四川地區(qū)養(yǎng)殖錦鯉浮腫病毒檢測與系統(tǒng)進化分析

康慧敏，何嘉樂，劉晨愷，周瑤佳，耿 毅，歐陽萍

(四川農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院，四川 成都 611130)

鯉浮腫病(carp edema virus disease，CEVD)是由鯉浮腫病毒(carp edema virus，CEV)引起的鯉科魚類死亡的一種病毒性傳染病，病魚的典型癥狀為糜爛性或出血性皮膚損傷，腮壞死，皮下組織腫脹，凹眼等[1]，病魚具有明顯的反應遲鈍、嗜睡等特征，所以又稱為鯉魚睡眠病(koi sleep disease，KSD)[2]。CEV具有很高的特異性，目前的研究發(fā)現(xiàn)該病毒僅感染錦鯉和鯉魚，導致魚類死亡，幼年鯉魚死亡率高達60%～100%[3]。鯉浮腫病給全球淡水養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失[4-10]。2015年中國報道鯉浮腫病毒病[11-13]，由于其臨床癥狀與錦鯉皰疹病毒病(koi herpes virus disease，KHVD)相似，在生產(chǎn)中很容易被誤診。鯉水腫病是繼錦鯉皰疹病毒病之后，又一個對淡水漁業(yè)造成巨大威脅的病毒性傳染病。

2017年10月，四川某養(yǎng)魚場錦鯉暴發(fā)一種以嗜睡、腹部腫大、鰓腫脹和眼睛凹陷為臨床特征的傳染病，發(fā)病水溫為18～23 ℃，累計死亡率為50%。為研究此次疾病的病因和流行發(fā)病規(guī)律，將病魚解剖，通過細菌學和寄生蟲檢查、病理組織觀察、PCR鑒定、電鏡觀察和系統(tǒng)進化分析，為鯉浮腫病毒的起源進化、分類、疾病診斷和防控提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來源

病魚采自四川省某錦鯉養(yǎng)殖場，瀕臨死亡錦鯉4條，死亡不久的錦鯉2條，編號為1～6。

1.2 主要試劑

大腸埃希菌DH5α由四川農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院魚病研究中心實驗室保存提供?？寺≥d體PMD19-T購自美國Invitrogen公司；病毒DNA提取試劑盒、小劑量質粒抽提試劑盒、pMD19-T質粒連接試劑盒、組織DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒和2×PCR Master Mix購自美國TaKaRa公司。

1.3 臨床癥狀與組織病理學觀察

觀察魚池內患病錦鯉的行為特征，對病魚樣品的鰓、體表、眼、鰭條、肛門等部位進行表觀癥狀觀察。解剖病魚，觀察內臟器官的變化，采集鰓和腎臟樣品，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

采集病魚的鰓、肝臟、腦、脾臟、腎臟等組織樣本，10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟切片，蘇木精-伊紅(HE)染色，中性樹膠封片后置于光學顯微鏡下觀察。

1.4 細菌分離與寄生蟲檢測

無菌條件下，從病魚肝臟、脾臟和腎臟取樣于BHIA平板上劃線接種，28 ℃恒溫培養(yǎng)24～48 h，觀察細菌生長狀況。采集病魚的鰓絲、血液和體表黏液分別進行鰓絲壓片、血液和體表黏液涂片觀察，在光學顯微鏡低倍鏡下進行寄生蟲檢測。

1.5 PCR檢測

采集病魚的鰓和腎臟，按照組織DNA提取試劑盒操作說明提取基因組DNA。提取的DNA分別用于檢測錦鯉皰疹病毒(koi herpes virus，KHV)、鯉浮腫病毒(carp edema virus，CEV)、鯉春病毒血癥病毒(spring viremia of carp virus， SVCV)。根據(jù)世界動物衛(wèi)生組織(OIE)推薦檢測KHV的Sph基因進行PCR擴增；參考文獻[14]進行CEV引物設計及巢氏PCR反應；參考文獻[15]進行SVCV檢測，使用引物SVCV_F1和SVCV_R2擴增SVCV糖蛋白基因714 bp的DNA片段后，再用引物SVCV_F1和SVCV_R4經(jīng)半嵌套式PCR擴增出606 bp的DNA片段。

1.6 電鏡觀察

取病魚腎臟于2.5%戊二醛磷酸鹽緩沖液保存，用磷酸緩沖液漂洗4 h以上，再用1%鋨酸溶液固定，梯度乙醇脫水后，采用環(huán)氧樹脂包埋劑進行浸透，并于65 ℃中聚合24～58 h。將聚合好的樣本超薄切片，在透射電鏡下觀察[16]。

1.7 CEV P4a基因克隆測序及系統(tǒng)發(fā)育分析

PCR產(chǎn)物按照DNA純化試劑盒操作說明書純化后，連接到pMD19-T載體上，轉化大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細胞中。培養(yǎng)24 h后，挑取單個菌落進行PCR篩選陽性菌株，提取質粒送上海生物工程有限公司進行序列測定。根據(jù)GenBank收錄的CEV英國株和波蘭株的P4a基因序列，使用DNAstar生物學軟件Megalign方法進行序列同源性分析，并通過MEGA6鄰接法構建系統(tǒng)進化樹進行遺傳進化分析。

表1PCR擴增引物

Table1Primers for PCR amplification

引物名稱Primer name序列Sequence(5′-3′)長度Length/bpKHV_F1GACACCACATCTGCAAGGAG292KHV_R1GACACATGTTACAATGGTCGCCEV_F1ATGGAGTATCCAAAGTACTTAG528CEV_R1CTCTTCACTATTGTGACTTTGCEV_F2GTTATCAATGAAATTTGTGTATTG478CEV_R2TAGCAAAGTACTACCTCATCCSVCV_F1 TCTTGGAGCCAAATAGCTCARRTC714SVCV_R1AGATGGTATGGACCCCAATACATHCANCAYSVCV_F1 TCTTGGAGCCAAATAGCTCARRTC606SVCV_R4 CTGGGGTTTCCNCCTCAAAGYTGY

2 結果與分析

2.1 臨床癥狀及解剖觀察

發(fā)病錦鯉主要的臨床癥狀為食欲減退，嗜睡或在池塘邊的水面上緩慢、漫無目的游動，遇到驚嚇后迅速蘇醒，游一段距離后很快陷入沉睡，魚體出現(xiàn)身體腫脹，體表出現(xiàn)潰爛，眼球、腹部充血，單側或雙側眼球渾濁，鰓絲腫脹、出血甚至壞死，肝脾腎等器官無明顯異常(圖1)。

2.2 組織病理學觀察

通過組織病理學觀察，患病錦鯉鰓小片間上皮細胞大量增生，呼吸上皮出現(xiàn)脫落和壞死，鰓小片的間隙消失發(fā)生粘連(圖2-A)；肝細胞變性腫脹，部分肝細胞壞死(圖2-B)；腦組織可見大量淋巴細胞浸潤，神經(jīng)元細胞變性壞死(圖2-C)，可見管套現(xiàn)象和噬神經(jīng)元現(xiàn)象，腦膜發(fā)生增厚和充血，表現(xiàn)為增生性腦膜炎(圖2-D)；腎小管上皮細胞腫脹變性，壞死脫落至管腔中，腎間質中有大量巨噬細胞和單核細胞浸潤(圖2-E)；脾臟病變不明顯，有輕微出血現(xiàn)象(圖2-F)；心臟和肌肉組織未見明顯病理改變。

A，患病錦鯉出現(xiàn)KSD典型癥狀，如嗜睡，側身躺著不動；B、C，患病錦鯉身體腫脹(白色箭頭為正常錦鯉，黑色箭頭所指為患病錦鯉)；D，體表出現(xiàn)潰瘍；E，眼睛充血，眼球渾濁；F，鰓絲腫脹。A， The diseased koi had typical symptoms of KSD， such as lethargy， lying on its side; B and C， The body swelling of the diseased koi (the white arrow was normal koi and the black arrow refered to sick koi); D， Ulcers on the body surface; E， Hyperemia of eyes and turbidity of eyeball; F， Branchial swelling.圖1 患病錦鯉臨床病變Fig.1 Clinical pathological changes of diseased koi carp

2.3 細菌和寄生蟲檢測

BHIA培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h(28 ℃)上未見菌落生長。鰓絲壓片、血液和體表黏液涂片觀察均未發(fā)現(xiàn)寄生蟲。推測患病鯉魚不是被已知能在BHIA生長的常見致病菌(鏈球菌、氣單胞菌、耶爾森菌、弧菌等)或寄生蟲感染而引發(fā)死亡。

A，鰓小片發(fā)生粘連，細胞增生，呼吸上皮細胞出現(xiàn)脫落和壞死；B，肝臟細胞出現(xiàn)空泡變性和壞死；C，腦組織可見大量淋巴細胞浸潤，毛細血管擴張充血；D，腦膜發(fā)生增厚和充血；E，腎臟炎性細胞浸潤，細胞出現(xiàn)變性和壞死；F，脾臟有輕微出血。A， Adhesion of gill fragments， proliferation of cells， exfoliation and necrosis of respiratory epithelial cells; B， Necrosis and vacuolar degeneration of liver cells; C， A large number of lymphocytes infiltration in the brian tissue， capillary congestion expansion; D， Meningeal thickening and hyperemia; E， Renal inflammatory cell infiltration， cell degeneration and necrosis; F， Slight bleeding in the spleen.圖2 患病錦鯉組織病理學觀察Fig.2 Histopathological observation of koi infected by CEV

2.4 PCR檢測

分別采集1～6組中錦鯉的鰓絲，通過組織DNA提取試劑盒提取組織DNA，進行PCR檢測。根據(jù)臨床癥狀和流行情況，首先使用OIE推薦的KHV和SVCV引物進行檢測，1～6組樣品均為陰性。通過巢氏PCR檢測方法，進行了CEV檢測，第一步PCR反應擴增出528 bp的特異性條帶(圖3-A)，第二步PCR反應以第一步的PCR產(chǎn)物為模板，擴增出478 bp DNA片段(圖3-B)，檢測結果為CEV陽性?；驕y序結果顯示該序列與CEV同源性高達99%，因此可診斷該錦鯉養(yǎng)殖區(qū)存在CEV感染。

2.5 電鏡觀察

透射電鏡下觀察腎臟超薄切片，在腎臟組織中可見大量痘病毒樣病毒顆粒，直徑為200～240 nm，有囊膜。病毒大小、形狀和結構，符合痘病毒科的特征(圖4)。

2.6 序列分析與進化樹構建

對巢氏PCR擴增產(chǎn)物(P4a基因)進行測序并分析，將序列上傳到GenBank得到的序列號為MG787230。根據(jù)P4a基因的部分核苷酸序列，對英國和波蘭的19條具有代表性的CEV序列進行了多重比對和系統(tǒng)發(fā)育分析。結果表明，本次試驗分離到的病毒株與英國株R083和CyPP-3的同源性最高，分別為99%和98%(圖5)。通過進化樹發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有CEV毒株主要分為2個基因型。

M，DL1000 marker；1，陰性對照；2～7，第1～6號樣品。M， DL 1000 DNA marker; 1， Negative control；2-7， Samples of 1 to 6.圖3 CEV巢氏PCR檢測結果Fig.3 Nested-PCR detection results of CEV

箭頭所示為病毒粒子。The arrow showed viral particles.圖4 電子顯微鏡下的腎組織中的病毒粒子Fig.4 Ultrathin sections of the kidney under the electronic microscope

3 討論

鯉浮腫病是一種嚴重危害鯉養(yǎng)殖業(yè)的疾病，我國各地均有報道[12-13，16]。2017年10月，四川省某養(yǎng)魚場錦鯉出現(xiàn)大量死亡，養(yǎng)殖場水溫18～23 ℃。基于臨床癥狀、組織病理觀察、寄生蟲和細菌學檢測，排除了致病性細菌和寄生蟲感染的可能性，由于KHVD和SVCV都具有相似的臨床癥狀及發(fā)病水溫[17-18]，同時進行了KHV、SVC、CEV病毒PCR檢測。KHV和SVC的PCR檢測結果皆為陰性，巢氏PCR方法檢測鯉浮腫病毒(CEV)，出現(xiàn)特異性擴增產(chǎn)物，且在腎臟組織中可見大量痘病毒樣病毒顆粒，直徑200～240 nm，有囊膜，病毒大小、形狀和結構符合痘病毒科的特征?；贑EVP4a基因進行系統(tǒng)進化樹分析，結果表明本次試驗分離到的病毒株與英國株R083同源性最高為99%，證實CEV為引發(fā)此次四川地區(qū)某養(yǎng)魚場錦鯉發(fā)病的病原。

圖5 基于CEV P4a基因序列構建的系統(tǒng)進化樹Fig.5 Phylogenetic tree construction based on CEV P4a gene sequence

在患病錦鯉臨床癥狀和組織病理觀察中，可見呼吸上皮出現(xiàn)脫落和壞死，鰓和腎臟是主要的病變部位，與國內外的報道相符。溫智清等[13]報道，患病錦鯉每250 ng鰓和腎臟組織中CEV病毒載量為250.02～1 332.92，遠超其余組織。Ono等[4]報道，鰓是CEV的主要靶器官，皮膚、肝臟、腎臟偶爾也可檢測到病毒，患病鯉魚呼吸上皮嚴重損傷導致缺氧，患病鯉魚出現(xiàn)嗜睡癥狀，表現(xiàn)為側身浮于水中或在水面上漫游，最終死亡。

CEV特異性很高，主要感染鯉魚和錦鯉，一般魚類細胞難以分離到該病毒。在生產(chǎn)中，由于CEVD和KHVD臨床癥狀容易混淆，因此，探究CEV的流行現(xiàn)狀、流行株的基因型并進行CEV的診斷和防控具有重要意義。本研究可為CEV進化、分類、疾病診斷和防控提供重要依據(jù)。