高效氯氰菊酯對中華絨螯60 d慢性毒理及病理研究

張悅，吳晟旻，張曉君，陳輝，方蘋，王晶晶

(1. 揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225000；2. 南京環(huán)境科學(xué)研究所環(huán)境保護(hù)部 江蘇 南京 210000；3. 江蘇省漁業(yè)技術(shù)推廣中心，江蘇 南京 210000)

高效氯氰菊酯，化學(xué)名為2，2-二甲基-3-(2，2-二氯乙烯基)環(huán)丙烷羧酸-α-氰基- (3-苯氧基)芐酯，戊酸氰醚酯，屬于擬除蟲菊酯農(nóng)藥殺蟲劑[1]，用來殺滅農(nóng)作物害蟲，預(yù)防魚類寄生蟲疾病[2]。由于其具有廣譜性、低毒性和高效性，因此在全國的養(yǎng)殖區(qū)域大規(guī)模使用[3]。擬除蟲菊酯不僅會(huì)對引起水生動(dòng)物中毒病死，還會(huì)對生態(tài)環(huán)境造成污染[4]。

中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)屬節(jié)肢動(dòng)物門，軟甲綱，十足目，爬行亞目，方蟹科，絨螯蟹屬，是一種經(jīng)濟(jì)蟹類，又稱河蟹，毛蟹，清水蟹，大閘蟹，是我國淡水養(yǎng)殖的重要品種之一[5]。隨著河蟹養(yǎng)殖地域范圍越來越大，養(yǎng)殖產(chǎn)量逐年上升，養(yǎng)殖模式不斷變化，河蟹病害問題日趨嚴(yán)重[6]。近年來，多地區(qū)暴發(fā)河蟹肝胰腺病變綜合征(俗稱“水癟子”病)，對河蟹養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的損失[7]。2015—2016年，在江蘇興化地區(qū)大面積暴發(fā)河蟹肝胰腺病變綜合征，3—4月開始大量出現(xiàn)病癥，5—8月上旬達(dá)到該病高發(fā)期，塘口發(fā)病率為30%～40%，嚴(yán)重的高達(dá)90%～100%。高溫期過后，病死率逐漸下降直至達(dá)到平穩(wěn)甚至恢復(fù)的狀態(tài)[8]。經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)興化地區(qū)養(yǎng)殖池塘普遍存在潑灑化學(xué)農(nóng)藥氯氰菊酯殺毒的現(xiàn)象[9]，推測氯氰菊酯可能會(huì)造成中華絨螯蟹的肝胰腺病變。該實(shí)驗(yàn)探究在相同環(huán)境條件下不同濃度的高效氯氰菊酯對中華絨螯蟹扣蟹體質(zhì)量和存活率的影響，并通過石蠟切片，設(shè)置3個(gè)梯度濃度探究氯氰菊酯對河蟹組織影響。

1 材料與方法

1.1 扣蟹

試驗(yàn)于2017年6月在南京環(huán)境科學(xué)研究所國家環(huán)境保護(hù)農(nóng)藥環(huán)境評價(jià)與污染控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，試驗(yàn)用中華絨螯蟹扣蟹由江蘇省漁業(yè)技術(shù)推廣中心提供?？坌吩谠囼?yàn)前暫養(yǎng)1周以上。保持每天光照14 h，溫度22.9～23.2 ℃，pH值7.71～7.82，溶解氧大于飽和度的80%，每天投食2次，至試驗(yàn)開始前24 h為止。餌料主要成分：粗蛋白 > 30.0%、粗脂肪 > 2.0%、粗纖維 <3.0%、灰分 < 12.0%、水分 < 10.0%。

在馴養(yǎng)環(huán)境中適應(yīng)48 h后，7 d馴養(yǎng)期內(nèi)受試扣蟹病死率為0，因此該批扣蟹(批號：F20170615K)符合試驗(yàn)用扣蟹要求。試驗(yàn)開始時(shí)，扣蟹的平均體質(zhì)量為5.949 g，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差2.14%。

1.2 試驗(yàn)用水

試驗(yàn)用水為曝氣處理24 h以上的自來水，水質(zhì)硬度為145 mg/L(以CaCO3計(jì))，pH值7.20。

1.3 試驗(yàn)試劑和儀器設(shè)備

水質(zhì)參數(shù)測定儀；分析天平；20 L玻璃缸；水浴槽；手動(dòng)單道移液器；氯氰菊酯原藥；蠟塊；蘇木精-伊紅染料；無水乙醇。

1.4 受試濃度的選擇

根據(jù)扣蟹急性毒性試驗(yàn)結(jié)果，受試物對扣蟹96 h-LC50=0.612 mg/L。因此，60 d延長毒性試驗(yàn)設(shè)置配制濃度為0.01、0.10、1.00 mg/L3個(gè)受試物處理組，同時(shí)設(shè)置不含受試物的空白對照組和溶劑對照。

1.5 受試物溶液的制備

試驗(yàn)時(shí)，準(zhǔn)確稱取1.0531 g高效氯氰菊酯(純度95%)，用乙腈溶解并定容至100 mL，得到10 000 mg/L的受試儲備液。將受試物貯備液置于4 ℃冰箱貯存，試驗(yàn)期間每隔3 d重新配制儲備液。

試驗(yàn)時(shí)，準(zhǔn)確吸取適量受試物貯備液加入試驗(yàn)用水中，機(jī)械攪拌30 min后配制成一定濃度的受試物溶液。受試物溶液每隔24 h更新。試驗(yàn)期間，測試容器始終加蓋。具體配制方法見表1。

表1 受試物溶液的配置方法

1.6 暴露條件

在該試驗(yàn)條件下，受試物比較穩(wěn)定，因此試驗(yàn)采用半靜態(tài)法(換水頻率為24 h)。試驗(yàn)期間，各項(xiàng)試驗(yàn)條件控制如下。

暴露時(shí)間：60 d；暴露溶液體積：2 L；承載量：5.0～7.0 g/L(拭干體表水分后的濕重)；暴露密度：20只/缸；光照：每天14 h光照；溫度：23.0～23.1 ℃；溶解氧濃度：飽和度的85%～97%，試驗(yàn)期間不曝氣；飼喂：每天喂食，飼喂量為扣蟹體初始體質(zhì)量的2%；清潔：每次更新溶液的同時(shí)清理玻璃缸。

1.7 觀察

每天觀察和記錄受試扣蟹的死亡情況，當(dāng)觀測到扣蟹沒有呼吸運(yùn)動(dòng)或觸碰無反應(yīng)，即判定扣蟹已病死。每天觀察和記錄其他非致死效應(yīng)，包括與對照組扣蟹明顯不同的體外特征和行為。

1.8 測定

試驗(yàn)開始前逐條測量體質(zhì)量。試驗(yàn)結(jié)束后逐條測量存活扣蟹體質(zhì)量。試驗(yàn)過程中不進(jìn)行任何受試扣蟹體質(zhì)量的測量。在0、7、14、28、54、60 d測定受試溶液的溶解氧含量、pH值和溫度。

1.9 病理組織切片的制備

在 96 h-LC50 的0.10 μg/L，0.19 μg/L，0.59 μg/L濃度脅迫第 15天，再分別從3個(gè)濃度組隨機(jī)取出3 只河蟹，迅速取出肝胰腺用Bouin氏液固定24 h，固定樣品經(jīng) 70%、80%、95%、100%梯度酒精脫水， 二甲苯透明，常規(guī)石蠟包埋。使用手搖式切片機(jī)切片( 厚度約 5μμm)， HE( 蘇木精-伊紅)染色，Olympus顯微鏡觀察、拍片。

1.10 數(shù)據(jù)處理

采用Bartlett’s tests(ANOVA，STATA 10.0)多元對比分析受試組扣蟹的假定比增長率，確定最低顯著效應(yīng)濃度(LOEC)(P<0.05)與無顯著效應(yīng)濃度(NOEC)。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗(yàn)條件

試驗(yàn)期間，試驗(yàn)條件測定結(jié)果見表到2、表3和圖1。結(jié)果表明：試驗(yàn)期間，空白對照組和受試組溶液pH值在7.65～7.83范圍內(nèi)，溶解氧保持在飽和溶解氧的85%～97%之間，溫度控制在23.0～23.1 ℃，保證試驗(yàn)只有氯氰菊酯濃度不同這一個(gè)變量，其他條件相同。

2.2 試驗(yàn)有效性

2.2.1 對照組試驗(yàn) 與受試物處理組相同的試驗(yàn)條件下，同時(shí)開展試驗(yàn)用水空白和溶劑對照試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，空白對照組和溶劑對照組受試扣蟹活動(dòng)正常、無病死。

2.2.2 受試扣蟹承載量 單位水體載魚量為5.0～7.0 g(拭干體表水分后的濕重)/L。

2.2.3 試驗(yàn)有效性 試驗(yàn)期間，空白對照組和受試組溶液pH值在7.65～7.83范圍內(nèi)，溶解氧保持在飽和溶解氧的85%～97%之間，溫度控制在23.0～23.1 ℃?？瞻讓φ战M和溶劑對照組受試扣蟹活動(dòng)正常。試驗(yàn)期間，受試物濃度保持恒定，因此各項(xiàng)試驗(yàn)條件滿足試驗(yàn)有效性標(biāo)準(zhǔn)(溶解氧：不低于空氣飽和濃度的60%；空白對照組受試扣蟹病死率不超過10%)。

2.3 病死率與危害影響

表3為在不同濃度作用下，扣蟹病死率及異常情況，表4為扣蟹60 d體質(zhì)量前后變化表。圖1為在不同濃度作用下，扣蟹存活率情況折線圖。

表2 扣蟹病死率及異常情況

表3 扣蟹60 d體質(zhì)量前后變化表

圖1 不同濃度的氯氰菊酯對中華絨螯蟹扣蟹60 d存活情況

試驗(yàn)結(jié)果表明，中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)扣蟹在高效氯氰菊酯(0.10、1.00 mg/L處理組)作用下攝食量逐漸減少，剩餌增多，由表4可以看出在高效氯氰菊酯作用下中華絨螯蟹體質(zhì)量明顯降低。尤其是 1.00 mg/L濃度組最明顯。0.01 mg/L處理組和對照組扣蟹無明顯異?，F(xiàn)象。

2.4 氯氰菊酯對中華絨螯蟹各組織結(jié)構(gòu)的影響

組織切片觀察發(fā)現(xiàn)，3個(gè)氯氰菊酯濃度下，中華絨螯蟹各組織結(jié)構(gòu)均發(fā)生了一定的變化。尤其是中華絨螯蟹肝胰腺組織最明顯，正常狀態(tài)下河蟹的肝小管結(jié)構(gòu)完整，上皮細(xì)胞排列整齊，無空泡現(xiàn)象的發(fā)生。0.10 μg/L低濃度下，輕微出現(xiàn)空泡，肝小管基膜增厚。0.19 μg/L濃度下，肝小管間的血細(xì)胞數(shù)量增多，空泡數(shù)量增多，基膜破裂，部分肝小管發(fā)生水腫、變性，細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊。在0.59 μg/L濃度下，出現(xiàn)大面積的空泡化結(jié)構(gòu)，細(xì)胞排列出現(xiàn)紊亂，發(fā)生壞死解體，細(xì)胞核固縮、破碎，使官腔內(nèi)出現(xiàn)許多細(xì)胞碎片[10-13]。

圖2 0.10 μg/L氯氰菊酯濃度下河蟹肝胰腺組織病理切片

圖3 0.19 μg/L氯氰菊酯濃度下河蟹肝胰腺組織病理切片

圖4 0.59 μg/L氯氰菊酯濃度下河蟹肝胰腺組織病理切片

圖5 氯氰菊酯作用下河蟹鰓組織病理切片

高效氯氰菊酯除了引起中華絨螯蟹的肝胰腺損傷，還會(huì)對肌肉、鰓組織有一定破壞。如圖5、圖6，正常的中華絨螯蟹鰓呈現(xiàn)干凈無污物，上皮細(xì)胞排列整齊。而如圖5受到高效氯氰菊酯作用的中華絨螯蟹的鰓葉間出現(xiàn)大量雜質(zhì)，上皮細(xì)胞發(fā)生崩解。

中華絨螯蟹的附肢肌肉為橫紋肌，健康蟹的附肢肌細(xì)胞核呈圓形或梭形，位于細(xì)胞的邊緣，肌纖維排列整齊，橫紋清晰，纖維間的肌質(zhì)網(wǎng)密集。在氯氰菊酯作用下，部分肌肉橫紋肌發(fā)生模糊，肌纖維發(fā)生萎縮，肌纖維間和肌束間水腫而間隙增大，尤其肌束膜與肌束間的分離更為明顯。

圖6 氯氰菊酯作用下河蟹肌肉組織病理切片

3 結(jié)論

在有效半靜態(tài)法[14](換水頻率24 h)試驗(yàn)條件下，60 d試驗(yàn)期間，受試物對中華絨螯蟹扣蟹60天最低可觀察效應(yīng)濃度(LOEC)和無可觀測效應(yīng)濃度(NOEC)，具體如下：60d-NOEC(體質(zhì)量)=0.01 mg/L；60d-LOEC(體質(zhì)量)> 0.01 mg/L。

試驗(yàn)結(jié)果表明，采用Bartlett’s tests(ANOVA，STATA 10.0)將每個(gè)濃度組的體質(zhì)量與對照組比較的結(jié)果顯示，受試物處理組(0.01 mg/L)體質(zhì)量與空白對照組相比差異不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)， 受試物處理組(0.10， 1.00 mg/L)體質(zhì)量與空白對照組相比差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

中華絨螯蟹是典型的甲殼動(dòng)物，在一生中要經(jīng)歷多次蛻殼。在60 d試驗(yàn)期間，觀察到受試扣蟹至少蛻殼一次。在蛻殼過程中，蟹體大量吸收水分，體質(zhì)量增加明顯，而在蛻殼后的生長中，體質(zhì)量增長緩慢，水分逐漸為組織生長所代替，生長不連續(xù)而呈跳躍式的特點(diǎn)。剛蛻殼的受試扣蟹對高效氯氰菊酯十分敏感，特別是0.10、1.00 mg/L處理組剛蛻殼螃蟹病死率明顯增加，在1.00 mg/L濃度組最明顯，而0.01 mg/L處理組和對照組扣蟹無明顯異常現(xiàn)象。

一定濃度的氯氰菊酯會(huì)對河蟹的肝胰腺、鰓和肌肉組織產(chǎn)生明顯的病理變化。且在不同的濃度下，呈現(xiàn)不同的病變狀態(tài)，濃度越高對中華絨螯蟹組織破壞力越強(qiáng)。