復(fù)方中草藥KFJ制劑對(duì)感染弧菌病的凡納濱對(duì)蝦免疫活性的影響

朱志東，朱宇嘉，呂莉，董碧蓮，蔡延渠，辛年香，朱盛山

(1. 廣東藥科大學(xué)新藥研發(fā)中心廣東 廣州 510006；2. 廣州普精生物科技有限公司，廣東 廣州 510006)

聯(lián)合國糧農(nóng)組織指出：弧菌病一直困擾著科學(xué)家、動(dòng)物衛(wèi)生主管部門和養(yǎng)殖者，很難采取有效的預(yù)防和治療措施。據(jù)2015年對(duì)凡納賓對(duì)蝦病害的調(diào)查結(jié)果，在成蝦樣本中，弧菌病占74.6%，每年因弧菌病造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)10億美元[1]。目前，控制水產(chǎn)動(dòng)物弧菌病的主要是用抗生素，不僅效果不明顯，而且導(dǎo)致諸多問題，如藥殘、耐藥、破壞生態(tài)平衡、對(duì)動(dòng)物有毒副作用等[2-3]。中草藥為綠色藥物，具有多功效、全面提高免疫力、不易誘發(fā)病原菌耐藥性等優(yōu)勢(shì)，對(duì)推進(jìn)水產(chǎn)無公害養(yǎng)殖病害的防治具有重大意義[4]。研究顯示，中草藥能顯著提高水產(chǎn)動(dòng)物免疫力、抗氧化能力及疾病抵抗力等[5-7]。鑒于此，國內(nèi)外學(xué)者從免疫學(xué)角度對(duì)蝦病進(jìn)行防治研究，提高對(duì)蝦自身非特異免疫力，以達(dá)到增強(qiáng)抗病力的目的[8-9]。該試驗(yàn)采用復(fù)方中草藥KFJ制劑飼喂凡納濱對(duì)蝦，抑殺對(duì)蝦體內(nèi)弧菌，通過刺激免疫系統(tǒng)，來提高其防御能力，進(jìn)而達(dá)到治病、防病的目的。試驗(yàn)通過測(cè)定蝦肝胰腺中總抗氧化能力(T-AOC)、酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)活性3種非特異免疫酶相關(guān)的變化，探討復(fù)方中草藥KFJ制劑提高蝦非特異免疫力的效果，為KFJ制劑產(chǎn)品的推廣應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 試驗(yàn)材料

1.1 凡納濱對(duì)蝦

225萬尾(體長8～10 cm)，廣東省中山市海騰養(yǎng)蝦場(chǎng)提供，養(yǎng)于室內(nèi)搭棚水泥池(150個(gè)，體積58 m3/個(gè)，放養(yǎng)蝦苗15 000尾)中，循環(huán)水，連續(xù)充氧，投喂飼料。

1.2 藥品和儀器

由廣東某研究所提供的復(fù)方中草藥KFJ制劑(2 g/mL)。冰箱(海爾，BCD-257SL)；紫外分光光譜儀(MV-1700，島津)；超低溫冰箱；5418R低溫高速離心機(jī)；Mulitskan MK3 酶標(biāo)儀；總抗氧化能力、酸性磷酸酶、堿性磷酸酶試劑盒。

2 方法

2.1 分組與取樣

2.1.1正常組 從放苗開始，以KFJ制劑與飼料1∶6拌料投喂，連續(xù)投喂2 d，1 d 1次，4 d為一個(gè)間隔，定期預(yù)防，未見發(fā)病，為該試驗(yàn)正常蝦。隨機(jī)取正常蝦2 000只，放入沒有投苗同樣大小的水泥池中，循環(huán)水，連續(xù)充氧；從停喂KFJ制劑第3天開始，分別在第72、75、78、84、96、120和168 h，取吃到料的蝦用濾紙輕輕吸干表面水分，解剖出蝦肝胰腺組織，每組6只蝦混樣，冰浴勻漿，4 ℃下2 500 r/min離心10 min，-20 ℃保存。

2.1.2 感染發(fā)病組 已養(yǎng)45 d對(duì)蝦，有6個(gè)養(yǎng)殖池，開始發(fā)病(依據(jù)癥狀、弧菌培養(yǎng)，診斷感染弧菌病)。病蝦發(fā)病初期活動(dòng)能力減弱，趴塘，食欲減退，慢料；發(fā)病中期出現(xiàn)游塘，浮便，腸道分節(jié)；發(fā)病后期有偷死、白便、長便、拖便，肝臟開始萎縮，無血色，肝胰臟包膜不完整，甚至消失。

2.1.3 感染發(fā)病對(duì)照組 隨機(jī)取發(fā)病初期感染弧菌病蝦2 000只，放入沒有投苗同樣大小的水泥池中，循環(huán)水，連續(xù)充氧，以正常飼料投喂，分別在第1、3、6、12、24、48和96 h，取吃到料的蝦用濾紙輕輕吸干表面水分，解剖出蝦肝胰腺組織，每組6只蝦混樣，冰浴勻漿，4 ℃下2 500 r/min離心10 min，-20 ℃保存。

2.1.4 感染發(fā)病給藥組 隨機(jī)取發(fā)病初期感染弧菌病蝦2 000只，放入沒有投苗同樣大小的水泥池中，循環(huán)水，連續(xù)充氧，以復(fù)方中草藥KFJ制劑與飼料1∶3拌料投喂，連續(xù)投喂2 d，1 d 2次，于投料完畢后分別在第1、3、6、12、24、48和96 h，取吃到料的蝦用濾紙輕輕吸干表面水分，解剖出蝦肝胰腺組織，每組6只蝦混樣，冰浴勻漿，4 ℃下2 500 r/min離心10 min，-20 ℃保存。

2.2 樣品解凍

取冰凍保存的各待測(cè)肝胰腺樣品，置于0 ℃水解凍，用以各項(xiàng)肝胰腺指標(biāo)的測(cè)定。

2.3 總抗氧化能力的測(cè)定

取各待測(cè)肝胰腺上清液樣品0.05 mL和雙蒸水0.05 mL，分別加入K2S2O3緩沖液1 mL，ABTS工作液2 mL和過氧化氫溶液0.5 mL，混合均勻，37 ℃水浴30 min后，分別加入過氧化氫酶溶液0.1 mL，混合均勻，放置10 min，于520 nm處測(cè)定各樣品的吸光度，按下式計(jì)算各組織樣品的總抗氧化能力。

總抗氧化能力=(測(cè)定OD值-對(duì)照OD值)/0.01/30×(反應(yīng)液總液體量/樣本取樣量)×樣本測(cè)試前稀釋倍數(shù)(單位/毫升組織液)

2.4 酸性磷酸酶的測(cè)定

取雙蒸水、0.1 mg/mL酚標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液和各待測(cè)肝胰腺上清液樣品0.05 mL，分別加入緩沖液和基質(zhì)液0.5 mL，充分混勻，37 ℃水浴30 min后，分別加入堿液1 mL和顯示劑1.5 mL，立即混勻，室溫靜置10 min，于520 nm處測(cè)各待測(cè)樣品的吸光度值，按下式計(jì)算酸性磷酸酶活性。

2.5 堿性磷酸酶的測(cè)定

取雙蒸水、0.1 mg/mL酚標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液和各待測(cè)肝胰腺上清液樣品0.05 mL，加入0.5 mL 0.1mol/L的硼酸鹽緩沖液、4-氨基安替吡啉基質(zhì)液，充分混勻，37 ℃水浴30 min，加入鐵氰化鉀顯色劑1.5 mL，立即混勻，室溫靜置10 min，于520 nm處測(cè)各樣品的吸光度值，按下式計(jì)算堿性磷酸酶活性。

2.6 統(tǒng)計(jì)分析

采用 Excel和SPSS 13.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。先對(duì)數(shù)據(jù)作單因素方差分析(ANOVA)，處理若有差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，再作 Duncan’s 法多重比較，P<0.05表示差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 癥狀觀察

正常組，蝦活力正常，攝食良好，體色通透，肝臟分明，腸道飽滿，未見有偷死；感染發(fā)病對(duì)照組，病蝦活動(dòng)能力逐步減弱，蝦身瘦弱，體色發(fā)暗，拖便、食欲減退，慢料、減料，肌肉白濁，斷腸、空腸有5成，肝胰腺萎縮、糜爛、白膜消失，偷死約1 kg/d；感染發(fā)病給藥組，蝦的活力明顯增強(qiáng)，料臺(tái)拖便，空腸空胃、斷腸的蝦基本沒有，肝臟白膜變清晰、肝臟有血色，料臺(tái)上的蝦明顯增多，體色變通透，偷死只有2尾/d，吃料恢復(fù)正常。

3.2 復(fù)方中草藥KFJ制劑對(duì)蝦肝胰腺總抗氧化能力(T-AOC)的影響

圖1 T-AOC在96 h內(nèi)的變化(n=6)

由圖1可知，在96 h的觀察過程中，復(fù)方中草藥KFJ制劑對(duì)蝦肝胰腺T-AOC活性有影響，投喂96 h內(nèi)感染發(fā)病給藥組T-AOC活性均高于感染發(fā)病對(duì)照組和正常組；感染發(fā)病給藥組T-AOC水平在12 h達(dá)到最大值，而48 h后降低，趨于平緩、逐漸恢復(fù)正常水平；感染發(fā)病對(duì)照組T-AOC活性在3 h時(shí)為最大值，而后降低，3 h之后開始低于正常值，而正常組無明顯變化。由感染發(fā)病給藥組和感染發(fā)病對(duì)照組對(duì)比可見，感染發(fā)病給藥組與感染發(fā)病對(duì)照組肝胰腺T-AOC在96 h內(nèi)的試驗(yàn)對(duì)比差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，從第6 h開始，2組出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異，第12 h出現(xiàn)最大差異，差距達(dá)9.7 U/mL。結(jié)果表明，復(fù)方中草藥KFJ制劑能抑殺肝胰腺弧菌，顯著提高蝦肝胰腺T-AOC中活性。

3.3 復(fù)方中草藥KFJ制劑對(duì)蝦肝胰腺酸性磷酸酶(ACP)活性的影響

由圖2可知，復(fù)方中草藥KFJ制劑對(duì)蝦肝胰腺ACP活性有影響，在3 h之后感染發(fā)病給藥組和感染發(fā)病對(duì)照組肝胰腺的ACP活性出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異(P<0.05)。而感染發(fā)病給藥組ACP活性3～24 h呈上升，后趨于平緩；而感染發(fā)病對(duì)照組ACP活性在3 h達(dá)到最大值，3～12 h緩慢下降，12 h之后快速降低，且顯著低于正常水平，而正常組保持穩(wěn)定。結(jié)果表明，復(fù)方中草藥KFJ制劑能提高蝦肝胰腺ACP活性。

圖2 ACP在96 h內(nèi)的變化(n=6)

3.4 復(fù)方中草藥KFJ制劑對(duì)凡納濱對(duì)蝦肝胰腺堿性磷酸酶(AKP)活性的影響

兩組肝胰腺中AKP活性在96 h內(nèi)的變化見圖3所示，感染發(fā)病給藥組先1～6 h呈升高，6 h后緩慢下降，后恢復(fù)正常水平；感染發(fā)病對(duì)照組AKP水平在6 h達(dá)到最大值，而后下降，而正常組維持不變。在3、6、12、24 h感染發(fā)病給藥組AKP活性與感染發(fā)病對(duì)照組之間出現(xiàn)極具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異(P<0.01)，其中6 h感染發(fā)病給藥組與感染發(fā)病對(duì)照組差值最大，為13.03 U/mL。結(jié)果表明，復(fù)方中草藥KFJ制劑能提高蝦肝胰腺AKP的活性。

圖3 AKP在96 h內(nèi)的變化(n=6)

4 討 論

T-AOC、ACP、AKP的活性在蝦體免疫和抗病過程中發(fā)揮著很重要的作用，其活性的高低常被用作衡量對(duì)蝦免疫活力高低的參照指標(biāo)[10]。

蝦感染弧菌發(fā)病初期，癥狀為活動(dòng)減弱，攝食減少，慢料，糞便長條，體色偏暗，試驗(yàn)取病蝦做弧菌培養(yǎng)，確診弧菌病。根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)推論，當(dāng)感染發(fā)病對(duì)照組出現(xiàn)病癥，酶的活性在前期都有小幅的上升，但隨著病情的惡化，尤其是白膜完全消失時(shí)，檢測(cè)弧菌嚴(yán)重超標(biāo)，肝胰腺壞死、萎縮、無血色，此時(shí)酶活性都急劇下降?？赡芪r急性肝胰腺壞死是弧菌超標(biāo)導(dǎo)致，而當(dāng)弧菌感染蝦肝胰腺，肝胰腺白膜逐步消失，酶活性快速下降，蝦體質(zhì)、免疫系統(tǒng)遭受破壞，蝦進(jìn)入快速發(fā)病期。感染發(fā)病給藥組，在出現(xiàn)肝胰腺界線不分明，不通透等癥狀，及時(shí)給藥發(fā)現(xiàn)，酶活性慢慢恢復(fù)，蝦的活力明顯增強(qiáng)，肝臟白膜開始變的清晰、肝臟用藥結(jié)束三天后有血色，因此，酶活性與急性肝胰腺壞死有著緊密連續(xù)，后續(xù)養(yǎng)殖過程中應(yīng)該更加注重強(qiáng)化蝦肝胰腺，提高蝦肝胰腺酶活性，從而減少病害的爆發(fā)，預(yù)防工作顯得尤為重要，KFJ制劑對(duì)保護(hù)蝦肝胰腺壞死方面有著獨(dú)特的效果，應(yīng)該加大臨床應(yīng)用研究。

發(fā)病對(duì)照組在弧菌侵入凡納濱對(duì)蝦后，肝胰腺T-AOC、ACP、AKP活性下降；而發(fā)病給藥組的酶活性逐漸上升，后恢復(fù)正常水平， 表明復(fù)方中草藥KFJ制劑不僅抑殺蝦體內(nèi)弧菌，而且在保護(hù)蝦肝臟方面起到了重要作用。檢測(cè)T-AOC、ACP、AKP活性，發(fā)現(xiàn)感染發(fā)病對(duì)照組在弧菌侵入凡納濱對(duì)蝦肝胰腺后，造成肝胰腺T-AOC、ACP、AKP活性下降；而感染發(fā)病給藥組的酶活性逐漸上升，后恢復(fù)正常組水平，反應(yīng)復(fù)方中草藥KFJ制劑在對(duì)蝦清除肝胰腺弧菌方面起到了重要作用。研究結(jié)果顯示，正常組酶活性存在小范圍的波動(dòng)可能與吃藥量有關(guān)。

發(fā)病對(duì)照組初期酶活性緩慢下降，到48 h后快速下降，可能與取樣時(shí)蝦的病情嚴(yán)重程度有關(guān)，因此，取樣必須保證取吃料的蝦，取樣盡可能一致，減少不必要誤差。但發(fā)病對(duì)照組病情總體是越來越嚴(yán)重，肝胰腺急性壞死，難于保持取樣一致。

弧菌病是影響對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)最為常見、危害較嚴(yán)重的一類疾病，隨著養(yǎng)殖業(yè)集約化程度的提高，養(yǎng)殖過程中的疾病也日趨嚴(yán)重，而弧菌病具有很強(qiáng)的傳染性，在對(duì)蝦越冬、人工育苗及成蝦養(yǎng)殖過程中，均有可能患上弧菌病，感染率可達(dá)100%，發(fā)病嚴(yán)重的蝦池病死率可高達(dá)90%以上[11]。

近年來弧菌病引起越來越多學(xué)者的廣泛關(guān)注，目前，對(duì)于弧菌病的防治主要采用抗生素，長期大量使用抗生素會(huì)帶來一系列嚴(yán)重后果：水環(huán)境污染，導(dǎo)致養(yǎng)殖環(huán)境惡化，生態(tài)平衡失調(diào)，妨礙水產(chǎn)動(dòng)物正常生長；耐藥性微生物大量出現(xiàn)等，易引起疾病的爆發(fā)和流行，且難于防控，使水產(chǎn)業(yè)蒙受巨大的經(jīng)濟(jì)損失[11]；弧菌病尚無有效防控措施。該試驗(yàn)所用的復(fù)方中草藥KFJ制劑，對(duì)弧菌病的防治效果顯著，有望成為“替代抗生素”比抗生素更好的新型中成藥，并對(duì)人類自身的健康以及畜牧業(yè)食品的安全具有重大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。