MEK抑制劑PD0325901顯著提高豬胎兒成纖維細(xì)胞ssODN介導(dǎo)的HDR效率

歐浩，李國(guó)玲，王豪強(qiáng)，黃廣燕，蔡更元,2，李紫聰，吳珍芳,2，張獻(xiàn)偉,2

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MEK抑制劑PD0325901顯著提高豬胎兒成纖維細(xì)胞ssODN介導(dǎo)的HDR效率

歐浩1，李國(guó)玲1，王豪強(qiáng)1，黃廣燕1，蔡更元1,2，李紫聰1，吳珍芳1,2，張獻(xiàn)偉1,2

1. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，國(guó)家生豬種業(yè)工程技術(shù)研究中心，廣州 510642 2. 溫氏食品集團(tuán)股份有限公司，新興 527400

基因組DNA發(fā)生雙鏈斷裂(double strand break, DSB)后主要通過(guò)同源定向修復(fù)(homologous-directed repair, HDR)和非同源末端連接(nonhomologous end joining, NHEJ)兩種途徑進(jìn)行修復(fù)，其中單鏈寡聚核苷酸(single-stranded oligodeoxyribonucleotide, ssODN)介導(dǎo)的同源定向修復(fù)是動(dòng)物基因組常用的基因組定點(diǎn)修飾技術(shù)，具有較大的科研和應(yīng)用價(jià)值。為提高豬基因組ssODN介導(dǎo)HDR效率，本研究以豬胎兒成纖維細(xì)胞(porcine fetal fibroblasts, PFFs)為研究對(duì)象，利用絲裂原活化的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(mitogen-activated extracellular signal-regulated kinase, MEK)抑制劑PD0325901培養(yǎng)細(xì)胞，研究其對(duì)HDR效率的影響及作用分子機(jī)理。結(jié)果顯示，PD0325901能顯著提高PFFs的G2期和S期細(xì)胞群百分比，減少G1期細(xì)胞群比率，促進(jìn)HDR修復(fù)因子的表達(dá)。在最適濃度250 nmol/L時(shí)，PD0325901使ssODN介導(dǎo)的GFP報(bào)告載體的修復(fù)效率提高了58.8%；同時(shí)使PFFs基因組位點(diǎn)和定點(diǎn)修飾效率分別提高了48.16%和17.64%。本研究表明，MEK抑制劑PD0325901能顯著提高豬基因組ssODN介導(dǎo)的同源定向修復(fù)效率，為高效制備定點(diǎn)基因修飾動(dòng)物模型提供了新思路。

MEK抑制劑；同源定向修復(fù)(HDR)；PD0325901；基因編輯

傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因技術(shù)是將目的基因隨機(jī)整合到基因組中并使之表達(dá)，無(wú)法控制轉(zhuǎn)基因的整合位點(diǎn)，且伴隨著效率低、表達(dá)穩(wěn)定性差等問(wèn)題，為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物品系和育種品系的建立帶來(lái)諸多不便。隨著鋅指核酸內(nèi)切酶(zinc-finger endonuclease, ZFN)[1]、類(lèi)轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease, TALEN)[2]、規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)[3]，以及結(jié)構(gòu)引導(dǎo)的核酸酶(structure- guided nuclease, SGN)[4]等新型基因編輯技術(shù)的出現(xiàn)，使動(dòng)物基因組DNA突變的效率和準(zhǔn)確性大大提高，推動(dòng)了基因定向修飾動(dòng)物的研究[5]。新型基因編輯技術(shù)可在基因組內(nèi)高效產(chǎn)生雙鏈斷裂(double strand break, DSB)，激活細(xì)胞中兩種DNA修復(fù)路徑——同源重組定向修復(fù)(homologous-directed repair, HDR)和非同源末端連接(nonhomologous end joining, NHEJ)。NHEJ無(wú)需同源修復(fù)模板，由NHEJ修復(fù)因子將DNA雙鏈斷裂的兩端強(qiáng)行拼接起來(lái)，容易造成基因片段的缺失、突變或外源基因的插入等，是基因敲除的有效途徑；HDR路徑需要同源DNA模板，修復(fù)過(guò)程產(chǎn)生錯(cuò)誤的概率較低，是定向突變和定點(diǎn)敲入(knock-in, KI)最為依賴(lài)的修復(fù)路徑[6]。盡管運(yùn)用新型基因編輯工具能夠使細(xì)胞DNA發(fā)生DSB的效率和準(zhǔn)確性極大的提高，但雙鏈DNA模板修復(fù)效率相對(duì)較低，只有0.5%~20%左右，利用HDR進(jìn)行高效的定點(diǎn)敲入具有較大的難度[3,7]。相比雙鏈DNA模板，單鏈寡聚核苷酸(single-stranded oligodeoxyribonucleotide, ssODN)作為同源修復(fù)模板具有更高的定向修復(fù)效率[8~10]。目前，ssODN介導(dǎo)的DNA修復(fù)的具體通路仍然不是很清楚，但該途徑也需要在DSB的斷裂末端進(jìn)行DNA末端剪切(DNA resection)，因此與其他HDR通路具有相同的起始途徑[11]。一般認(rèn)為ssODN介導(dǎo)的同源定向修復(fù)途徑也屬于HDR的一種，有研究表明通過(guò)小分子化合物調(diào)控HDR通路，可以促進(jìn)ssODN介導(dǎo)的定向修復(fù)效率。Maruyama等[12]使用小分子化合物Scr7(DNA連接酶Ⅳ抑制劑)將ssODN介導(dǎo)的定點(diǎn)整合效率提高了19倍；將Scr7直接注射至小鼠受精卵，使定點(diǎn)整合效率提高2倍。Ma等[13]使用VE-822 (Rad3相關(guān)激酶抑制劑)和AZD-7762 (檢查點(diǎn)激酶CHEK1的特異性抑制劑)將ssODN介導(dǎo)的定點(diǎn)整合效率提高3倍。雖然這些小分子化合物可顯著提高HDR效率[14]，但都主要集中在對(duì)人和小鼠的研究，對(duì)豬的研究鮮有報(bào)道[15,16]。由于大部分小分子化合物對(duì)細(xì)胞和胚胎存在一定的毒害作用，劑量過(guò)大會(huì)損傷細(xì)胞或基因編輯胚[17]，因此小分子化合物的使用劑量和新化合物的開(kāi)發(fā)還需要繼續(xù)優(yōu)化。

RAS-RAF-MEK-ERK信號(hào)通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、代謝、凋亡和細(xì)胞周期等眾多細(xì)胞生理過(guò)程的主干信號(hào)通路，絲裂原活化的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(mitogen-activated extracellular signal-regulated kinase, MEK)是該信號(hào)通路的重要組成部分[18]。PD0325901是一種選擇性的非ATP競(jìng)爭(zhēng)性MEK抑制劑，其與MEK結(jié)合會(huì)使MEK與ATP結(jié)合位點(diǎn)的構(gòu)象發(fā)生變化，從而抑制MEK的激活[19,20]。Lin等[21]研究顯示，使用PD0325901和CHIR99021 (GSK3β抑制劑)能消除ESC (embryonic stem cell)細(xì)胞系之間同源重組效率的差異，表明MEK信號(hào)通路可能參與細(xì)胞DNA的同源重組修復(fù)，但該信號(hào)通路是否參與體細(xì)胞同源重組目前還沒(méi)有研究報(bào)道。

豬的生理學(xué)、解剖學(xué)和遺傳學(xué)特征與人類(lèi)非常相似，是研究人類(lèi)疾病的重要?jiǎng)游锬Ｐ?。杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥(Duchenne muscular dystrophy, DMD)是一種X連鎖隱性遺傳病，由基因突變導(dǎo)致的人類(lèi)肌肉萎縮無(wú)力，喪失獨(dú)立行走能力為特點(diǎn)的疾病，提高豬該位點(diǎn)的定點(diǎn)編輯效率對(duì)制備人類(lèi)DMD疾病豬模型具有重要意義[22]。此外，基因位點(diǎn)是豬基因組上最常用的安全港位點(diǎn)，外源性的基因定點(diǎn)插入該位點(diǎn)能高效穩(wěn)定表達(dá)，同時(shí)不會(huì)影響其他內(nèi)源基因的表達(dá)，因此常用該位點(diǎn)來(lái)構(gòu)建基因編輯豬模型[23]。本研究以豬胎兒成纖維細(xì)胞(porcine fetal fibroblasts, PFFs)為研究對(duì)象，以和位點(diǎn)為靶點(diǎn)，利用MEK抑制劑PD0325901提高PFFs細(xì)胞中ssODN介導(dǎo)定向修復(fù)效率，為高效制備基因定向編輯豬模型提供重要參考信息。

1 材料與方法

1.1 材料

報(bào)告載體ssODN-mediated HDR reporter由本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建[24]。該報(bào)告載體中(enhanced green fluorescent protein)序列中間插入一個(gè)終止密碼子和一個(gè)HⅠ限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)，HⅠ用于線(xiàn)性化報(bào)告載體；該報(bào)告載體能與基因相應(yīng)的同源模板重組，使表達(dá)綠色熒光信號(hào)，而沒(méi)有發(fā)生同源定向修復(fù)的則被提前終止翻譯。Cas9/sgRNA共表達(dá)質(zhì)粒pX330 (Plasmid #42230)購(gòu)自美國(guó)Addgene公司；PFFs細(xì)胞由溫氏食品集團(tuán)股份有限公司提供；MEK抑制劑PD0325901購(gòu)自美國(guó)Selleck公司；引物和ssODN由深圳華大基因科技有限公司合成。

1.2 Cas9/sgRNA共表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

在CCtop CRISPR/Cas9網(wǎng)站(https://crispr.cos. uni-heidelberg.de/index.html)設(shè)計(jì)和基因的sgRNA[25,26]，序列見(jiàn)表1。sgRNA引物混勻后置于95℃水中自然冷卻至室溫，使其形成雙鏈DNA，克隆到pX330-U6-hSpCas9質(zhì)粒的Ⅰ位點(diǎn)上。

1.3 PD0325901配制及細(xì)胞培養(yǎng)

取適量PD0325901溶解于DMSO溶劑，添加至完全培養(yǎng)基(DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基+10%胎牛血清)分別配置成25 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L和250 nmol/L的溶液備用，復(fù)蘇后的PFF細(xì)胞培養(yǎng)至匯合度90% (10 cm板)，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 sgRNA序列信息

1.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性

復(fù)蘇后的PFF細(xì)胞培養(yǎng)至匯合度90% (10 cm板)，用0.25%胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞密度為103~105個(gè)/孔至96孔板，加入100 μL/孔不同濃度梯度的培養(yǎng)基溶液，每個(gè)梯度設(shè)置8個(gè)重復(fù)，培養(yǎng)48 h。加20 μL/孔MTT溶液(5 mg/mL，即0.5%MTT)，培養(yǎng)4 h后去掉孔內(nèi)培養(yǎng)液，加150 μL/孔二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490 nm處測(cè)量各孔的吸光值，對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期

復(fù)蘇后的PFF細(xì)胞培養(yǎng)至匯合度90% (10 cm板)，用0.25%胰酶消化，鋪至6孔板，加入2 mL/孔不同濃度梯度的培養(yǎng)基溶液，每個(gè)梯度設(shè)置3個(gè)重復(fù)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。消化細(xì)胞至1.5 mL離心管并去掉培養(yǎng)基，每管加500 μL預(yù)冷的70%乙醇(?20℃)，重懸，置于4℃固定過(guò)夜。隔天每管加500 μL碘化丙啶(propidium iodide, PI)染色液，充分振蕩，4℃避光孵育30 min，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，利用軟件Modifit 5.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.6 HDR和NHEJ相關(guān)基因表達(dá)水平的檢測(cè)

復(fù)蘇后的PFF細(xì)胞培養(yǎng)至匯合度90% (10 cm板)，用0.25%胰酶消化，鋪至6孔板，加入2 mL/孔不同濃度梯度的培養(yǎng)基溶液，每個(gè)梯度設(shè)置3個(gè)重復(fù)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。使用RNA抽提試劑盒抽提總RNA，反轉(zhuǎn)錄后對(duì)cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，分析NHEJ相關(guān)基因和HDR相關(guān)基因的表達(dá)水平。qRT-PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性15 s，60℃復(fù)性15 s，72℃延伸15 s，40個(gè)循環(huán)；溶解曲線(xiàn)95℃ 30 s；60℃ 30 s；95℃ 30 s。qRT-PCR引物見(jiàn)表2。

1.7 ssODN介導(dǎo)的HDR效率檢測(cè)

復(fù)蘇后的PFF細(xì)胞培養(yǎng)至匯合度90% (10 cm板)，用0.25%胰酶消化。參考美國(guó)Thermo fisher公司的Lipofectamine? LTX & Plus Reagent protocol說(shuō)明書(shū)，共轉(zhuǎn)染8 μg/孔線(xiàn)性化的ssODN-mediate HDR reporter (HⅠ酶切)和1 μg/孔ssODN (序列見(jiàn)表3)，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。鋪至6孔板培養(yǎng)24 h，加入2 mL/孔不同濃度梯度的培養(yǎng)基溶液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞熒光數(shù)的百分比。

表2 qRT-PCR引物序列信息

復(fù)蘇后的PFF細(xì)胞培養(yǎng)至匯合度90% (10 cm板)，用0.25%胰酶消化，分別共轉(zhuǎn)染8 μg/孔pX330--Cas9質(zhì)粒和1 μg/孔ssODN、8 μg/孔pX330--Cas9質(zhì)粒和1 μg/孔ssODN(序列見(jiàn)表3)，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。鋪至6孔板培養(yǎng)24 h，加入2 mL/孔不同濃度梯度的培養(yǎng)基溶液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。抽提細(xì)胞總DNA，PCR擴(kuò)增目的基因序列(引物序列見(jiàn)表 4)。回收純化后分別使用T7 EndoⅠ和dⅢ酶切，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分離，灰度掃描電泳條帶，根據(jù)公式：同源定向修復(fù)效率=dⅢ條帶灰度值/T7 EndoⅠ條帶灰度值，計(jì)算同源定向修復(fù)效率。同時(shí)按照中美泰和生物技術(shù)有限公司clone smarter TA克隆試劑盒(產(chǎn)品編號(hào)C5853)說(shuō)明書(shū)，對(duì)純化的DNA進(jìn)行TA克隆測(cè)序，計(jì)算同源定向修復(fù)效率。

表3 ssODN序列信息

表4 PCR引物序列

1.8 數(shù)據(jù)分析

采用 SPSS21 軟件進(jìn)行獨(dú)立樣品-test分析，分析每個(gè)處理組與對(duì)照組的差異，數(shù)據(jù)以 Mean ± SEM表示。*<0.05表示差異顯著，**<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 PD0325901對(duì)PFFs細(xì)胞活性和細(xì)胞周期分布的影響

PFF細(xì)胞經(jīng)25 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L和250 nmol/L濃度的PD0325901處理，使用MTT方法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性。結(jié)果顯示，25 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L濃度下細(xì)胞活性比對(duì)照組分別提高了17.2%、5%、10.12%，經(jīng)250 nmol/L PD0325901處理后，細(xì)胞活性比對(duì)照組下降了6.35%。低濃度(25 nmol/L)對(duì)細(xì)胞活性有促進(jìn)作用，而高濃度(250 nmol/L)對(duì)細(xì)胞活性具有一定的抑制作用，但差異不顯著(>0.05)，表明這4個(gè)濃度梯度的PD0325901對(duì)細(xì)胞活性沒(méi)有影響(圖1A)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞結(jié)果顯示，隨著PD0325901濃度增加，處于G2期和S期的PFFs細(xì)胞群顯著增加(<0.05)，處于G1期細(xì)胞群顯著減少(<0.05) (圖1B)，細(xì)胞表現(xiàn)一定程度的同步化。

2.2 PD0325901對(duì)DNA修復(fù)因子表達(dá)水平的影響

PFFs細(xì)胞經(jīng)不同濃度的PD0325901處理后，進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示，NHEJ相關(guān)修復(fù)基因(和)和HDR相關(guān)修復(fù)基因(、、和)表達(dá)量隨PD0325901添加劑量的升高呈現(xiàn)不規(guī)律變化(圖2)。在NHEJ通路中，25 nmol/L和250 nmol/L PD0325901對(duì)和表達(dá)具有上調(diào)作用；但對(duì)于基因表達(dá)，僅250 nmol/L劑量對(duì)其具有上調(diào)作用。在HDR通路中，不同濃度PD0325901對(duì)和表達(dá)都有上調(diào)作用，在250 nmol/L劑量下，和基因表達(dá)量提高近3倍(0.05)，但二者表達(dá)量與PD0325901添加量不存在劑量依賴(lài)效應(yīng)；然而對(duì)于和基因，100 nmol/L PD0325901對(duì)二者的表達(dá)呈現(xiàn)下調(diào)作用(<0.05)，而經(jīng)其他劑量處理后，和基因的表達(dá)量均表現(xiàn)不同程度的上調(diào)作用。

圖1 PD0325901對(duì)細(xì)胞活性和細(xì)胞周期的影響

A：不同濃度的PD0325901對(duì)細(xì)胞活性的影響；B：不同濃度的PD0325901對(duì)細(xì)胞周期的影響。*<0.05，表示差異顯著。

圖2 PD0325901對(duì)DNA修復(fù)因子表達(dá)水平的影響

和為NHEJ相關(guān)修復(fù)基因；和為HDR相關(guān)修復(fù)基因。

*<0.05，表示差異顯著，**<0.01表示差異極顯著。

2.3 PD0325901對(duì)ssODN介導(dǎo)的HDR效率的影響

ssODN介導(dǎo)的HDR報(bào)告載體和相應(yīng)ssODN共轉(zhuǎn)染至PFF細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，25 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L和250 nmol/L濃度PD0325901均能提高HDR效率，提高了32.3%~58.8% (0.05) (圖3，A~C)。X330--Cas9質(zhì)粒和相應(yīng)的ssODN共轉(zhuǎn)染至PFF細(xì)胞后，用dⅢ酶切方法評(píng)估基因位點(diǎn)編輯效率。結(jié)果顯示，25 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L和250 nmol/L濃度PD0325901均能提高HDR效率，達(dá)2.6%~37.1% (圖3，E和F)，并表現(xiàn)明顯的劑量依賴(lài)效應(yīng)。共轉(zhuǎn)染pX330--Cas9質(zhì)粒和相應(yīng)的ssODN，用dⅢ酶切方法評(píng)估基因編輯效率。結(jié)果顯示，25 nmol/L、50 nmol/L和250 nmol/L PD0325901促進(jìn)位點(diǎn)HDR效率，分別提高了4.8%、0.8%和9.6% (圖3，H和I)，但100 nmol/L劑量時(shí)，位點(diǎn)HDR效率略微下降。進(jìn)一步利用TA克隆和測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果顯示，在250 nmol/L PD0325901劑量下和基因位點(diǎn)的HDR效率分別提高了48.16%和17.64% (表5；圖3，J和K)，與dⅢ酶切結(jié)果基本一致。

A：ssODN介導(dǎo)的HDR報(bào)告載體修復(fù)模式圖；B：報(bào)告載體HDR修復(fù)效率的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果(用EGFP熒光細(xì)胞百分比表示HDR效率)；C：PD032590處理組間ssODN介導(dǎo)報(bào)告載體HDR修復(fù)的效率比較(=3)。*<0.05，表示差異顯著，**<0.01表示差異極顯著；D和G：ssODN介導(dǎo)dⅢ識(shí)別序列定點(diǎn)整合至豬基因組模式圖。D圖為基因位點(diǎn)，G圖為基因位點(diǎn)；E和H：核酸內(nèi)切酶酶切法檢測(cè)位點(diǎn)(圖E)和位點(diǎn)(圖H)編輯效率電泳結(jié)果。T7 EndoⅠ為T(mén)7核酸內(nèi)切酶Ⅰ酶切電泳圖，圖上的數(shù)字表示灰度掃描數(shù)值，代表目標(biāo)位點(diǎn)發(fā)生DSB的效率；dⅢ為dⅢ限制性核酸內(nèi)切酶酶切電泳圖，圖上數(shù)字表示灰度掃描數(shù)值，代表目標(biāo)位點(diǎn)dⅢ定點(diǎn)整合效率；F和I：分別為圖E和圖H灰度掃描值的柱狀圖展示結(jié)果(HDR效率=dⅢ灰度掃描值/T7 EndoⅠ灰度掃描值，=3)；J和K：分別為定點(diǎn)整合dⅢ識(shí)別序列至(圖J)和(圖K)基因位點(diǎn)的測(cè)序峰圖。

表5 TA克隆數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

3 討論

細(xì)胞所在的分裂期會(huì)顯著影響DNA修復(fù)雙鏈斷裂途徑的選擇，在修復(fù)過(guò)程中，NHEJ可以發(fā)生在細(xì)胞分裂的任一時(shí)期，而HDR主要發(fā)生在S和G2期，李國(guó)玲等[17]通過(guò)同步化細(xì)胞周期至S和G2期，成功提高了基因組定點(diǎn)修飾的效率。Yang等[27]在人多能干細(xì)胞中添加ABT-751化合物，使細(xì)胞停滯在G2期，將2~5 kb片段整合至人基因組5個(gè)不同區(qū)域的效率提高了3~6倍；Lin等[28]添加aphidicolin和nocodazole，使人胚胎干細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和293T細(xì)胞停滯在G2期，顯著提高ssODN介導(dǎo)的定向修復(fù)效率。本研究結(jié)果顯示，隨著PD0325901濃度增加，處于G2期和S期的PFFs細(xì)胞群顯著增加，處于G1期細(xì)胞群顯著減少，細(xì)胞表現(xiàn)一定程度的同步化，與前人的報(bào)道結(jié)果不一致[29~31]。Wang等[30]研究表明，RAS-RAF-MEK-ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路通過(guò)激活MEK-ERK，促進(jìn)細(xì)胞周期素D1 (cyclin D1)的表達(dá)及其與細(xì)胞周期依賴(lài)性激酶4 (cyclin-dependent kinase 4, Cdk4)的結(jié)合來(lái)調(diào)控細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入S期。Ayunadirah等[31]研究發(fā)現(xiàn)添加PD0325901顯著降低了MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞的增殖，同時(shí)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期停滯在G1期。本研究用MEK抑制劑PD0325901處理PFFs后，檢測(cè)到S期細(xì)胞數(shù)量反而顯著增加，推測(cè)可能是由于MEK通路受到抑制后影響其他平行信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞周期，或細(xì)胞種類(lèi)差異導(dǎo)致結(jié)果不一致，但具體機(jī)理尚不明確。已有的研究表明，添加小分子化合物PD0325901使細(xì)胞同步至S期和G2期，其可能有利于提高定點(diǎn)整合效率[17,32~34]。本研究結(jié)果也顯示，250 nmol/L濃度PD0325901能顯著提高報(bào)告載體、和位點(diǎn)上ssODN介導(dǎo)的同源修復(fù)效率，表明將細(xì)胞周期同步化在S和G2期可以提高細(xì)胞定向修復(fù)效率。

NHEJ和HDR通路的激活需要許多關(guān)鍵因子的參與，它們能調(diào)節(jié)修復(fù)途徑的選擇，并在修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮不可替代的重要作用[17,35,36]。本研究結(jié)果顯示，不同濃度的PD0325901抑制劑均能提高報(bào)告載體、和位點(diǎn)上ssODN介導(dǎo)的同源修復(fù)效率，并表現(xiàn)明顯劑量依賴(lài)性。本研究結(jié)果推測(cè)，PD0325901上調(diào)和的表達(dá)可能是提高同源重組效率的關(guān)鍵，但PD0325901添加劑量與上述因子表達(dá)并沒(méi)有劑量依賴(lài)性關(guān)系，因而，二者間的相關(guān)性但仍需進(jìn)一步研究。另外，PD0325901對(duì)NHEJ關(guān)鍵因子的表達(dá)也有不同程度的上調(diào)作用，尤其是25 nmol/L和250 nmol/L濃度影響較大，呈“U型效應(yīng)”。在前人研究中也發(fā)現(xiàn)類(lèi)似的現(xiàn)象，如Li等[17]在豬胎兒成纖維細(xì)胞中分別添加L755507、Resveratrol和Scr7 3種小分子抑制劑，NHEJ和HDR關(guān)鍵因子的表達(dá)水平出現(xiàn)了類(lèi)似的“U型效應(yīng)”。Kachhap等[37]在DU-145和LNCaP細(xì)胞中添加不同濃度梯度的丙戊酸(valproic acid, VPA)，基因的表達(dá)水平也同樣出現(xiàn)類(lèi)似的“U型效應(yīng)”。產(chǎn)生“U型效應(yīng)”的原因可能是小分子濃度過(guò)高時(shí)，出現(xiàn)負(fù)反饋調(diào)節(jié)，其具體調(diào)控機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。同時(shí)，本研究利用PD0325901提高ssODN介導(dǎo)的同源修復(fù)效率，證實(shí)了MEK抑制劑PD0325901對(duì)豬體細(xì)胞HDR效率具有促進(jìn)作用，與前人報(bào)道PD0325901可提高ESC定點(diǎn)整合效率結(jié)果一致[15]。本研究通過(guò)向豬成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基中添加MEK抑制劑使EGFP報(bào)告載體的同源修復(fù)效率顯著提高了58.8%，使和26位點(diǎn)的同源重組效率分別提高了48.16%和17.64%，并表現(xiàn)較低的細(xì)胞毒性，這對(duì)提高PFFs細(xì)胞定向編輯效率及基因定向編輯豬的研究具有重要價(jià)值和意義。

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MEK inhibitor PD0325901 significantly boosts ssODN-mediated HDR efficiency in porcine fetal fibroblasts

Hao Ou1, Guoling Li1, Haoqiang Wang1, Guangyan Huang1, Gengyuan Cai1,2, Zicong Li1, Zhenfang Wu1,2, Xianwei Zhang1,2

There are two major pathways, homology-directed repair (HDR) and nonhomologous end joining (NHEJ), involved in double-strand break (DSB) repair.Single-stranded oligodeoxyribonucleotide (ssODN)-mediated homologous recombination repair is commonly used for animal site-directed genome editing, with great scientific and practical value. To improve ssODN-mediated HDR efficiency in the pig genome, we investigated the effect and molecular mechanism of mitogen-activated extracellular signal-regulated kinase (MEK) inhibitor PD0325901 on the HDR efficiency in porcine fetal fibroblasts (PFFs). The results showed that PD0325901 obviously increased the percentage of G2and S phase cell populations and reduced the cell population ratio in the G1phase of PFFs, and promoted the expression of HDR repair factor. At the optimal concentration of 250 nmol/L, PD0325901 increased the repair efficiency of ssODN-mediated GFP reporter vector by 58.8% and the directed editing efficiency of PFFandlocus by 48.16% and 17.64%, respectively. The results show that MEK inhibitor PD0325901 significantly promotes the efficiency of ssODN-mediated homologous-directed repair in the porcine genome, thus offering a new idea to generate genetically modified pigs more effectively.

MEK inhibitor; homologous-directed repair (HDR); PD0325901; gene editing

2018-10-29;

2019-03-02

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：31772555)和國(guó)家轉(zhuǎn)基因重大專(zhuān)項(xiàng)(編號(hào)：2016ZX08006002)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.31772555) and the National Transgenic Major Projects (No.2016ZX08006002)]

歐浩，碩士，專(zhuān)業(yè)方向：動(dòng)物遺傳育種。E-mail: 719367112@qq.com李國(guó)玲，博士，研究方向：基因編輯與遺傳育種。E-mail: 792268184@qq.com歐浩和李國(guó)玲并列第一作者。

張獻(xiàn)偉，博士，碩士生導(dǎo)師，研究方向：動(dòng)物遺傳育種。E-mail: zxianw@163.com

10.16288/j.yczz.18-294

2019/3/26 9:24:44

URI: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20190326.0924.003.html

(責(zé)任編委: 任軍)