(xì)胞凋亡試劑盒檢測(cè)。結(jié)果顯示，在MDA-MB-231細(xì)胞中，當(dāng)?shù)谋磉_(dá)被干擾后，與對(duì)照組相比，早期凋亡的細(xì)胞(右下象限)和晚期凋亡細(xì)胞(右上象限)都有顯著性增加(圖4C)，統(tǒng)計(jì)分析表明差異極其顯著(<0.001)。這進(jìn)一步證明基因在乳腺癌細(xì)胞凋亡過程中起到很關(guān)鍵的作用。

2.5 CSN4表達(dá)干擾對(duì)于MDA-MB-231細(xì)胞中CDK6和Caspase3蛋白表達(dá)的影響

上述研究結(jié)果表明，的干擾表達(dá)能夠影響乳腺癌細(xì)胞的增殖和凋亡。進(jìn)一步利用顯微鏡觀察到干擾表達(dá)的實(shí)驗(yàn)組乳腺癌細(xì)胞會(huì)發(fā)生大量死亡的現(xiàn)象，細(xì)胞狀態(tài)明顯變差，細(xì)胞皺縮，有漂浮現(xiàn)象；而對(duì)照組細(xì)胞狀態(tài)較好，細(xì)胞舒展，形態(tài)正常(圖5A)。

對(duì)照組慢病毒和干擾組慢病毒感染后，分別抽提慢病毒感染后乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的總蛋白，Western blot 檢測(cè)被干擾后的Caspase3、CDK6和PARP的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果表明，通過慢病毒感染干擾細(xì)胞內(nèi)CSN4蛋白的表達(dá)，即CSN4的蛋白表達(dá)水平下降后，同時(shí)檢測(cè)的CDK6蛋白表達(dá)的水平發(fā)生了顯著的下調(diào)(圖5B)。這說明干擾的表達(dá)能夠引起乳腺癌細(xì)胞關(guān)鍵性周期蛋白CDK6表達(dá)量發(fā)生變化。同時(shí)，干擾細(xì)胞內(nèi)CSN4蛋白表達(dá)水平后，Caspase3總蛋白的表達(dá)水平發(fā)生了下調(diào)，而被剪切的cleaved-caspase3蛋白量發(fā)生上調(diào)，被剪切的PARP蛋白出現(xiàn)上調(diào)，表明Caspase3被激活，作用于其底物PARP，將PARP剪切，剪切的PARP蛋白出現(xiàn)顯著上調(diào)。上述結(jié)果充分說明干擾CSN4蛋白的表達(dá)后，Caspase3的信號(hào)通路被激活。

圖3 CSN4表達(dá)干擾對(duì)于MDA-MB-231細(xì)胞克隆形成能力的影響

A：干擾組和對(duì)照組的慢病毒感染MDA-MB-231形成的細(xì)胞克隆對(duì)比。B：重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。***表示<0.001，存在極顯著差異。

A：干擾表達(dá)后MDA-MB-231細(xì)胞Sub G1期比例檢測(cè)。B：重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。檢驗(yàn)結(jié)果表明差異極顯著(***表示<0.001)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。C：Annexin V-PE/7-AAD 細(xì)胞凋亡試劑盒檢測(cè)結(jié)果。在每組4個(gè)象限中，左上：死亡細(xì)胞；右上：晚期凋亡細(xì)胞；左下：正常細(xì)胞；右下：早期凋亡細(xì)胞。

圖5 CSN4表達(dá)干擾對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞中CDK6和Caspase3蛋白表達(dá)的影響

A：慢病毒感染MDA-MB-231細(xì)胞熒光拍攝圖。左側(cè)為可見光視野，右側(cè)為熒光視野；B：Western blot檢測(cè)不同實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中CSN4、CDK6和Caspase3蛋白的表達(dá)水平。β-actin為內(nèi)參。

3 討論

三陰性乳腺癌的惡性程度較高，表現(xiàn)在侵襲性強(qiáng)、易遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移以及預(yù)后較差。采用內(nèi)分泌治療及靶向治療的方式均對(duì)其沒有明顯的效果。目前，化療是TNBC乳腺癌患者的主要治療手段，但是TNBC的治療后存活率依然很低。由于缺乏特定的分子靶點(diǎn)，TNBC的診斷和治療都受到極大的挑戰(zhàn)。因此亟需探索TNBC的腫瘤分子生物學(xué)機(jī)制，尋找有效生物分子靶點(diǎn)，為臨床診斷以及治療發(fā)揮作用。

目前的研究表明，作為COP9復(fù)合體中的一個(gè)亞基，對(duì)整個(gè)復(fù)合體的穩(wěn)定性以及復(fù)合體的其他亞基都具有重要的調(diào)節(jié)作用[26]。而且有報(bào)道稱基因能夠調(diào)控蛋白水平從而影響sGC1和p53的表達(dá)水平，并且能夠影響腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移[25]。根據(jù)COP9復(fù)合體的重要性，以及在COP9復(fù)合體的結(jié)構(gòu)，提示是COP9復(fù)合體的重要成員，但是基因在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中的功能與分子機(jī)制研究較少，尚沒有文獻(xiàn)報(bào)道基因在乳腺癌細(xì)胞中的功能研究以及對(duì)細(xì)胞凋亡方面的調(diào)控的具體機(jī)制。

為探索的表達(dá)在乳腺癌細(xì)胞的主要生物學(xué)功能，本研究利用慢病毒感染的方法在乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231構(gòu)建了穩(wěn)定的干擾表達(dá)的體系。通過CCK-8和克隆形成實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示干擾基因可以抑制乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖和克隆形成能力。通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)和凋亡試劑盒檢測(cè)表明干擾的表達(dá)能夠顯著增加細(xì)胞凋亡的比例，可誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入凋亡。研究結(jié)果為深入揭示在乳腺癌細(xì)胞中的分子機(jī)制打下了基礎(chǔ)，同時(shí)也具有一定的臨床應(yīng)用潛力。

本研究中，干擾基因可以抑制乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖和克隆形成能力，同時(shí)檢測(cè)出細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CDK6，干擾基因的表達(dá)能夠引起CDK6的蛋白表達(dá)水平下調(diào)，CDK6是細(xì)胞周期的重要調(diào)控因子，主要促進(jìn)細(xì)胞周期由G1期進(jìn)展到S期。細(xì)胞周期的失控是人類腫瘤發(fā)生的主要原因之一[27~29]，揭示干擾基因可能導(dǎo)致乳腺癌的細(xì)胞周期發(fā)生異常，從而導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)阻滯，甚至發(fā)生凋亡現(xiàn)象。

已有研究報(bào)道，COP9復(fù)合體主要是以Caspases依賴性形式影響細(xì)胞凋亡[30]。為進(jìn)一步探索基因是如何促進(jìn)細(xì)胞凋亡，通過Western blot檢測(cè)干擾基因后導(dǎo)致細(xì)胞的細(xì)胞凋亡基因Caspase3的前體蛋白總量表達(dá)下調(diào)，而被活化的cleaved- Caspase3的蛋白量明顯上調(diào)，繼而又同時(shí)檢測(cè)出被剪切的PARP的蛋白表達(dá)水平也上調(diào)，因此推測(cè)基因可能是直接或間接激活Caspase3的活性進(jìn)而引起乳腺癌細(xì)胞的凋亡。作為COP9復(fù)合體的一員，其對(duì)復(fù)合體的穩(wěn)定性調(diào)節(jié)起到很關(guān)鍵的作用。在COP9復(fù)合體中，尤其是，已經(jīng)有很多研究表明在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要的作用。在胚胎細(xì)胞中敲除可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖，上調(diào)p27、p53和細(xì)胞周期蛋白E[31]。除了外，COP9復(fù)合體的其他亞基也被報(bào)道與凋亡有關(guān)。有研究表明[32]，能夠被caspase8剪切，從而影響CSN復(fù)合物的完整性，繼而在凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)過程中影響CSN復(fù)合物的活性。在肺癌和肝癌細(xì)胞中，敲低能夠提高細(xì)胞凋亡水平[33,34]。CSN8在肝癌細(xì)胞中敲除后，同樣也會(huì)引起細(xì)胞發(fā)生大量凋亡現(xiàn)象，導(dǎo)致促凋亡因子Bax，抗凋亡因子Bcl-2和Bcl-xl發(fā)生異常表達(dá)[33]。而且還有研究顯示[34]，CSN1能夠在紫外線照射處理下誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。在K562細(xì)胞系中敲低或者，會(huì)導(dǎo)致不同的細(xì)胞模式死亡，分別是自噬或者細(xì)胞凋亡[35]。綜上所述，COP9復(fù)合物在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用。目前有可能是作為單體獨(dú)立發(fā)揮作用于腫瘤細(xì)胞從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，同時(shí)也有可能是與復(fù)合體其他亞基相互作用影響復(fù)合體的穩(wěn)定性，從而影響其他亞基的表達(dá)。但是至于是作為單體還是復(fù)合亞基發(fā)揮作用，目前尚不清楚，且相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道較少。因此，未來需要更進(jìn)一步的探索的分子機(jī)制。

綜上所述，本研究在乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中建立了穩(wěn)定干擾表達(dá)系統(tǒng)，探索了基因?qū)θ橄侔┘?xì)胞的增殖能力和凋亡造成的影響，以及進(jìn)一步研究了干擾的表達(dá)在乳腺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡的分子機(jī)制。但是，是如何通過Caspase3調(diào)控細(xì)胞具體凋亡的分子機(jī)制尚不清楚，仍有待進(jìn)一步的研究去揭示。

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Effects ofknockdown on proliferation and apoptosis of breast cancer MDA-MB-231 cells

Tonglu YU1,2, Dongliang Cai1,2, Genfeng Zhu1,2, Xiaojuan Ye1,2, Taishan Min1,2, Hongyan Chen1,2, Daru Lu1,2, Haoming Chen1,2

Breast cancer is one of the most common malignant tumors endangering women. It has been found that the subunits of the COP9 complex are closely related to the occurrence and development of malignant tumors, and the CSN4 subunit plays an important role in regulating the whole complex. In the breast cancer cell line MDA-MB-231, we successfully established a lentivirus-mediatedknockdown cell line. CCK8 cell proliferation assays and colony formation experiments confirmed thatknockdown significantly decreased the cellular proliferation rate. Cell cycle analysis showed thatknockdown increased sub-G1 population and induced apoptosis. In addition, Western blotting assays confirmed thatregulates the expression of CDK6 and Caspase3, suggesting thatmodulates the proliferation and apoptosis of breast cancer cells by regulating the expression of CDK6 and Caspase3 genes and thereby tumorigenesis.This study has deepened our understanding of the molecular mechanism of apoptosis and cell growth in breast cancers, and further revealed the role and mechanism of CSN4 in cancer biology.

breast cancer;; cell proliferation; cell apoptosis; CDK6; Caspase3

2018-12-11;

2019-02-18

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：81071739，81272385)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (Nos. 81071739, 81272385)]

余同露，碩士研究生；專業(yè)方向：生物工程。E-mail: 15210700122@fudan.edu.cn

陳浩明，博士研究生，副教授，研究方向：遺傳學(xué)。E-mail: hmchen@fudan.edu.cn

10.16288/j.yczz.18-278

2019/3/15 17:28:20

URI: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20190315.1728.002.html

(責(zé)任編委: 周鋼橋)