海洋放線菌Streptomyces koyangensis SCSIO 5802中多烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素candicidin生物合成基因簇的分析鑒定

涂佳佳，鞠建華，付少彬，李青連

(1.遵義醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院藥物化學(xué)教研室， 貴州 遵義 563099；2.中國科學(xué)院南海海洋所 中國科學(xué)院熱帶海洋資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510301)

微生物產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)復(fù)雜且種類繁多，因其具有顯著的抗感染、抗腫瘤、抗氧化和抗蛋白酶等活性，是當(dāng)前創(chuàng)新藥物開發(fā)和新功能酶挖掘的重要資源[1-5]。聚酮類次級(jí)代謝產(chǎn)物中多烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素(polyene marcrolides)，是臨床上用于治療由真菌引起的全身性或者淺表性局部感染的重要藥物，其作用機(jī)理是通過與真核細(xì)胞膜中的甾醇相互作用而形成跨膜通道，使膜分解或增加膜通透性引起小分子和離子的泄漏并隨之導(dǎo)致細(xì)胞死亡。Candicidin(又名FR-008)是從灰色鏈霉菌(Streptomycesgriseus)中獲得的七烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，研究表明它對(duì)包括白色念珠菌、灰葡萄孢，白色念珠菌，新型隱球菌，小孢霉菌，Sporotrichumschenckii和紅色毛癬菌等在內(nèi)的病原真菌具有顯著的抑制活性[6]，是抗感染藥物開發(fā)的重要先導(dǎo)化合物。

多烯大環(huán)內(nèi)酯類化合物通常是由I型聚酮合成酶(polyketide synthase,PKS)及其相關(guān)的修飾酶負(fù)責(zé)合成[7-8]，典型的I型PKS，每個(gè)模塊至少含有由縮合酶(ketosynthase,KS)、?；D(zhuǎn)移酶(acyl transferase,AT)和?；d體蛋白(acyl carrier protein,ACP)3個(gè)結(jié)構(gòu)域。除了以上3個(gè)基本結(jié)構(gòu)域外，許多延伸模塊中往往還包含有酮基還原酶(ketoreductase,KR)，脫水酶(dehydrase,DH)和烯?；€原酶(enoysynthase,ER)等結(jié)構(gòu)域。這些結(jié)構(gòu)域的存在決定了延伸酰基鏈上β-酮基的還原加工程度，其中，KR催化β-酮基還原為羥基；DH能夠以還原生成的羥基為基點(diǎn)，催化在延伸骨架中生成α-β位間的不飽和雙鍵，這正是多烯結(jié)構(gòu)上共軛雙鍵生成的最主要途徑；而ER則能夠進(jìn)一步還原α-β位間的不飽和雙鍵而生成飽和脂肪鏈，相關(guān)結(jié)構(gòu)域在多烯大環(huán)結(jié)構(gòu)中比較少見。

筆者所在的課題組一直致力于海洋放線菌活性次級(jí)代謝產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)及其生物合成機(jī)制的研究，已獲得多種具有良好生物活性的化合物，例如Song等[9]和Huang等[10]從海洋放線菌StreptomyceskoyangensisSCSIO 5802中分離得到9個(gè)多環(huán)聚酮類化合物abyssomicins，發(fā)現(xiàn)該類化合物具有抑制耐甲氧西林金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)以及HIV-1病毒調(diào)節(jié)活性。利用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)對(duì)S.koyangensisSCSIO 5802菌株的發(fā)酵液進(jìn)行深入分析，發(fā)現(xiàn)該菌株的代謝物非常豐富，除了生產(chǎn)abyssomicins外，還生產(chǎn)一系列分子量較大的(>500)的待分離鑒定次級(jí)代謝產(chǎn)物。但是由于主產(chǎn)物abyssomicins類化合物生產(chǎn)旺盛、產(chǎn)量很高，影響了其他結(jié)構(gòu)新穎但產(chǎn)量較低的代謝產(chǎn)物的分離和結(jié)構(gòu)鑒定。因此，本文在前期實(shí)驗(yàn)[11]的基礎(chǔ)上，利用定向遺傳改造的方法，構(gòu)建了不生產(chǎn)abyssomicin類化合物的聚酮合成酶基因abmB1的同框缺失突變株，阻斷了主要次級(jí)代謝產(chǎn)物abyssomicins的生產(chǎn)，改變菌株的代謝流以增加微量次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成前體供應(yīng)，從該突變株發(fā)酵液中鑒定了真菌多烯大環(huán)內(nèi)酯類化合物candicidin，并對(duì)其生物合成基因簇進(jìn)行了鑒定，推導(dǎo)了其生物合成聚酮骨架的組裝過程，最后通過對(duì)該化合物的生物合成PKS基因的缺失，對(duì)該生物合成基因簇進(jìn)行了確認(rèn)。本研究結(jié)果將為利用組合生物合成的方法獲得candicidin新結(jié)構(gòu)衍生物以及基于基因組信息的新型天然產(chǎn)物挖掘奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種、質(zhì)粒及引物 本研究所用的菌株、質(zhì)粒及引物見表1。

表1本研究所用的菌株，質(zhì)粒及引物

菌株及引物相關(guān)特性來源大腸桿菌E.coliE. coli DH5a普通克隆載體宿主菌TransGeneE.coliET12567/pUZ8002接合轉(zhuǎn)移供體菌,KanR,CmlRMacNeilet al., 1992E.coliBW25113/pIJ790PCR-targeting宿主菌, CmlRDatsenkoWanner 2000鏈霉菌StreptomycesStreptomyces koyangensisSCSIO 5802野生型生產(chǎn)菌株本研究ΔabmB1abmB1基因被同框缺失突變后構(gòu)建的突變株本研究ΔcanDcanD基因抗性替換后構(gòu)建的突變株本研究質(zhì)粒9-7C含abmB1基因的粘粒本研究9-7C-19-7C中abmB1基因被Apr-oriT替換后獲得的粘粒本研究9-7C-29-7C-1中Apr-oriT被SpeI酶切后獲得的粘粒本研究9-7C-39-7C-2中neo基因被替換后獲得的粘粒本研究7-8F7-8F是canD基因的粘粒本研究引物abmB1-IFdel-F:5'-tacaagaccgctgcccctaccgctccgaccggggacagcactagtattccggggatccgtcgacc-3'本研究abmB1-IFdel-R:5'- cgccgtgtcgctgccgccctcgggtcgctggggcagcggactagttgtaggctggagctgcttc-3'abmB1-TF:5'- agccagtacggcgcattcc-3'本研究abmB1-TR:5'-tcagcgagtcgaagcccagtt-3'canD-Del-F: 5'-gcgcgcgtcgaggtgggcgagcagccgggcggcctgggcattccgggatccgtcgacc-3'本研究canD-Del-R:5'-gaggtgcccccgctcctgcgcggcctggtccgcacccgctgtaggctggagctgcttc-3'canD-Test-F:5'-cgcgatcgtcagcatgagct-3'本研究canD-Test-R:5'-ttgatcgccgcgataccgac-3'Primer A-F:5'- agggcgggttgcgtgta -3'本研究Primer A-R:5'- cgtctccttcggcctct -3'Primer B-F:5'- cttgaccgaccgaggagc -3'Primer B-R:5'- ggcaacaccagcatc -3'Primer C-F:5'- ggccaacaagctggtgct -3'Primer C-R:5'-cgggaggaagaggatgacga-3'

1.1.2 培養(yǎng)基 ①LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，NaCl 1%，瓊脂粉2%(固體培養(yǎng))，用于大腸桿菌的培養(yǎng)。②A1培養(yǎng)基：可溶性淀粉10 g/L，酵母提取物4 g/L，細(xì)菌學(xué)蛋白胨2 g/L，海鹽10 g/L，pH值7.2～7.4，瓊脂粉2%(固體培養(yǎng))，用于鏈霉菌的產(chǎn)孢培養(yǎng)。③MS培養(yǎng)基：黃豆粉(即大豆粉)20 g/L，甘露醇20 g/L，pH值7.2～7.4，瓊脂粉2%，用于大腸桿菌與鏈霉菌菌間的結(jié)合轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)。④RA培養(yǎng)基：麥芽提取物1%，玉米粉0.5%，可溶性淀粉2%，麥芽糖1%，葡萄糖1%，微量元素100 μL/L，海鹽3%，pH值7.2～7.4，CaCO30.2%(調(diào)完pH值后加)，用于鏈霉菌的液體發(fā)酵培養(yǎng)。

1.1.3 主要試劑與儀器 限制性核酸內(nèi)切酶、高保真DNA聚合酶PrimeStar、DNA連接酶和DNA標(biāo)準(zhǔn)品等購自TaKaRa公司；DNA回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)mega公司。其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純級(jí)產(chǎn)品。氨芐青霉素(Ampicillin，Amp)的工作終濃度為100 μg/mL，卡那霉素(Kanamycin，Kan)的工作終濃度為50 μg/mL。PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成，DNA測(cè)序由廣州擎科公司完成。PCR儀(nexus GSX1)、臺(tái)式大容量多功能冷凍離心機(jī)(MASTERCYCLER)、小型臺(tái)式高速離心機(jī)(centrifuge 5424)、Concentrator plus旋轉(zhuǎn)濃縮儀購自Eppendorf公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀購自Heidolph公司(BOROTA 4000)；凝膠成像系統(tǒng)購自Bio-Rad公司；高效液相色譜儀(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)購自Agilent公司(高壓液相色譜儀 Infinity 1260)。

1.2 方法

1.2.1S.koyangensisSCSIO 5802菌株基因組的生物信息學(xué)分析和基因注釋S.koyangensisSCSIO 5802菌株的基因組DNA提取、全基因組測(cè)序已經(jīng)報(bào)道[11]。本文在已獲得的S.koyangensisSCSIO 5802菌株全基因組序列基礎(chǔ)上，利用在線軟件antiSMASH 3.0(http://antismash.secondarymetabolites.org/)對(duì)基因組中可能的次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成基因簇進(jìn)行預(yù)測(cè)；利用FramePlot 4.0 beta (http://nocardia.nih.go.jp/fp4/)對(duì)開放閱讀進(jìn)行分析；并利用在線軟件BLASTP(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)對(duì)開放閱讀框的功能進(jìn)行注釋。

1.2.2 不生產(chǎn)abyssomicin類化合物的聚酮合成酶基因abmB1的同框缺失突變株5802A的構(gòu)建 在前期研究中，我們已經(jīng)利用λ-RED介導(dǎo)的PCR-targeting技術(shù)建立了S.koyangensisSCSIO 5802菌株的遺傳操作系統(tǒng)[12]。在本研究中，利用前期研究已經(jīng)篩選到的含有abyssomicin類化合物生物合成聚酮合成酶基因abmB1的粘粒9-7C[11]，對(duì)abmB1基因進(jìn)行同框缺失突變。

根據(jù)建立的遺傳操作系統(tǒng)，首先將粘粒9-7C導(dǎo)入到E.coliBW25113/PIJ790中，獲得重組菌株E.coliBW25113/PIJ790/9-7C，接種于LB培養(yǎng)基中于28oC培養(yǎng)，同時(shí)添加 L-阿拉伯糖誘導(dǎo)λ-red重組系統(tǒng)表達(dá)，并制備成感受態(tài)細(xì)胞。此外，同時(shí)利用表1中的引物abmB1-IFdel-F/R擴(kuò)增阿普拉霉素的抗性替換DNA片段acc(3)IV-oriT。通過電轉(zhuǎn)將純化的acc(3)IV-oriTDNA片段導(dǎo)入E.coliBW25113/PIJ790/9-7C感受態(tài)細(xì)胞中，使其發(fā)生重組，替換粘粒9-7C中相應(yīng)位置的abmB1基因，獲得重組質(zhì)粒9-7C1。利用SpeI對(duì)重組質(zhì)粒9-7C1進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)酚：氯仿進(jìn)行抽提和乙醇沉淀后，利用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5a，利用鑒定引物abmB1-TF/TR篩選丟失了阿普拉抗性基因片段acc(3)IV-oriT的重組粘粒9-7C2。重組粘粒9-7C2轉(zhuǎn)入E.coliET12567/pUZ8002中，并通過結(jié)合轉(zhuǎn)移導(dǎo)入到野生物型菌株S.koyangensisSCSIO 5802中，使其發(fā)生同源重組。首先利用含50 μg/mL阿普拉霉素的A1培養(yǎng)基篩選發(fā)生同源單交換的突變株，命名為5802AS。將該單交換突變?cè)诓缓剐缘腁1平板上進(jìn)行傳代培養(yǎng)5 d后，收集孢子并進(jìn)行適當(dāng)稀釋后涂布于不含抗性的A1平板上繼續(xù)培養(yǎng)5 d，挑選在無抗A1平板上生長(zhǎng)且在含50 μg/mL阿普拉霉素的A1平板上不生長(zhǎng)的單克隆菌株，經(jīng)PCR驗(yàn)證正確后，獲得雙交換同源重組突變株5802A。

1.2.3 Candicidin生物合成基因簇聚酮合酶型基因canD的抗性替換突變S.koyangensisSCSIO 5802基因組cosmid文庫在前期研究中已經(jīng)構(gòu)建完成[11]。本研究中為了篩選到覆蓋candicidin生物合成基因簇的粘粒，用于candicidin生物合成基因的敲除，設(shè)計(jì)了3對(duì)篩庫引物Primer A、 Primer B 和Primer C(見表1)對(duì)已構(gòu)建的S.koyangensisSCSIO 5802基因組cosmid文庫進(jìn)行篩選，獲得包含有canD基因的粘粒7-8F，用于canD基因的突變。

將篩選到的含canD基因的粘粒7-8F轉(zhuǎn)入E.coliBW25113/PIJ790中，獲得重組菌株E.coliBW25113/PIJ790/7-8F，接種于LB培養(yǎng)基中于28 ℃培養(yǎng)，同時(shí)添加 L-阿拉伯糖誘導(dǎo)λ-red重組系統(tǒng)表達(dá)，并制備成感受態(tài)細(xì)胞。此外，同時(shí)利用表1中的引物canD-Del-F/R擴(kuò)增阿普拉霉素的抗性替換DNA片段acc(3)IV-oriT。通過電轉(zhuǎn)將純化的acc(3)IV-oriTDNA片段導(dǎo)入E.coliBW25113/PIJ790/7-8F感受態(tài)細(xì)胞中，使其發(fā)生重組，替換粘粒9-7C中相應(yīng)位置的canD基因，獲得重組質(zhì)粒7-8F-DKO。將突變粘粒7-8F-DKO轉(zhuǎn)化到E.coliET12567/pUZ8002中，并通過結(jié)合轉(zhuǎn)移導(dǎo)入到不生產(chǎn)abyssomicin類化合物的同框基因缺失突變株5802AKO中，使其發(fā)生同源重組。通過阿普拉霉素(50 μg/mL)和卡那霉素(50 μg/mL)抗性篩選接合子，引物canD-Test-F/R進(jìn)行驗(yàn)證，獲得既不生產(chǎn)abyssomicin類化合物也不生產(chǎn)candicidin類化合物的基因突變株5802AC。

1.2.4S.koyangensisSCSIO 5802 野生菌及其突變株的發(fā)酵和HPLC分析 從A1平板上將S.koyangensisSCSIO 5802AC和S.koyangensisSCSIO 5802A菌株的孢子分別接入含有50 mL RA培養(yǎng)基的錐形瓶中， 28 ℃，200 rpm培養(yǎng)條件下?lián)u床培養(yǎng)7 d后100 mL丁酮萃取發(fā)酵液，濃縮后1 mL甲醇溶解，HPLC分析(A相：100%超純水和0.1%TFA；B相：100%乙腈和0.1%TFA。HPLC分析檢測(cè)波長(zhǎng)為365 nm；分析程序：為0～20 min，0%～65% B相；20～22 min，65%～100% B相；22～27 min，100%B相；27.1～30 min，0%B相)。

2 結(jié)果

2.1S.koyangensisSCSIO 5802代謝產(chǎn)物中candicidin化合物的鑒定 通過構(gòu)建S.koyangensisSCSIO 5802菌株中負(fù)責(zé)主代謝產(chǎn)物abyssomicin類化合物生物合成的聚酮合成酶基因abmB1的同框缺失突變株(見圖1)，阻斷主產(chǎn)物abyssomisin類化合物的生產(chǎn)將構(gòu)建成功的同框缺失突變株，命名為S.koyangensisSCSIO 5802A。與野生型菌株SCSIO 5802相比較，同框缺失突變株SCSIO 5802A不生產(chǎn)abyssomisin類化合物化合物，同時(shí)在 16 min-20 min之間產(chǎn)生了3個(gè)明顯的新峰 (見圖2A， 圖譜ii)。紫外/可見光圖譜分析發(fā)現(xiàn)，該類化合物具有相同的光譜，均含有3個(gè)明顯的最大吸收峰，分別在360 nm，380 nm和401 nm(見圖2B)處，與文獻(xiàn)報(bào)道的七烯大環(huán)內(nèi)酯類化合物的特征性紫外-可見吸收譜一致。多烯大環(huán)內(nèi)酯化合物具有特征性的三峰紫外吸收光譜，峰值最大值的波長(zhǎng)由共軛雙鍵的數(shù)量決定，其UV吸收光譜可用于鑒定多烯大環(huán)內(nèi)酯類化合物中共軛雙鍵的數(shù)目[13]，因此，同框缺失突變株SCSIO 5802A所產(chǎn)生的3個(gè)新化合物應(yīng)該屬于七烯大環(huán)內(nèi)酯類化合物。高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)分析發(fā)現(xiàn)這3個(gè)峰的分子量分別為1110.35,1108.34和1092.33(見圖3)，與已經(jīng)報(bào)道的七烯大環(huán)內(nèi)酯類化合物candicidin A3 (1110.59)，candicidin D (1108.57)和candicidin A1(1092.58) 的分子量一致[14-15]。因此本文所鑒定的3個(gè)化合物確實(shí)是candicidin類化合物，分別為①candicidin A3；②candicidin D；③candicidin A1。

A：abmB1基因替換突變株的構(gòu)建示意圖；B：突變株abmB1的PCR驗(yàn)證圖，野生型2963 bp，突變株314 bp ，Marker:DL5000，W：以S.koyangensis SCSIO 5802野生型菌株基因組DNA為模板，M：以突變5802A基因組DNA為模板。圖1 abmB1-in基因替換突變株的構(gòu)建及驗(yàn)證

A：基因阻斷突變株的發(fā)酵產(chǎn)物HPLC檢測(cè)；B： candicidin的HPLC分析及各個(gè)峰的UV。圖2 基因阻斷突變株的發(fā)酵產(chǎn)物分析及 candicidin化合物鑒定

圖3 三個(gè)Candicidin類化合物的質(zhì)譜圖及對(duì)應(yīng)化學(xué)結(jié)構(gòu)

2.2S.koyangensisSCSIO 5802中 candicidin 生物合成基因簇的鑒定 通過在線數(shù)據(jù)庫anti-SMAH進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)S.koyangensisSCSIO 5802基因組中的20個(gè)連續(xù)的開放閱讀框(open reading frame,ORF)在蛋白水平上與已報(bào)道的Streptomycessp.FR-008中的candicidin化合物生物合成基因具有94%-99%的相似性，表明該20個(gè)基因組成的基因簇可能為candicidin的生物合成基因簇，根據(jù)已經(jīng)報(bào)道的文獻(xiàn)[16]，本文將該20個(gè)開放閱讀框進(jìn)行了逐一命名和功能注釋(見表2)。該基因簇中含有7個(gè)PKS相關(guān)基因(canA、canC、canB、canF、canE、canD和canTE)；4個(gè)調(diào)控基因(canR2、canR2、canR3和canR4)；2個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(canT1、canT2)；2個(gè)負(fù)責(zé)起始單元對(duì)氨基本乙酮合成相關(guān)酶(canPAB1和canPAB2)； 2個(gè)后修飾基因(P450氧化酶基因canP，氧化鐵蛋白基因canFE)；以及3個(gè)與糖基單元合成和轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因(糖基轉(zhuǎn)移酶canM1、氨基轉(zhuǎn)移酶canM2和脫水酶canM3)。20個(gè)開放閱讀框的組織排列方式見圖4A，基因功能注釋見表2。

表2S.koyangensisSCSIO 5802中candicidin生物合成基因的功能注釋

ORFSizeaProposed functionHomologous Genes Identity/%bcanPAB2257biosynthesis of starter unite p-aminobenzoic acidpabC94canR1231LuxR_family_transcriptional_regulatorfscRⅠ 95canR2960LuxR_family_transcriptional_regulator fscRⅡ96canR31011LuxR_family_transcriptional_regulatorfscRⅢ95canR4970LuxR_family_transcriptional_regulator fscRⅣ97canM1458Glycosyltransferase,_MGT_family fsc M199canM2352StrS_aminotransferasefscMⅡ99canP393CytochromeP450fscP99canFE64Ferredoxin fscFE98canTE256 Type II thioesterase fscTE98canPAB1723 biosynthesis of starter unite p-aminobenzoic acidPabAB97canA1742 AMP-dependent_synthetase_and_ligase,loading module and module 1 fscA95canT1335 ABCtransporterATP-binding_protein fscT I98canT2280 ABC-2typetransporter fscTⅡ97canC10627 Beta-ketoacylsynthase,modules 5-10fscC95can B5541 Beta-ketoacylsynthase,modules 2-4fscB97can F2049Beta-ketoacylsynthase,module 21 and TEfscF98canE7774Beta-ketoacylsynthase ,module 17-20 fscE97can D9546Beta-ketoacylsynthase,modules 11-16fscD97canM3344DAD-dependent/dehydratasfsc MⅢ99

a:蛋白質(zhì)大?。?b:ID是與同源基因的一致性/相似性；can：推斷的S.koyangensisSCSIO 5802中candicidin的生物合成基因簇；fsc：已報(bào)道的Streptomycessp.FR-008中candicidin/FR-008的生物合成基因簇。

2.3 化合物candicidin生物合成途徑的推導(dǎo) 根據(jù)基因簇中生物合成基因的功能注釋，結(jié)合candicidin的分子結(jié)構(gòu)和有機(jī)化學(xué)基本生物合成原理，對(duì)candicidin的生物合成途徑進(jìn)行了推導(dǎo)。該基因簇中共編碼6個(gè)PKS基因：canA、canC、canB、canF、canE、canD，共編碼1個(gè)起始模塊和21個(gè)延伸模塊，負(fù)責(zé)聚酮骨架結(jié)構(gòu)的合成和組裝。

CanA包含1個(gè)起始模塊(loading module)和1個(gè)延伸模塊(module 1)。根據(jù)candicidin的分子結(jié)構(gòu)，我們推導(dǎo)其聚酮骨架的組裝起始于1個(gè)對(duì)氨基苯乙酮分子的裝載(見圖4B)，而該分子的裝載則是由CanA中的裝載模塊負(fù)責(zé)的，錨定在起始模塊ACP結(jié)構(gòu)域上的對(duì)氨基苯乙酮分子，作為后續(xù)骨架分子組裝的起點(diǎn)，開始candicidin聚酮鏈的后續(xù)組裝過程。

接下來的聚酮鏈組裝過程大體可以分為以下幾6個(gè)階段(見圖4B)：①CanA編碼的模塊1于起始對(duì)氨基苯乙酮分子上延伸一個(gè)二碳單元；②CanB編碼模塊2-4，連續(xù)負(fù)責(zé)3個(gè)三碳結(jié)構(gòu)單元——2-甲基丙二酸單酰輔酶A進(jìn)行順序縮合；③canC編碼延伸模塊5-11，這7個(gè)模塊中均含有負(fù)責(zé)將β-酮基進(jìn)行還原的KR和DH結(jié)構(gòu)域，負(fù)責(zé)candicidin結(jié)構(gòu)中7個(gè)共軛雙鍵的組裝；④canD編碼延伸模塊12-16，除了模塊13識(shí)別三碳結(jié)構(gòu)單元——2-甲基丙二酸單酰輔酶A，剩下的4個(gè)模塊識(shí)別的底物則均為二碳結(jié)構(gòu)單元丙二酸單酰輔酶A；⑤canD編碼延伸模塊17-20，這4個(gè)模塊識(shí)別的底物均為二碳結(jié)構(gòu)單元——丙二酸單酰輔酶A，負(fù)責(zé)催化他們之間的順序縮合延伸；⑥canF編碼延伸模塊21和硫酯酶結(jié)構(gòu)域，除了負(fù)責(zé)一個(gè)二碳單元的延伸外，還負(fù)責(zé)催化聚酮鏈上C37-OH對(duì)錨定在模塊21的ACP結(jié)構(gòu)域上的硫酯鍵進(jìn)行親和攻擊，導(dǎo)致聚酮鏈環(huán)化解離，生成七烯大環(huán)內(nèi)脂骨架結(jié)構(gòu)。

生成的七烯大環(huán)內(nèi)脂骨架結(jié)構(gòu)可能在后修飾P450氧化酶CanP的催化下，將C18位的甲基氧化為羧基。此外，推責(zé)糖基轉(zhuǎn)移酶CanM1、氨基轉(zhuǎn)移酶CanM2和脫水酶CanM3負(fù)責(zé)C21上的糖基單元的合成和連接。經(jīng)過以上生物合成步驟后，最終生成candicidin類化合物。

A：S.koyangensis SCSIO 5802中candicidin 的生物合成基因組織排列方式；B：S.koyangensis SCSIO 5802中candicidin聚酮骨架的組裝過程。圖4 candicidin的生物合成基因簇和可能生物合成途徑

2.4S.koyangensisSCSIO 5802中candicidin生物合成基因簇的確認(rèn) 通過對(duì)基因簇中負(fù)責(zé)聚酮骨架合成的I型PKS基因canD進(jìn)行抗性替換突變，獲得canD的雙交換突變株△canD(命名為SCSIO 5802AC，見圖5)。將突變株SCSIO 5802AC與敲掉的abyssomicins生物合成聚酮合酶基因的同框敲除(inframe)突變株5802A同步對(duì)比發(fā)酵培養(yǎng)，利用HPLC對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)5802AC菌株不產(chǎn)candicidin類化合物(見圖6)，此結(jié)果證明該基因簇確實(shí)負(fù)責(zé)candicidin類化合物的生物合成。

A：candD基因替換突變株的構(gòu)建示意圖及預(yù)測(cè)的PCR片段長(zhǎng)度，野生型2016 bp，突變株1655bp；B：突變株candD的PCR驗(yàn)證圖；marker：DL5000，W：以S.koyangensis SCSIO 5802野生型菌株基因組DNA為模板，M：以突變株5802AC基因組DNA為模板。圖5 canD基因替換突變株的構(gòu)建及驗(yàn)證

圖6 基因阻斷突變株SCSIO 5802AC發(fā)酵產(chǎn)物的HPLC檢測(cè)

3 討論

多烯大環(huán)內(nèi)酯類化合物candicidin具有是一種抗真菌類的抗生素，具有除了出色的抗真菌活性外[17]，還對(duì)顯著的抗病毒[18]和抑制前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)活性[19]，具有廣闊的臨床藥物開發(fā)前景。但是，candicidins類抗生素因其水溶性差、毒性高等缺點(diǎn)，在臨床上大大限制了將其應(yīng)用于全身性的真菌感染治療，因此，各國研究者都致力于candicidin的生物合成途徑和基因工程改造研究，希望通過改變其生物合成途徑，獲取結(jié)構(gòu)類似物用于藥物的開發(fā)研究。海洋放線菌具有產(chǎn)生多種活性顯著、結(jié)構(gòu)新穎復(fù)雜的次級(jí)代謝產(chǎn)物的潛能，本研究對(duì)來源于我國南海深海沉積物的放線菌Stretomycessp.SCSIO 5802進(jìn)行定向遺傳改造，構(gòu)建了不生產(chǎn)abyssomicin類化合物的基因突變株Stretomycessp.SCSIO 5802A，阻斷了主要次級(jí)代謝產(chǎn)物abyssomicins的生產(chǎn)，達(dá)到了改變菌株的代謝流以增加微量次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成前體供應(yīng)的目的，從該突變株發(fā)酵液中成功鑒定了另一類多烯大環(huán)內(nèi)酯類化合物candicidin，并且鑒定了其生物合成基因簇，該基因簇與已經(jīng)報(bào)道的其它菌株中基因簇具有部分差異，同源基因在蛋白水平上具有95%～98%的相似性，為candicidins類化合物的途徑改造提供了信息基因資源，為通過組合生物合成技術(shù)對(duì)基因簇中的基因原件進(jìn)行改造或其它多烯大環(huán)內(nèi)酯類化合物的生物合成途徑進(jìn)行重組，獲得新結(jié)構(gòu)衍生物奠定了基礎(chǔ)。

此外，利用生物信息學(xué)對(duì)海洋放線菌Stretomycessp.SCSIO 5802進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，該菌株的基因組中存在至少21個(gè)負(fù)責(zé)天然產(chǎn)物的生物合成的基因簇，但目前我們僅從該菌株中鑒定了abyssomicins和candicidins這兩類化合物，其它生物合成基因簇還處于沉默或未激活狀態(tài)，因此，下一步我們擬利用本研究中獲得的candicidin的生物合成基因簇，在聚酮合酶abmB1的同框缺失突變株中繼續(xù)對(duì)負(fù)責(zé)candicidin聚酮骨架合成的canD基因進(jìn)行同框缺失突變，獲得的突變株將會(huì)喪失生產(chǎn)abyssomicin和candicidin類化合物的能力，使菌株的代謝背景更為干凈，在此基礎(chǔ)上，可以通過添加強(qiáng)啟動(dòng)子激活其他基因簇或改變發(fā)酵條件，將有助于其它結(jié)構(gòu)新型的天然產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)和鑒定。