血管緊張素Ⅱ1型受體自身抗體陽(yáng)性雌鼠孕后出現(xiàn)妊娠期高血壓樣癥狀

邊經(jīng)緯 尹曉辰 李 浩 張?zhí)K麗 王美麗 劉慧榮

(首都醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)與病理生理學(xué)系 代謝紊亂相關(guān)心血管疾病北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 代謝紊亂相關(guān)心血管疾病國(guó)際合作實(shí)驗(yàn)室，北京 100069)

妊娠期高血壓疾病是妊娠與血壓升高并存的一組疾病，該組疾病嚴(yán)重影響母嬰健康，是孕產(chǎn)婦和圍產(chǎn)兒病死率升高的主要原因。妊娠期高血壓疾病包括妊娠期高血壓、子癇前期、子癇、慢性高血壓并發(fā)子癇前期和慢性高血壓合并妊娠[1]。前3種疾病與后兩種有些不同，主要表現(xiàn)為患者妊娠前血壓正常，妊娠后出現(xiàn)血壓升高的臨床癥狀，前3種疾病的嚴(yán)重程度逐漸增加。但目前臨床上除使用對(duì)癥藥物減輕癥狀外，終止妊娠仍舊是唯一有效的治療手段[2]。因此疾病的預(yù)防和治療顯得尤為重要。

近年來的研究[3]顯示，一種存在于子癇前期患者血清中的病理性自身抗體，即血管緊張素Ⅱ 1型受體(angiotensin Ⅱ type 1 receptor，AT1R)自身抗體(angiotensin Ⅱ type 1 receptor autoantibody，AT1-AA)可能是導(dǎo)致子癇前期發(fā)展的重要因素。臨床調(diào)查[4]顯示，AT1-AA與子癇前期具有高度的相關(guān)性，且疾病的嚴(yán)重程度隨抗體效價(jià)的升高而逐漸升高。Zhou等[5]將AT1-AA注入妊娠小鼠體內(nèi)后引發(fā)孕鼠出現(xiàn)血壓升高，尿蛋白含量增加等癥狀，提示AT1-AA是妊娠期高血壓疾病重要的發(fā)病原因。隨后越來越多的臨床研究顯示，AT1-AA不僅存在于子癇前期患者體內(nèi)，還廣泛分布于妊娠期高血壓，以及其他疾病如原發(fā)性醛固酮增多癥，惡性高血壓，腎移植排斥，以及系統(tǒng)性硬化癥相關(guān)性肺動(dòng)脈高壓等疾病[4]。值得注意的是，本課題組在部分健康人血清中也檢測(cè)到AT1-AA，但其潛在的病理意義不清。鑒于此，本研究目的在于探究AT1-AA陽(yáng)性是否會(huì)增加妊娠后出現(xiàn)類似妊娠期高血壓癥狀的風(fēng)險(xiǎn)，以及引發(fā)癥狀的可能原因。

1 對(duì)象與方法

1.1 臨床樣本的收集

本實(shí)驗(yàn)相關(guān)研究程序均經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，符合人體標(biāo)本收集標(biāo)準(zhǔn)。受試者均已簽訂知情同意書。收集健康未妊娠女性、正常孕婦和子癇患者的血清用于AT1-AA檢測(cè)。子癇前期的診斷符合國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)：正常婦女在妊娠20周后出現(xiàn)血壓升高(收縮壓>140 mmHg或舒張壓>90 mmHg， 1 mmHg=0.133 kPa)的臨床現(xiàn)象，并伴有以下一個(gè)或兩個(gè)以上癥狀：①蛋白尿；②孕婦器官功能障礙； ③子宮胎盤功能障礙。分娩時(shí)的孕周37～40周，平均孕周為(38.6±1.7)周；正常孕婦為妊娠期間體檢正常的孕婦，正常分娩，孕周37～40周，平均孕周為(39.3±1.2)周；健康非妊娠女性為健康體檢志愿者。3組在年齡、體質(zhì)量、身高等方面盡可能一致。所有參與者均排除心血管疾病、腫瘤、自身免疫病、內(nèi)分泌疾病等合并癥。依據(jù)以前研究[6]計(jì)算出最小樣本量為33 (OR=16.04，α=0.05，β=0.1)或18(OR=7.74，α=0.05，β=0.1)。本研究共收集48例健康未妊娠女性、56例正常孕婦和82例子癇前期患者。受試者基本情況詳見表1。

1.2 AT1-AA陽(yáng)性大鼠模型構(gòu)建

本實(shí)驗(yàn)的所有研究程序均經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，符合“動(dòng)物使用和護(hù)理指導(dǎo)原則”標(biāo)準(zhǔn)。合成純度為98%的人源AT1受體細(xì)胞外第二環(huán)抗原表位肽段(I-H-R-N-V-F-F-I-E-N-T-N-I-T-V-C-A-F-H-Y-E-S-Q-N-S-T)。通過數(shù)字表法將14只正常的SD雌性大鼠隨機(jī)分為溶劑對(duì)照組和主動(dòng)免疫組。按照0.4 μg/g大鼠體質(zhì)量的劑量和每只鼠注射0.5 mL總液體的標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算出所用抗原溶液的體積，剩余液體用0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液補(bǔ)齊。首次免疫時(shí)，使用等體積的弗氏完全佐劑混合包含抗原的水溶液，背部皮下梅花點(diǎn)注射。后續(xù)加強(qiáng)免疫時(shí)，用等體積的弗氏不完全佐劑混合抗原溶液，背部皮下注射，2周1次。每次免疫前采血，并將所采血樣進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)。溶劑對(duì)照組以0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液代替抗原溶液，免疫方法同實(shí)驗(yàn)組。免疫8周后AT1-AA穩(wěn)定表達(dá)，屆時(shí)將溶劑對(duì)照組和主動(dòng)免疫組的雌性大鼠分別與正常雄性SD大鼠交配，以見雌鼠陰道栓為妊娠0.5 d。整個(gè)過程中通過尾套法(BP-98A，Softron公司，日本)測(cè)量大鼠收縮壓。

1.3 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)

將合成的AT1受體細(xì)胞外第二環(huán)抗原肽段(10 μg/mL)包被到96 孔板中，100 μL/孔，4 ℃過夜。第二天，使用含0.1%(體積分?jǐn)?shù))Tween-20的磷酸鹽緩沖液(PBST，mmol/L： NaCl 137, KCl 2.7，Na2PO4·12H2O 10， KH2PO41.76；pH值為7.4)洗板3次。每孔加入400 μL由PBST配制的5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))脫脂奶粉，37 ℃水浴中封閉1 h后，洗板3次。使用5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))脫脂奶粉稀釋待測(cè)血清樣品(1∶10)，100 μL/孔，37 ℃水浴1 h，洗板。加入5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))脫脂奶粉稀釋的辣根酶標(biāo)記人或大鼠二抗(1∶500)，100 μL/孔，37 ℃水浴1 h，洗板。以1.1 mg ABTS加入1 mL雙蒸水的比例配制底物顯色液，用前混合3%(體積分?jǐn)?shù))H2O2(0.5 mL/L)，100 μL/孔，避光，37 ℃水浴30 min。用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)405 nm處讀取樣品A值。

在使用傳統(tǒng)ELISA方法檢測(cè)人血清中的AT1-AA時(shí)，有些樣品即使未包被抗原也會(huì)呈現(xiàn)陽(yáng)性顯色，但在檢測(cè)大鼠血清時(shí)卻未發(fā)現(xiàn)此問題。因此，推測(cè)人血清中可能包含某些特殊物質(zhì)與ELISA板結(jié)合。為排除此類因素造成的假陽(yáng)性，實(shí)驗(yàn)室針對(duì)人來源樣本的特殊性改進(jìn)了ELISA方法，區(qū)別在于包被抗原的同時(shí)設(shè)置未包被抗原的空白孔(即只加抗原稀釋緩沖液)。P/N 值計(jì)算AT1-AA陽(yáng)性率：P/N=(樣品A值-相應(yīng)的未包被抗原孔A值)/(陰性對(duì)照A值-相應(yīng)的未包被抗原孔A值)。樣品P/N≥2.1 為陽(yáng)性。

1.4 腸系膜動(dòng)脈血管環(huán)

妊娠第18天，大鼠麻醉后腹主動(dòng)脈插管收集血液。剪取腸系膜組織浸泡在冰冷的HEPES緩沖液(mmol/L：NaCl 144，KCl 5.8，CaCl22.5，MgCl21.2，HEPES 5，葡萄糖 11.0；pH值7.4)中。小心游離腸系膜三級(jí)分支血管，清除周圍的脂肪和結(jié)締組織，并將血管剪成2 mm長(zhǎng)的環(huán)。血管環(huán)被固定在微血管環(huán)儀器(DMT 610 M, Danish Myo Technology, Denmark)中，浴槽提前備有HEPES緩沖液。實(shí)驗(yàn)全程保持浴槽中的緩沖液通有95%(體積分?jǐn)?shù))O2+ 5%(體積分?jǐn)?shù))CO2的混合氣，溫度恒定在37 ℃。血管在平衡1 h后加入60 mmol/L K+-HEPES緩沖液(mmol/L：NaCl 29.8，KCl 120.1，MgCl2·6H2O 1.2，CaCl22.5，葡萄糖 11.1，HEPES 5；pH值為7.4)。待血管收縮達(dá)到平臺(tái)期后，重新更換為HEPES緩沖液。通過Power Lab系統(tǒng)記錄血管張力。加入10-5mol/L的去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)。根據(jù)血管收縮百分比(NE和60 mmol/L K+-HEPES緩沖液誘導(dǎo)收縮的比值×100%)評(píng)價(jià)血管對(duì)收縮物質(zhì)的反應(yīng)性。使用NE預(yù)收縮血管，加入作用于內(nèi)皮M受體的乙酰膽堿(acetylcholine，ACh，10-9～10-5mol/L)，根據(jù)血管舒張百分比評(píng)價(jià)血管內(nèi)皮依賴性舒張功能；使用NE預(yù)收縮血管，加入直接引起一氧化氮(nitric oxide，NO)釋放的NO底物硝普鈉(sodium nitroprusside，SNP，10-9～10-5mol/L)，根據(jù)血管舒張百分比評(píng)價(jià)非內(nèi)皮依賴性舒張功能。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 健康未妊娠女性、正常孕婦和子癇前期患者中均存在AT1-AA陽(yáng)性人群

共收集了48例健康未妊娠女性、56例正常孕婦和82例子癇前期患者的血清(表1)。使用ELISA方法檢測(cè)血清中AT1-AA的濃度。子癇前期患者體內(nèi)的AT1-AA含量顯著高于正常孕婦和健康未妊娠女性(圖1A)。69%的子癇前期患者體內(nèi)AT1-AA呈陽(yáng)性，其陽(yáng)性率遠(yuǎn)高于正常孕婦(29.0%)。8.3%的健康未妊娠女性中也存在AT1-AA (圖1B)。

2.2 AT1-AA陽(yáng)性大鼠在妊娠12 d后血壓顯著升高

為模擬自身抗體在體產(chǎn)生的過程，通過主動(dòng)免疫技術(shù)成功建立了AT1-AA陽(yáng)性大鼠模型。結(jié)果顯示其間存在分組效應(yīng)(F=746.40，P=0.000)和時(shí)間效應(yīng)(F=114.03，P=0.000)，主動(dòng)免疫大鼠血清中AT1-AA的A值自第2周(A值，0.3±0.0vs0.2±0.0，n=7，P<0.05，圖2A)起逐漸升高，并于第8周達(dá)到峰值(A值，0.9±0.1vs0.2±0.1，n=7，P<0.01，圖2A)，并且在結(jié)束免疫后的妊娠期第18天，AT1-AA陽(yáng)性孕鼠血清中的AT1-AA仍維持很高水平(A值，0.86±0.04vs0.21±0.03，n=7，P<0.01，圖2B)，佐劑對(duì)照組并未檢測(cè)到AT1-AA。同時(shí)觀察到大鼠收縮期的血壓在免疫期間無明顯變化(圖2C)。大鼠妊娠階段血壓結(jié)果顯示存在分組效應(yīng)(F=79.23，P=0.000)和時(shí)間效應(yīng)(F=21.45，P=0.000)，與溶劑對(duì)照組相比，AT1-AA陽(yáng)性孕鼠的血壓自孕12 d起開始顯著增加，于孕18 d達(dá)到峰值[(150±5)mmHgvs(118±7)mmHg，n=7，P<0.01，圖2D]。

Clinical profilesHealthy non-pregnant women(n=48)Normal pregnancy (n=56)Preeclampsia(n=82)Age/a28.4±3.028.2±3.230.2±2.1 Gestational weeks039.3±1.2 (38-41)38.6±1.7 (37-40)Han ethnic background (yes/no)48/056/082/0Systolic blood pressure/mmHg△101.1±9.2121.4±12.2166.2±10.0?Diastolic blood pressure/mmHg△70.3±7.371.6±8.196.2±8.0?Proteinuria/(mg·d-1)1.5±3.63.6±4.8 398.0±5.6??Family history of cardiovascular disease3 (6.3)3 (5.4)5 (6.1)Family history of hypertension3 (6.3)4 (7.1)7 (8.5)

△1 mmHg=0.133 kPa;*P<0.05,**P<0.01vsnormal pregnancy.

圖1 部分健康未妊娠女性中有AT1-AA分布Fig.1 AT1-AA in healthy non-pregnant women

A:P/N value;B: positive rate.*P<0.05,**P<0.01vshealthy non-pregnant women;##P<0.01vsnormal pregnancy;H:healthy non-pregnant women;N:normal pregnancy;PE:preeclampsia.

圖2 AT1-AA陽(yáng)性大鼠懷孕后12天出現(xiàn)血壓升高Fig.2 Systolic BP of AT1-AA-positive rats elevated after gestation day 12

A:Active immune model of AT1-AA-positive rats was successfully established;B: High level of AT1-AA was detected on AT1-AA-positive rats on gestation day 18;C: There was no significant difference of systolic BP between vehicle and immunized group before pregnancy;D: Systolic BP of AT1-AA-positive rats were increased after gestation day 12;BP: blood pressure.n=7,*P<0.05,**P<0.01vsvehicle group; △1 mmHg=0.133 kPa.

2.3 AT1-AA陽(yáng)性孕鼠血管的收縮舒張功能異常

血壓升高與阻力血管病變密切相關(guān)，為探究AT1-AA陽(yáng)性孕鼠血壓升高的具體原因，從血管的收縮和舒張兩方面評(píng)價(jià)了孕鼠血管功能。血管收縮功能的結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，AT1-AA陽(yáng)性孕鼠對(duì)NE的血管收縮反應(yīng)增強(qiáng)(NE/K+：130%±10%vs110±5%，n=7，P<0.05，圖3A～3C)。血管舒張功能的結(jié)果顯示其間存在組間效應(yīng)(內(nèi)皮依賴性：F=1536.20，P=0.000；非內(nèi)皮依賴性：F=762.12，P=0.000)和濃度效應(yīng)(內(nèi)皮依賴性：F=885.32，P=0.000；非內(nèi)皮依賴性：F=1138.71，P=0.000)且由ACh(圖3D、E)和SNP(圖3G、H)引起的血管舒張程度較溶劑對(duì)照組均顯著降低(ACh：60%±7%vs90%±4%，n=7，P<0.05，圖3F；SNP：75%±3%vs95%±1%，n=7，P<0.05，圖3I)。

圖3 AT1-AA陽(yáng)性孕鼠阻力血管功能Fig.3 AT1-AA-positive rats exhibited resistance vascular dysfunction after pregnancy

A: Representative graph showed vasoconstriction of vehicle group after pregnancy upon NE stimulation;B: Representative graph showed vasoconstriction of AT1-AA-positive IgG after pregnancy upon NE stimulation;C: Column chart summarized the data of 7 independent experiments;D: Representative graph showed vasodilation of vehicle group after pregnancy upon ACh stimulation;E: Representative graph showed vasodilation of AT1-AA-positive IgG after pregnancy upon ACh stimulation;F: Statistics represented 7 independent experiments of vasodilation upon ACh stimulation;G: Representative graph showed vasodilation of vehicle group after pregnancy upon SNP stimulation;H: Representative graph showed vasodilation of AT1-AA-positive IgG after pregnancy upon SNP stimulation;I: Statistics represented 7 independent experiments of vasodilation upon SNP stimulation.*P<0.05vsvehicle group.NE: norepinephrine;ACh: acetylcholine;SNP: sodium nitroprusside. The arrows represented the addition of different stimulations.

3 討論

腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)在調(diào)節(jié)妊娠過程的血壓，血容量和離子平衡中起重要作用。正常女性在妊娠狀態(tài)下表現(xiàn)出RAS的激活，但其血管對(duì)于RAS中核心作用分子血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ)引起的血管收縮反應(yīng)卻有所降低。與之不同的是，雖然部分子癇前期患者血清中血管緊張素原，腎素活性以及Ang Ⅱ的表達(dá)降低，但其血管對(duì)于Ang Ⅱ刺激所引起的收縮反應(yīng)卻顯著增強(qiáng)。提示子癇前期患者體內(nèi)可能存在某種物質(zhì)增強(qiáng)了Ang Ⅱ的敏感性[7]。Cunningham等[8]發(fā)現(xiàn)，AT1-AA可以增強(qiáng)腎動(dòng)脈對(duì)Ang Ⅱ的敏感性。本研究通過微血管環(huán)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，AT1-AA陽(yáng)性孕鼠的血管對(duì)其他縮血管物質(zhì)，如NE的敏感性同樣升高。提示AT1-AA對(duì)Ang Ⅱ的增敏效果可能并非特異。

AT1-AA最早在1999年由Wallukat等[3]從子癇前期孕婦的血清中分離提純，可特異性地識(shí)別位于AT1受體胞外第二環(huán)，發(fā)揮類Ang Ⅱ的受體激動(dòng)樣作用。且與Ang Ⅱ不同，AT1-AA可更持久的收縮離體血管，增加胞內(nèi)鈣離子濃度，提示AT1-AA較Ang Ⅱ激活A(yù)T1R時(shí)間更長(zhǎng)[9]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)AT1-AA可致胸主動(dòng)脈，腸系膜動(dòng)脈，胎盤血管等全身動(dòng)脈血管收縮[9-10]。在本研究中，AT1-AA陽(yáng)性大鼠在主動(dòng)免疫階段的血壓與溶劑對(duì)照組相比并無明顯升高。Wang等[11]將對(duì)AT1-AA主動(dòng)免疫大鼠血壓的觀察延長(zhǎng)至12個(gè)月，同樣未發(fā)現(xiàn)血壓的明顯變化。提示單純的血管持續(xù)收縮并非是AT1-AA導(dǎo)致血壓升高的主要原因。而在妊娠狀態(tài)下，孕婦血容量可比非妊娠時(shí)增加35%。此外，由AT1-AA刺激所致的sFlt1、sEng表達(dá)增加[12]， NO生物利用度降低，胎盤缺血、缺氧時(shí)激活的免疫和炎性反應(yīng)[13-14]，以及本研究中AT1-AA陽(yáng)性孕鼠阻力血管內(nèi)皮依賴和非依賴的舒張功能受損均可能引起孕婦出現(xiàn)高血壓癥狀。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)AT1-AA陽(yáng)性的雌性大鼠受孕后血壓較對(duì)照組顯著升高，主要原因之一是血管對(duì)收縮物質(zhì)反應(yīng)性增強(qiáng)，血管內(nèi)皮依賴和非內(nèi)皮依賴舒張功能損傷。本研究的創(chuàng)新性在于通過主動(dòng)免疫技術(shù)構(gòu)建AT1-AA陽(yáng)性雌鼠，模擬臨床上AT1-AA陽(yáng)性的女性。AT1-AA陽(yáng)性雌鼠妊娠后出現(xiàn)血壓升高，血管損傷的現(xiàn)象，提示AT1-AA陽(yáng)性的女性在妊娠后存在血壓異常升高的風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)注意提前采取有效的預(yù)防措施。