偽狂犬病病毒變異株和經(jīng)典株對(duì)小鼠致病力差異的研究

王亞林，金 釗，祁寒松，仇華吉*，孫 元*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱150069；2.齊齊哈爾大學(xué) 生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾161006)

偽狂犬病(Pseudorabies)是由偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的多種家畜和野生動(dòng)物的一種傳染性疾病。PRV的感染譜非常廣，可以感染多種哺乳動(dòng)物以及嚙齒類動(dòng)物，PRV幾乎不感染人及高級(jí)靈長類動(dòng)物，但最近有人感染PRV的報(bào)道[1]。PRV的天然宿主是豬，仔豬感染PRV后通常表現(xiàn)出神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，發(fā)病率和死亡率可高達(dá)100%；成年豬感染僅表現(xiàn)輕微的臨床癥狀，如呼吸困難、沉郁、厭食等，通常在感染后3 d～4 d內(nèi)恢復(fù)；妊娠母豬感染后可導(dǎo)致流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎等。該病給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。近年來，美國及部分歐洲國家通過接種gE基因缺失疫苗配合相應(yīng)的鑒別診斷措施根除了偽狂犬病。從20世紀(jì)90年代至本世紀(jì)初，我國也通過疫苗接種有效控制了偽狂犬病。但在2011年末，我國大部分接種過Bartha株疫苗的豬場再次暴發(fā)了偽狂犬病，使養(yǎng)豬業(yè)再次受到重創(chuàng)[2]。

研究表明，Bartha-K61株疫苗不能對(duì)新的PRV流行株提供完全的免疫保護(hù)[3-5]。與PRV經(jīng)典株(PRVSC)相比，PRV變異株(PRVTJ)對(duì)小鼠和豬的致病力均增強(qiáng)。在鑒定的67個(gè)病毒蛋白中，PRVTJ的62個(gè)開放閱讀框均發(fā)生了變異，包括堿基的互換、插入和/或缺失[4]。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，PRVTJ與其它經(jīng)典PRV分離株(如Bartha株、Kaplan株及Becker株)屬于不同的分支。其大多數(shù)病毒蛋白出現(xiàn)了變異，包括糖蛋白gE、gB、gC、gD和gI，被膜蛋 白UL51、UL49、UL47、UL46、UL36、UL21、UL13和非結(jié)構(gòu)蛋白UL52、UL29、UL5和IE180等[4]。其中糖蛋白gE、gB、gC、gD及gI等均與病毒的毒力相關(guān)[6-8]。最新的研究通過將PRV經(jīng)典株和變異株的gE/gI等位基因互換，發(fā)現(xiàn)變異株gE和gI基因的變異是其致病力增強(qiáng)的原因之一[9]。導(dǎo)致PRV變異株致病力增強(qiáng)的機(jī)制可能還有其他原因，關(guān)于基因的變異如何使病毒的致病力增強(qiáng)，其致病力增強(qiáng)是否因病毒的組織嗜性和復(fù)制能力等變化所導(dǎo)致還需進(jìn)一步的系統(tǒng)研究。

雖然PRV的天然宿主是豬，但該病毒可以感染多種哺乳動(dòng)物以及嚙齒類動(dòng)物，包括犬、牛、綿羊、山羊、馬、大鼠和小鼠等[10-13]。PRV感染非天然宿主(如小鼠)后的臨床表現(xiàn)與感染豬的臨床表現(xiàn)存在很大差異，以典型的瘙癢為特征，病毒通常能夠侵入宿主的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，并導(dǎo)致其愈后不良[7]。嚙齒類動(dòng)物模型常用于PRV致病力評(píng)價(jià)及致病機(jī)制等方面的研究，包括大鼠眼球感染模型、小鼠皮膚感染模型以及小鼠肌肉和鼻腔感染模型[7,14]。PRV感染小鼠后表現(xiàn)嚴(yán)重的瘙癢癥狀，出現(xiàn)抓撓、撕咬感染部位等異常行為，之后發(fā)生急性死亡。小鼠背部皮膚感染PRV Becker株后，病毒可以在感染的皮膚、外周神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元以及脊髓中復(fù)制，但在其腦中檢測(cè)不到病毒[14]。

本研究以小鼠為模型，通過接種相同劑量的PRVTJ和PRVSC，從小鼠的臨床癥狀、體質(zhì)量變化、死亡率和各組織的病毒基因組拷貝數(shù)等多個(gè)方面對(duì)二者致病力進(jìn)行了系統(tǒng)的比較與分析，以期為PRV變異株致病力增強(qiáng)機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 PRVTJ、PRVSC株均由本實(shí)驗(yàn)室保存。6周齡健康BALB/c小鼠購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司。DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司；組織DNA提取試劑盒購自O(shè)mega公司。

1.2 熒光定量PCR(qPCR)引物與探針的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中PRVTJ株的基因序列(KJ789182.1)，應(yīng)用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物。引物PRV-F(5'-GCCGAGTACCTCTGCC-3')和PRV-R(5'-C GAGACGAACAGCAGCCG-3')用于擴(kuò)增PRVTJ和PRVSC基因組中的gI基因。檢測(cè)PRV變異株和經(jīng)典株的TaqMan探針序列分別為：HEX-PRV-Var(HEX-5'-CCGCGTGCACCACGAAGCCT-3'-BHQ1)和FAM-PRV-Cla(FAM-5'-CGCGTGCACCACGAGGCCT T-3'-BHQ1)[15]。引物和探針均由Invitrogen公司合成。

1.3 小鼠的感染試驗(yàn) 取15只6周齡健康BALB/c小鼠，隨機(jī)分成3組(n=5)，前2組分別經(jīng)肌肉注射途徑接種PRVTJ和PRVSC株，接種劑量為103TCID50/100 μL，第3組接種100 μL DMEM作為陰性對(duì)照。接種前記錄小鼠的體質(zhì)量，接種后每天觀察小鼠的臨床癥狀并記錄小鼠的體質(zhì)量。接種病毒后第7 d，記錄所有存活小鼠的體質(zhì)量并計(jì)算小鼠的死亡率，迫殺存活小鼠無菌采集其心、肝、脾、肺、腎和腦等組織樣品，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 小鼠的臨床癥狀評(píng)分 接種病毒后，每天觀察小鼠的臨床反應(yīng)，參考文獻(xiàn)中的細(xì)則計(jì)分[16]，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)共4項(xiàng)：是否有抓咬注射部位、被毛是否凌亂不整、精神是否沉郁、是否有狂躁、轉(zhuǎn)圈等異常行為。不表現(xiàn)癥狀計(jì)0分，癥狀輕微計(jì)1分，癥狀嚴(yán)重計(jì)2分，癥狀極嚴(yán)重計(jì)3分。

1.5 小鼠組織中病毒基因組的檢測(cè) 取100 mg各組小鼠各組織樣品置2 mL離心管中，加入滅菌鋼珠和1mLDMEM培養(yǎng)基，利用組織研磨儀研磨20min，然后利用組織DNA提取試劑盒提取病毒DNA，具體操作參考說明書進(jìn)行。提取的組織樣品DNA按照參考文獻(xiàn)[15]經(jīng)qPCR檢測(cè)病毒基因組拷貝數(shù)。

1.6 小鼠各組織病理學(xué)觀察 將小鼠各組織樣品經(jīng)福爾馬林固定，然后用石蠟包埋脫水透明，將蠟塊用切片機(jī)切成厚度為4 μm的切片，常規(guī)脫蠟和H-E染色，經(jīng)光學(xué)顯微鏡觀察各組織的病理學(xué)變化。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用Excel分析各組數(shù)據(jù)之間的差異水平，采用非配對(duì)的雙尾t檢驗(yàn)分析差異顯著性。其中，p≥0.05為差異不顯著；p<0.05為差異顯著，p<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 感染PRV后小鼠的體質(zhì)量變化和死亡情況小鼠接種不同的PRV株后，記錄小鼠的體質(zhì)量變化和死亡率，來評(píng)價(jià)不同病毒株的致病力。結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組相比，接種PRVTJ的小鼠在接種后第2 d體質(zhì)量顯著下降(p<0.05)，在接種后第3 d體質(zhì)量下降極顯著(p<0.01)，而接種PRVSC的小鼠的體質(zhì)量與對(duì)照組相比無顯著變化(圖1A)。接種PRVTJ小鼠的死亡率高于接種PRVSC小鼠的死亡率，對(duì)照組小鼠無死亡(圖1B)。這些數(shù)據(jù)均表明，PRVTJ對(duì)于小鼠的致病力要強(qiáng)于PRVSC。

2.2 感染PRV后小鼠的臨床癥狀觀察 接種病毒后每天觀察小鼠的臨床癥狀，并根據(jù)臨床癥狀評(píng)分細(xì)則評(píng)分。結(jié)果顯示，接種PRVTJ的小鼠在第3 d開始表現(xiàn)臨床癥狀：嚴(yán)重的瘙癢、抓咬注射部位、被毛凌亂無光澤，驚擾時(shí)狂躁、轉(zhuǎn)圈等神經(jīng)癥狀。有的小鼠在感染后3 d～4 d出現(xiàn)死亡。小鼠癥狀在感染后4 d～5 d表現(xiàn)最為嚴(yán)重，之后逐漸減輕。陰性對(duì)照小鼠不表現(xiàn)任何臨床癥狀。各組小鼠的臨床癥狀評(píng)分如表1所示。接種PRVSC的小鼠與接種PRVTJ的小鼠在臨床表現(xiàn)上無顯著差異。

2.3 感染PRV后小鼠各組織中病毒分布的檢測(cè)結(jié)果 將各組小鼠各組織樣品研磨后提取其總DNA，利用qPCR檢測(cè)病毒基因的拷貝數(shù)。結(jié)果顯示，在接種PRVTJ小鼠的肝、肺、腎和腦組織中均檢測(cè)到了病毒基因。其中有4只小鼠的腦組織中檢測(cè)到了病毒基因，2只小鼠的腎組織、1只小鼠的肝組織、1只小鼠的脾臟中檢測(cè)到了病毒基因。其中腦組織中病毒基因的拷貝數(shù)較高，平均值約為104數(shù)量級(jí)。而接種PRVSC的小鼠僅在1只死亡小鼠的腎臟中檢測(cè)到了病毒基因組。對(duì)照組小鼠的組織中未檢測(cè)到病毒基因(圖2)。這些數(shù)據(jù)表明，與PRVSC相比，PRVTJ對(duì)小鼠的組織嗜性明顯增強(qiáng)，特別是對(duì)其中樞神經(jīng)系統(tǒng)的嗜性明顯增強(qiáng)。

圖1 感染PRV不同病毒株后小鼠的體質(zhì)量變化(A)和死亡率(B)Fig.1 Body weight changes(A)and survival rate(B)of the mice infected with PRVs

表1 感染不同的PRV病毒株后小鼠的臨床癥狀評(píng)分Table 1 Clinical scores in mice infected with PRVs

2.4 小鼠組織的病理學(xué)變化 將接種PRV后各組小鼠各組織用福爾馬林固定，H-E染色后進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。結(jié)果可見，接種PRVTJ的小鼠腦組織中皮質(zhì)區(qū)有明顯的膠質(zhì)細(xì)胞增生、部分神經(jīng)元細(xì)胞變性壞死，腎小管上皮細(xì)胞空泡變性、部分壞死，肺臟小血管擴(kuò)張淤血、局部肺泡膈增寬(圖3，箭頭指示有明顯病理變化的部位)。而接種PRVSC的小鼠腦組織無明顯病變，僅1只死亡小鼠的腎組織有少量的散在出血。對(duì)照組小鼠的心、肝、脾等組織無明顯的組織病理學(xué)變化。表明PRVTJ比PRVSC更易引起組織的病理學(xué)變化，尤其對(duì)腦組織的嗜性比PRVSC更強(qiáng)。

圖3 接種PRV后小鼠不同組織中的病理學(xué)變化Fig.3 Histopathological changes in diverse tissues of mice infected with PRVs

3 討論

2011年，我國多數(shù)接種Bartha-K61株疫苗的豬場暴發(fā)了偽狂犬病新疫情。研究表明，新的PRV流行株在多個(gè)基因位點(diǎn)發(fā)生了抗原變異，變異株與經(jīng)典株屬于不同的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分支，且Bartha株疫苗不能對(duì)變異株的攻擊提供完全抵抗[4-5,17-18]。PRV變異株的流行給中國養(yǎng)豬業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失，據(jù)統(tǒng)計(jì)，僅河南省某一豬場就有2600頭新生仔豬和200頭母豬死于新流行的偽狂犬病，造成直接經(jīng)濟(jì)損失達(dá)100萬元[2]。攻毒試驗(yàn)表明，變異株P(guān)RVTJ對(duì)小鼠和豬的致病力均增強(qiáng)[4]。與經(jīng)典株P(guān)RVSC相比，變異株P(guān)RVTJ編碼的67個(gè)蛋白中有62個(gè)發(fā)生了變異，包括堿基的替換、插入或缺失等。與病毒毒力相關(guān)的多個(gè)蛋白，如gE、gB和gC等糖蛋白均發(fā)生了變異[4]。但目前關(guān)于PRV變異株致病力增強(qiáng)的詳細(xì)機(jī)制還不清楚。本研究將小鼠分別接種103TCID50的PRVTJ和PRVSC，通過小鼠的臨床表現(xiàn)、體質(zhì)量變化、死亡率、各組織中的病毒分布以及組織的病理學(xué)變化等各方面對(duì)PRVTJ和PRVSC的致病力差異進(jìn)行了初步研究。結(jié)果表明，PRVTJ對(duì)小鼠的組織嗜性明顯增強(qiáng)，特別是對(duì)腦組織的嗜性，且能夠引起多組織臟器的炎癥性病變。本研究為PRV變異株致病力增強(qiáng)的機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。

對(duì)于天然宿主豬，PRV通常由其口鼻黏膜侵入，在其扁桃體、口咽黏膜復(fù)制，經(jīng)支配上皮組織的神經(jīng)末梢侵入神經(jīng)系統(tǒng)，到達(dá)三叉神經(jīng)節(jié)和脊髓，并在此建立長期的潛伏感染，極少侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)[19]。而對(duì)于非天然宿主，PRV的感染通常是致死性的，引起嚴(yán)重的瘙癢并最終導(dǎo)致急性死亡，長期以來，人們認(rèn)為這種死因是病毒性腦炎，而最近的研究結(jié)果顯示，這種急性死亡是由免疫系統(tǒng)應(yīng)答引起的急性炎癥導(dǎo)致的[16]。在前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)中本研究室初步比較了不同接種途徑(肌肉、皮下和腹腔注射)和不同接種劑量(102TCID50、103TCID50、104TCID50和105TCID50)對(duì)小鼠的致病性情況，結(jié)果顯示經(jīng)肌肉接種途徑時(shí)，兩種病毒株對(duì)小鼠的致病力差異明顯(數(shù)據(jù)未顯示)；小鼠感染較高劑量(大于103TCID50)的PRV后，通常在感染后2 d～3 d內(nèi)發(fā)生急性死亡，不便于對(duì)其臨床表現(xiàn)的觀察以及系統(tǒng)的組織病理學(xué)方面的比較。因此，本研究采用較低劑量(103TCID50)和肌肉接種途徑研究不同PRV株的致病力差異。結(jié)果顯示，小鼠感染103TCID50PRVSC后，于第3 d發(fā)現(xiàn)明顯的臨床癥狀，表現(xiàn)嚴(yán)重的瘙癢，有狂躁、轉(zhuǎn)圈等神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，但qPCR在腦組織沒有檢測(cè)到病毒基因，這與PRV Becker株感染的結(jié)果相似[14,16]。表明PRVSC引起急性死亡的原因確實(shí)是由免疫系統(tǒng)應(yīng)答引起的急性炎癥導(dǎo)致的，而并非病毒性腦炎。感染PRVTJ的小鼠也會(huì)在感染后3 d出現(xiàn)相同的癥狀，但小鼠的死亡率和體質(zhì)量變化均顯示，PRVTJ的致病力更強(qiáng)。qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，3只小鼠的腦組織中病毒基因拷貝數(shù)很高。小鼠接種103TCID50PRVTJ后，其腦皮質(zhì)區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞明顯增生，并有部分神經(jīng)元細(xì)胞的變性壞死，但接種PRVSC的小鼠不表現(xiàn)腦部的炎癥性病變，僅1只死亡小鼠的腎臟有散在出血，這與qPCR的檢測(cè)結(jié)果一致。膠質(zhì)細(xì)胞屬于單核/巨噬細(xì)胞譜系，是腦組織中定居的吞噬細(xì)胞和專職抗原提呈細(xì)胞，在炎癥反應(yīng)和宿主防御中起關(guān)鍵作用[20]。本研究表明，低劑量的PRVTJ感染即可誘導(dǎo)小鼠腦組織中小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖和活化，而感染PRVSC的小鼠腦組織中并沒有相似的炎癥性病變。因此，推測(cè)PRVTJ對(duì)小鼠的致死是由急性炎癥和致死性腦炎共同作用的結(jié)果。而且，在小鼠死亡之前，PRVTJ能更快的侵入小鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，表明其對(duì)小鼠的神經(jīng)嗜性明顯增強(qiáng)。關(guān)于這些現(xiàn)象中相關(guān)的分子機(jī)制，還有待進(jìn)一步研究。本研究為PRV變異株致病力增強(qiáng)的分子機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)，也為進(jìn)一步預(yù)防、控制偽狂犬病疫情提供一定的參考依據(jù)。