炮附片HPLC特征圖譜及炮制前后比較研究＊

彭詩濤，柴沖沖，袁金鳳，劉 娜，王靖越，李欣欣，張 凱，杜 紅，李 飛

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院 北京 102488）

附子為回陽救逆的第一品藥，是毛茛科植物烏頭Aconitum carmichaelii Debx.的子根，主產(chǎn)于四川、陜西、云南等地，為臨床常用的毒性飲片，具有回陽救逆、補(bǔ)火助陽、散寒止痛的功效[1]。生附片為泥附子凈制、切制、干燥后制得的飲片。泥附子經(jīng)凈制后，浸入膽巴的水溶液中數(shù)日，經(jīng)過煮制、切制、蒸制、干燥等工序制成黑順片，黑順片再經(jīng)砂炒加工成炮附片。生品附子辛、燥之性較強(qiáng)，張仲景在《傷寒雜病論》中多用于治療亡陽之急癥[2]。如在四逆湯方中用甘草二兩、干姜（炙）一兩半、附子一枚（生用，去皮，破八片），上三味?咀，以水三升，煮取一升二合，去滓，分溫再服，用于溫經(jīng)回陽；干姜附子湯方中用干姜一兩、附子一枚（生用，去皮，破八片），上二味，以水三升，煮取一升，去滓，頓服，用以破寒消陰，以扶下焦之陽。但因生附子毒性較大，治療劑量易中毒，現(xiàn)臨床已很少應(yīng)用。生附子經(jīng)過炮制成為黑順片后，毒性減弱，保證了臨床用藥的安全性，有回陽救逆、補(bǔ)火助陽、逐風(fēng)寒濕邪的作用；黑順片經(jīng)砂炒成為炮附片后，主要以溫腎暖脾為主，用于心腹冷痛，虛寒吐瀉等癥[3]。張仲景使用附子有“生熟異用”的特點(diǎn)，生附子多用于急癥，而炮附子性較緩，既可以溫陽散寒止痛，又能助水液氣化，防止劫陰之弊。在《傷寒雜病論》中炮附子應(yīng)用較多，如在麻黃附子湯方中，用麻黃三兩、附子一兩（炮）、甘草二兩，上三味，以水七升，先煮麻黃，去上沫，內(nèi)諸藥，煮取二升半，溫服八分，日三服，用于溫陽化濕；九痛丸中用附子（炮）三兩，生狼牙（炙香）一兩，巴豆（去皮心，熬，研如脂）一兩，人參、干姜、吳茱萸各一兩，上六味，末之，煉蜜丸如桐子大，酒下，強(qiáng)人初服三丸，日三服，弱者二丸。兼治卒中惡，腹脹痛，口不能言。又連年積冷，流主心胸痛，并冷腫上氣，落馬墜車血疾等。

附子中的化學(xué)成分主要包括生物堿類、甾體類、神經(jīng)酰胺類、堿基類以及糖類等其他化合物[4-18]。其中，生物堿類化合物最為豐富?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》2015年版（以下簡(jiǎn)稱2015版《中國(guó)藥典》）將新烏頭堿、烏頭堿和次烏頭堿3 種雙酯型生物堿總量作為附子及其飲片的質(zhì)量控制指標(biāo)，規(guī)定3 種雙酯型生物堿總量不得過0.010%，用作毒性成分的含量限量檢測(cè)。附子及其飲片中雙酯型生物堿的減毒原理為：雙酯型二萜生物堿發(fā)生水解，C8位酯鍵斷裂，脫去乙酸，生成單酯型二萜生物堿，其毒性僅為雙酯型生物堿的1/200-1/500，如:苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿等[19]。2015 版《中國(guó)藥典》也將苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿和苯甲酰次烏頭原堿3種單酯型生物堿總量作為附子及其飲片的質(zhì)量控制指標(biāo)，規(guī)定3 種單酯型生物堿總量不得少于0.010%，用作有效成分的含量限量檢測(cè)。附子的毒性物質(zhì)基礎(chǔ)為雙酯型生物堿，主要表現(xiàn)為心臟毒、神經(jīng)毒、胚胎毒和腎毒等[20-23]。經(jīng)炮制后毒性減小，鎮(zhèn)痛、抗炎、提高免疫的作用增強(qiáng)[24]。

現(xiàn)代研究多集中在附子及其飲片的化學(xué)成分和藥理作用等方面，關(guān)于炮附片炮制前后特征圖譜的研究較少。為探究炮附片炮制前后化學(xué)成分變化的物質(zhì)基礎(chǔ)，本研究建立了炮附片HPLC 特征圖譜，通過將生附片、黑順片、炮附片進(jìn)行HPLC 特征圖譜和6 種生物堿成分含量的對(duì)比研究，比較炮附片炮制前后化學(xué)成分的量變與質(zhì)變，在化學(xué)層次為其科學(xué)內(nèi)涵的闡明提供依據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Waters 高效液相色譜儀（美國(guó)Waters 公司，Waters2695 Separations Module，2498UV 檢測(cè)器）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海振捷實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，RE-52 型）；循環(huán)多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司，SHB-3型）；超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司，SB25-12DTDN 型）；sartorius BSA224S 萬分之一電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）。

1.2 試劑與試藥

苯甲酰新烏頭原堿對(duì)照品（批號(hào)：111795-201604、供含量測(cè)定用）、苯甲酰烏頭原堿對(duì)照品（批號(hào)：111794-201303、供含量測(cè)定用）、苯甲酰次烏頭原堿對(duì)照品（批號(hào)：111796-201705、供含量測(cè)定用）；新烏頭堿對(duì)照品（批號(hào)：110799-201608、供含量測(cè)定用）、次烏頭堿對(duì)照品（批號(hào)：110798-201609、供含量測(cè)定用）、烏頭堿對(duì)照品（批號(hào)：110720-201111、供含量測(cè)定用）；以上標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

四氫呋喃（美國(guó)Fisher 公司）、乙腈（美國(guó)Fisher 公司）為色譜純，乙酸銨（北京化工廠）、氨水（北京化工廠）、乙醚（北京化工廠）、乙酸乙酯（北京化工廠）、異丙醇（北京化工廠）、二氯甲烷（北京化工廠）、鹽酸（北京化工廠）、甲醇（北京化工廠）等試劑均為分析純，水為娃哈哈純凈水。

生附片（批號(hào)160701，四川江油中壩附子科技發(fā)展有限公司）、黑順片（批號(hào)160901，四川江油中壩附子科技發(fā)展有限公司）、炮附片（批號(hào)：160901、170301、170901，四川江油中壩附子科技發(fā)展有限公司），經(jīng)中國(guó)食品藥品檢定研究院中藥所張繼主任藥師鑒定為毛茛科植物烏頭Aconitum carmichaelii Debx.的子根的加工品。

2 方法與結(jié)果

2.1 炮附片HPLC特征圖譜的建立

2.1.1 供試品溶液的制備

精密稱取炮附片粉末5 g，置于150 mL 具塞三角瓶中，加濃氨水5 mL 浸潤(rùn)粉末，靜置0.5 h，再加入混合溶劑（乙醚：二氯甲烷=1∶4）75 mL，密塞，靜置12 h。超聲處理（功率300 W，頻率40 kHz,水溫在25℃以下）20 分鐘，過濾，濾渣加混合溶劑（乙醚：二氯甲烷=1∶4）洗滌3 次，洗液與濾液合并，40℃以下減壓回收溶劑至干。殘?jiān)尤? mL 0.05%鹽酸甲醇溶解，用0.45 μm 的微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，制備供試品溶液。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備

取苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿適量置于5 mL容量瓶中，加0.05%鹽酸甲醇定容至刻度，搖勻，用0.45μm的微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，制備對(duì)照品溶液。

2.1.3 色譜條件[25]

以乙腈（A）-40 mM 乙酸銨緩沖液(氨水調(diào)PH 為10.5)（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫：0-45 min，15-60%（A）；45-60 min，60%（A）。

AgilentExtend-C18 色 譜 柱(4.6 mm×250 mm，5μm)，柱溫30℃，進(jìn)樣體積20μL，流速1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)240 nm。

圖1 炮附片特征圖譜

2.1.4 方法學(xué)考察（1）精密度

精密進(jìn)樣同一供試品溶液20μL，連續(xù)6 次，以苯甲酰新烏頭原堿峰為參照峰，計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD 分別為0.144%-0.239%、0.464%-0.798%，表明儀器精密度良好。

（2）重復(fù)性

取同一供試品粉末6份，制備供試品溶液，精密進(jìn)樣20μL，以苯甲酰新烏頭原堿峰為參照峰，計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD 值分別為0.230% -0.312%、0.713% -0.829%，表明該方法重復(fù)性良好。

（3）穩(wěn)定性

精密進(jìn)樣同一供試品溶液20 μL，分別在0、3、6、9、12、15、18、21、24 h 進(jìn)行檢測(cè)，以苯甲酰新烏頭原堿峰為參照峰，計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD 值分別為0.175% -0.222%、0.468% -0.685%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

（4）空白試驗(yàn)

精密進(jìn)樣0.05%鹽酸-甲醇20μL，結(jié)果表明在52 min出現(xiàn)的色譜峰為溶劑峰。

（5）炮附片特征圖譜的建立及分析

取3 批炮附片粉末，制備供試品溶液，并按照“2.1.3”項(xiàng)下方法檢測(cè)，特征圖譜（圖1）。

分別取炮附片、黑順片、生附片粉末，制備供試品溶液，并按照“2.1.3”項(xiàng)下方法檢測(cè)，特征圖譜（圖2）。

2.2 附子飲片中6種生物堿的含量測(cè)定[1]

2.2.1 供試品溶液的制備

按照2015版《中國(guó)藥典》附子含量測(cè)定項(xiàng)下，供試品溶液制備方法制備。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取苯甲酰新烏頭原堿對(duì)照品1.88 mg、苯甲酰烏頭原堿對(duì)照品0.81 mg、苯甲酰次烏頭原堿對(duì)照品0.79 mg、新烏頭堿3.35 mg、次烏頭堿3.62 mg、烏頭堿1.61 mg，置于10 mL 容量瓶中，加異丙醇-二氯甲烷（1：1 )混合溶液定容，搖勻，用0.45 μm 的微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 色譜條件[1]

采用2015 版《中國(guó)藥典》附子含量測(cè)定項(xiàng)下規(guī)定的方法，以乙腈-四氫呋喃（25∶15）為流動(dòng)相A，以0.1 mol·L-1醋酸銨（每1L 含冰醋酸0.5 mL）為流動(dòng)相B，梯度洗脫：0 -48 min，15 -26%（A）；48 -49 min，26-35%（A）；49-58 min，35-35%（A）；58-65 min，35-15%（A）。

AgilentExtend-C18 色 譜 柱(4.6 mm×250 mm，5μm)，柱溫30℃，流速1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)235 nm，進(jìn)樣體積10μL。

2.3.4 樣品檢測(cè)

表1 中6 種生物堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算炮附片、黑順片和生附片中3 種單、雙酯型生物堿含量（表2）。

圖2 炮附片與黑順片、生附片色譜圖

表1 附子飲片中6種生物堿對(duì)照品溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線

表2 附子飲片中3種單、雙酯型生物堿含量測(cè)定結(jié)果（%）（n=4）

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法的優(yōu)化

本研究最初參考課題組前期供試品溶液的制備方法[25]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HPLC 特征圖譜中成分峰高較小，雜峰干擾較大，基線波動(dòng)較大。故對(duì)供試品制備方法進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)化后的樣品成分峰更為明顯且基線平緩，6種生物堿分離度好，圖譜更加美觀。

3.2 炮附片炮制前后科學(xué)內(nèi)涵的探討

觀察（圖1），3 批炮附片特征圖譜中有5 個(gè)共有峰，其中峰4和峰5為空白溶劑中帶入的色譜峰，峰1-3 為炮附片中的色譜峰，分別為苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿。觀察圖2可知，生附片中共有14 個(gè)色譜峰，其中峰4、5、6、10、12、14 為已知峰，分別為苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿。生附子經(jīng)炮制成為黑順片后，色譜峰發(fā)生明顯改變，峰1-6 均顯著減小，7-14 消失至基本檢測(cè)不到。黑順片經(jīng)炮制成為炮附片后，色譜峰的整體形狀與黑順片基本一致，但峰4、5、6 進(jìn)一步減小，峰1-3、7-14 基本檢測(cè)不到。

黑順片、炮附片中主要毒性成分3 種雙酯型生物堿均檢測(cè)不到，說明炮制可降低生附子毒性，保證臨床用藥的安全性。黑順片、炮附片中3 種單酯型生物堿含量均較生品降低，黑順片中苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿分別降低至生品的34.7%、52.5%、48.6%，3 種單酯型生物堿總量降低至生品的40.1%；炮附片中苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿分別降低至黑順片的47.2%、58.1%、67.1%，3種單酯型生物堿總量降低至生品的54.9%；可見黑順片的蒸煮和炮附片的砂炒等炮制加工方式均可使附子中的單酯型生物堿總量降低。

炮附片與黑順片HPLC 特征圖譜基本一致，但含量略有差別。黑順片、炮附片中3 種單酯型生物堿總量分別為0.0226%、0.0124%。在飲片應(yīng)用方面，2015版《中國(guó)藥典》中收錄含有附子的成方制劑有丸劑、片劑、顆粒劑、膏劑、膠囊劑等類型，其中以丸劑居多。使用附子飲片規(guī)格多為制品，除個(gè)別外，多數(shù)并未說明使用附子制品的飲片規(guī)格。由此可見，黑順片與炮附片同為附子制品，兩者在成方制劑的應(yīng)用上并無顯著差別。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，黑順片與炮附片HPLC 特征圖譜基本一致，僅含量略有差別。據(jù)筆者了解，目前附子飲片臨床多使用附片，炮附片較為少見。

《傷寒雜病論》中包含附子的經(jīng)方數(shù)量超過30方，炮用附子居多。附子經(jīng)過干熱炮制后質(zhì)地更酥脆，易研碎，便于入丸散劑，如腎氣丸、烏梅丸、薏苡附子散等。由此可見張仲景用藥的精妙。與藥典炮附片不同的是，張仲景時(shí)期所使用的炮附子是將生附片經(jīng)砂燙制成的飲片。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[26-29]：砂燙生附片與炮附片兩者外觀性狀較為相似，而砂燙生附片的主要藥效成分（3 種單酯型生物堿總量）較炮附片高，且前者抗心衰、抗炎和鎮(zhèn)痛作用較好。砂燙生附片炮制工藝簡(jiǎn)單、花費(fèi)時(shí)間較短，不經(jīng)膽巴浸泡，更無浸漂過程，可有效的避免膽巴殘留和生物堿成分流失。故本課題組認(rèn)為，砂燙生附片在炮制工藝、生產(chǎn)成本和成分含量上均優(yōu)于藥典炮附片，且有高效低毒的特點(diǎn)，值得進(jìn)一步挖掘與研究。