豬流行性腹瀉病毒Nsp5基因的原核表達及生物信息學分析

劉正奎，吳 瑗，陳 琳，王 磊，牟泓燁，祝徐航，王曉杜，*

(1.浙江農(nóng)林大學 動物科技學院，浙江 杭州 311300； 2.金華職業(yè)技術(shù)學院 農(nóng)業(yè)生物工程學院，浙江 金華321007)

豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)常感染3～10日齡仔豬，可引起該豬群發(fā)生豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea，PED)，臨床癥狀以急性腸炎和脫水致死為特征的高度傳染性疾病。PEDV感染豬群，仔豬發(fā)病率和死亡率都很高，一年四季均可發(fā)病，自2011年以來，新的變異毒株開始在各地紛紛流行[1-3]，現(xiàn)已出現(xiàn)在世界各個國家和地區(qū)[4-6]，給養(yǎng)豬業(yè)帶來嚴重的經(jīng)濟損失[7-8]。

豬流行性腹瀉病毒屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬α型冠狀病毒，其復制酶蛋白是由ORF1a和ORF1b基因編碼的PP1a和PP1ab前體蛋白，經(jīng)病毒編碼蛋白酶加工而成，形成至少16個非結(jié)構(gòu)蛋白(nonstructural proteins，NSPs)，從PP1a或PP1ab的氨基端起依次為Nsp1-16，這些蛋白在病毒的轉(zhuǎn)錄、復制、抗宿主細胞防御機制過程中發(fā)揮重要功能[9-10]。其中Nsp5被稱為3C樣蛋白酶[11]，是一種富含組氨酸和半胱氨酸的蛋白酶[12]，該蛋白酶具有切割活性，可以將多聚前體蛋白PP1ab切割為成熟的非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp4-16[11]。除了具有切割活性外，還發(fā)現(xiàn)Nsp5是一種干擾素的拮抗分子[13]，同時在病毒復制過程中，對N蛋白進行加工修飾，調(diào)節(jié)PEDV對宿主細胞的適應性[14]。因此，研究PEDV的Nsp5蛋白結(jié)構(gòu)及相關(guān)功能對了解該病毒的致病機理，開發(fā)新型抗病毒藥物具有重要意義。本研究通過克隆Nsp5基因，構(gòu)建原核表達載體，在大腸埃希菌進行表達，同時利用生物信息學軟件進行結(jié)構(gòu)預測分析，為解析Nsp5的功能提供生物材料和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

PEDV/LY/2014/04分離株來自臨床腹瀉樣本，由本實驗室分離得到，保存于浙江農(nóng)林大學動物預防醫(yī)學與公共衛(wèi)生實驗室；pET-28a(+)載體由本實驗室保存。

1.2 主要試劑

E.coliDH5α和BL21(DE3)感受態(tài)細胞購自天根生化科技(北京)有限公司；T4連接酶、限制性內(nèi)切酶SalI和EcoRⅠ購自NEB公司；質(zhì)粒小提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；KOD plus Neo購自TOYOBO公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 引物設計與合成

依據(jù)豬流行性腹瀉病毒CV777疫苗株全基因組序列(GenBank:KT323979)，利用序列比對方法，找到編碼Nsp5的基因，使用DNAStar中的Primer Select軟件進行Nsp5基因片段的引物設計。設計一對擴增Nsp5基因的特異性引物，上下游引物兩端添加EcoRⅠ和SalⅠ酶切位點，擴增片段大小為616 bp。引物由上海生工生物工程有限公司合成，如表1。

1.3.2Nsp5基因擴增

采用TRIZOL法提取PEDV/LY/2014/04分離株的RNA，隨機引物反轉(zhuǎn)錄得到其cDNA，以此cDNA為模板進行目的片段Nsp5的PCR擴增。PCR擴增體系：rTaqMix 10 μL，dd H2O 6 μL，上下游引物各1 μL，cDNA模板2 μL，共20μL。PCR擴增條件：預變性94 ℃ 3 min；94 ℃變性45 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

表1Nsp5基因擴增引物及鑒定引物

Table1Nsp5 gene amplification primers and identification primers

引物名稱Primer name引物序列Primer sequence(5’-3’)目的片段大小Product size/bpNsp5-FwdCCGGAATTCATGTTGCAGAGTGTTGCATCTACTTATGTAG616Nsp5-RevGACGTCGACTCACTGGAGCTTAACAATACGCTCACNsp5-FwdCCGGAATTCATGTTGCAGAGTGTTGCATCTACTTATGTAG705T7-TerminalGCTAGTTATTGCTCAGCGG

1.3.3 重組質(zhì)粒pET-28a(+)-Nsp5構(gòu)建

利用膠回收試劑盒將Nsp5擴增片段純化回收，利用EcoRⅠ和SalⅠ進行雙酶切，同時用EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切pET-28a(+)載體，酶切結(jié)束電泳后切膠回收，兩種酶切產(chǎn)物按照適宜比例，利用T4連接酶在16 ℃過夜連接。連接產(chǎn)物經(jīng)熱擊法轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細胞，涂布卡那霉素的平板，37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取單個菌落進行菌落PCR鑒定。鑒定呈陽性的菌落經(jīng)擴大培養(yǎng)后，質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，再進行EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切鑒定，酶切鑒定正確的克隆送交上海生工生物有限公司進行測定驗證。測序驗證正確的重組質(zhì)粒命名pET-28a(+)-Nsp5。

1.3.4 His-Nsp5重組蛋白的誘導表達

將1.3.3節(jié)構(gòu)建正確的pET-28a(+)-Nsp5重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細胞，涂布于含卡那霉素抗性的LB平板，37 ℃過夜培養(yǎng)，分別挑選3～5個單菌落于LB液體培養(yǎng)基，37 ℃、220 r·min-1培養(yǎng)12～16 h，以此為種子液。種子液按照體積比1∶100轉(zhuǎn)接液體LB培養(yǎng)基里，當菌液的D600值在0.5～0.6時，取1 mL菌液作為誘導前樣品，加入終濃度為1 mmoL·L-1的IPTG，在37 ℃、200 r·min-1進行誘導表達，誘導6 h后取1 mL菌液作為誘導后樣品，所取樣品處理后進行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍染色后分析重組Nsp5蛋白表達情況。

1.3.5 His-Nsp5重組蛋白的純化

小量表達驗證成功的克隆，擴大培養(yǎng)后進行大量誘導，收集大量誘導表達菌體后，用PBS緩沖液重懸，冰浴超聲破碎30 min，離心收集包涵體沉淀。包涵體沉淀經(jīng)尿素溶解后，在4 ℃、12 000 r·min-1離心25 min，上清移至新的離心管；將上清與平衡過的鎳柱在4 ℃結(jié)合3～4 h，待結(jié)合液流出，加入30 mL 50 mmoL·L-1咪唑洗除雜蛋白，然后緩慢持續(xù)地加入5 mL 400 mmoL·L-1咪唑洗脫目的蛋白，收集洗脫下來的目的蛋白，酶標儀測定蛋白濃度，純化得到的蛋白加入等體積100%甘油，保存于-80 ℃?zhèn)溆?。純化后目的蛋白進行SDS-PAGE電泳，分析His band Ni+純化后重組蛋白的純度和表達量。

1.3.6 Nsp5蛋白質(zhì)的生物信息學分析

Vector NTI Advance 軟件對Nsp5蛋白質(zhì)的化學性質(zhì)進行理論分析(包括分子質(zhì)量、等電點以及氨基酸組成等)，ProtScale(http://web.Expasy.org/protscale/)分析Nsp5蛋白質(zhì)的親水性與疏水性，ABCpred服務器在線分析了Nsp5蛋白的B細胞潛在抗原表位，SOPMA服務器在線分析了Nsp5蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預測，Phyre2.0(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/ phyre2/html/page.cgi？id=index)預測分析Nsp5蛋白質(zhì)的3D結(jié)構(gòu)，Raswin軟件初步預測了Nsp5蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 Nsp5基因的PCR擴增及重組表達載體的PCR鑒定

PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳顯示，大小約616 bp，與預期大小相符(圖1)。將Nsp5的PCR產(chǎn)物和載體pET-28a(+)用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和SalⅠ進行雙酶切之后，經(jīng)T4連接酶連接，熱擊轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞中，得到重組載體pET-28a(+)-Nsp5。通過PCR的方法，鑒定引物為目的基因的上游引物Nsp5-Fwd和載體pET-28a(+)的T7-Terminal引物(表1)，同時通過雙酶切(EcoRⅠ和SalⅠ)鑒定的方法，篩選并驗證得到陽性克隆(圖2)。陽性克隆送生物公司測序，序列比對結(jié)果表明，該序列與GenBank的PEDV毒株(KM213245)同源性高達99%，且編碼框插入正確。

2.2 重組蛋白的誘導表達及鑒定

將重組質(zhì)粒pET-28a(+)-Nsp5轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細胞中，經(jīng)IPTG誘導，SDS-PAGE分析結(jié)果顯示，在誘導后樣品泳道出現(xiàn)了特異性蛋白表達，其分子質(zhì)量約為22 ku，與預期大小相符(圖3)。針對誘導后的包涵體沉淀，采用His band Ni+柱進行純化，所得樣品進行SDS-PAGE檢測，結(jié)果獲得純度達到70%以上的重組蛋白(His-Nsp5)。

M，DL 2000 bp DNA標準分子量；1，陰性對照；2，Nsp5基因PCR擴增產(chǎn)物。M， DL 2000 bp DNA marker; Lane 1， Negative control; Lane 2， Nsp5 gene PCR products.圖1 Nsp5基因PCR擴增結(jié)果Fig.1 Agarose gel electrophoresis of Nsp5 PCR products

M，DL 2000 bp DNA 標準分子量；1，pET-28a(+)-Nsp5經(jīng)EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切產(chǎn)物。M， DL 2000 bp DNA marker; Lane 1， pET-28a(+)-Nsp5 digested by EcoRⅠ and SalⅠ.圖2 pET-28a(+)-Nsp5雙酶切鑒定Fig.2 Identification of recombinant pET-28a(+)-Nsp5 plasmid by double enzyme digestion

M，低分子量標準蛋白質(zhì)Marker；1，pET-28a(+)-Nsp5未經(jīng)IPTG誘導全菌樣品；2，pET-28a(+)-Nsp5經(jīng)IPTG誘導后全菌樣品；3-5，pET-28a(+)-Nsp5包涵體純化后蛋白濃度由低到高的樣品。M， Low molecular weight standard protein marker; Lane 1， Non-induced pET-28a(+)-Nsp5; Lane 2: IPTG induced pET-28a(+)-Nsp5; Lane 3-5， Different concentrations of purified protein.圖3 Nsp5蛋白表達產(chǎn)物SDS-PAGE電泳Fig.3 SDS-PAGE analysis of Nsp5 protein expression

2.3 豬流行性腹瀉病毒Nsp5蛋白質(zhì)的生物信息學分析

2.3.1 理化性質(zhì)

豬流行性腹瀉病毒的Nsp5的基因含有1個由591 bp組成的開放閱讀框，編碼196個氨基酸殘基組成的多肽，其中A+T=55.50%、C+G=44.50%，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的理論值為21 820.07 u，理論等電點(pI)為8.734，在正常生理狀態(tài)下，該蛋白帶正電荷；原子組成是C954H1553N275O291S9；正電荷殘基共有(Lys+Arg)24個，負電荷殘基(Asp+Glu)21個。該蛋白質(zhì)由16種氨基酸組成，其中Val、Ala、Ser、Arg的含量相對較多，Cys、Phe、Trp相對較少。不穩(wěn)定系數(shù)(instability index)為42.90，表明這個蛋白質(zhì)性質(zhì)不穩(wěn)定。脂肪系數(shù)為95.97，總平均親水性為-0.214。親水性分析結(jié)果表明該蛋白質(zhì)是親水蛋白質(zhì)(圖4)。

2.3.2 Nsp5蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)預測

SOPMA服務器預測結(jié)果顯示，該蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)骨架(圖5)組成包含：α-螺旋(h)占55.61%、β-折疊(t)占7.65%、無規(guī)則卷曲(c)占20.92%、延伸鏈(e)占15.82%。利用Phyre2.0蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預測服務器(使用Intensive選項)對Nsp5白質(zhì)進行三級結(jié)構(gòu)預測，結(jié)果顯示，所得結(jié)構(gòu)有較多的α-螺旋和無規(guī)則卷曲(圖6)，結(jié)合圖5的結(jié)果，三級結(jié)構(gòu)預測和二級結(jié)構(gòu)預測基本一致。

2.3.3 Nsp5蛋白質(zhì)B細胞表位預測

應用ABCpred服務器對Nsp5蛋白的B細胞潛在抗原表位進行預測(閾值設定為0.51，窗口大小設定為16)，結(jié)果如表2： Nsp5蛋白共有15個潛在的B細胞抗原表位，其中41—56位aa得分最高(結(jié)果按得分降序排列，得分越高則意味著是目的肽段的可能性越大)，PEDV感染豬群的血清中可能存在特異性抗體。

3 討論

作為冠狀病毒復制啟始的主要蛋白酶，Nsp5不僅在病毒非結(jié)構(gòu)蛋白加工方面發(fā)揮重要作用，而且參與酶解宿主蛋白[15]、RNA結(jié)合以及病毒復制等過程[16-17]，Zhu等[18]報道豬流行性腹瀉病毒3C樣蛋白酶通過切割NEMO調(diào)節(jié)其干擾素β拮抗作用，因此一直被認為是開發(fā)抗冠狀病毒藥物的有效靶標[19]。本研究通過利用pET-28a(+)原核表達系統(tǒng)，成功構(gòu)建并在E.coliBL21(DE3)中誘導表達了PEDV/LY/2014/04分離株的重組His-Nsp5蛋白，利用生物信息學軟件分析該蛋白，為今后該病的診斷技術(shù)和免疫機制研究提供重要的基礎信息。

圖4 Nsp5蛋白質(zhì)的親水性與疏水性分析Fig.4 Hydrophilicity and hydrophobicity analysis of Nsp5 protein

圖5 Nsp5蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)模擬圖Fig.5 Simulated secondary structure of protein Nsp5

圖6 Nsp5蛋白質(zhì)3D構(gòu)象預測Fig.6 Prediction of the 3D structure of protein Nsp5

表2PEDV/LY/2014/04分離株Nsp5的B細胞表位預測

Table2Prediction of B cell epitopes of PEDV/LY/2014/04 isolateNsp5

序號No.B細胞抗原表位潛在序列B cell epitope potential sequence位置Position/aa得分Score1HAMNVAKSEFDREAST41-560.952NARQQYEDAVNNGSPP18-330.863IWNIIDIKDNDGKVVH154-1690.854VGLPSYVIYENARQQY8-230.835TSDIDSYNRIQREGCV133-1480.826AAAQMYKEARAVNRKS67-820.817VVHVKEVTAQNAESLS167-1820.818DMSSVDTILNLAKDGV100-1150.819NRIQREGCVHYAGTIW140-1550.7810IKDNDGKVVHVKEVTA160-1750.7611VVSAMHSLLFGMLRRL84-990.7312DREASTQRKLDRMAEQ51-660.7313AESLSWPLVLGCERIV178-1930.7014DGVVPLSVIPAVSATK113-1280.6915GSPPQLVKQLRHAMNV30-450.58

運用結(jié)構(gòu)基因組學研究方法，基因克隆、蛋白質(zhì)純化、晶體的篩選和晶體衍射數(shù)據(jù)的收集，構(gòu)建出病毒晶體結(jié)構(gòu)，是研究PEDV 3C樣蛋白酶結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵技術(shù)。St. John等[12]通過X射線晶體衍射的技術(shù)分析了3C樣蛋白酶的空間結(jié)構(gòu)，3C樣蛋白酶在空間群P212121中結(jié)晶為不對稱單元的二聚體。如人類冠狀病毒229E 3C樣蛋白酶[20]和SARS 3C樣蛋白酶[21]所報道的一樣，PEDV 3C樣蛋白酶是在每個單體中含有三個結(jié)構(gòu)域的同型二聚體，含有由殘基Cys144和His41形成的二元催化體系，其活性位點位于結(jié)構(gòu)域Ⅰ和Ⅱ之間的裂縫中，結(jié)構(gòu)域Ⅲ參與單體二聚化，其最終負責形成蛋白酶的活性[22]。正是因為研究者解析了該蛋白的結(jié)構(gòu)，發(fā)展了許多3C樣蛋白酶抑制劑，很多抑制劑能有效抑制冠狀病毒的復制[19,23]。

PEDV的Nsp5基因序列比對分析表明，Nsp5基因是PEDV基因組中比較保守的區(qū)段，保證了其功能正確實施。PEDV的Nsp5分子質(zhì)量理論值為21 820.07 u，理論等電點(pI)為8.734；具有多個高親水性區(qū)域，屬于親水蛋白質(zhì)；SOPMA服務器(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html)是常用的蛋白質(zhì)預測二級結(jié)構(gòu)在線工具，該工具可以預測蛋白二級結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)序列中的復雜基序、構(gòu)建蛋白質(zhì)的3D模型，Nsp5則主要由α-螺旋和無規(guī)則卷曲構(gòu)成；Phyre2.0蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預測服務器(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/ phyre2/html/page.cgi？id=index)主要用于蛋白質(zhì)的3D結(jié)構(gòu)和高級結(jié)構(gòu)，Nsp5則主要由螺旋結(jié)構(gòu)構(gòu)成。ABCpred服務器(http://crdd.osdd.net/raghava/abcpred/)是采用機器學習算法，依賴于Bcipep數(shù)據(jù)庫，對固定長度的多肽進行B細胞表位預測，Nsp5蛋白共有15個潛在的B細胞抗原表位，原核表達產(chǎn)物可作為設計新型疫苗的靶標，也可作為檢測PEDV病毒抗體的ELISA檢測方法的包被抗原，可以判定是否存在PEDV的感染。

本研究開展了Nsp5蛋白的原核表達，對其理化性質(zhì)、B細胞抗原表位、高級結(jié)構(gòu)預測方面進行了生物信息學分析，為Nsp5蛋白的研究提供了基本數(shù)據(jù)資料，可為后續(xù)深入探討Nsp5蛋白在豬流行性腹瀉病毒復制過程中的作用機理研究奠定一定的基礎，也為進一步開展PEDV的診斷技術(shù)及免疫學研究奠定了基礎。